凡納濱對蝦熱風干制過程中內源性三甲胺的形成規律研究

唐振冬,吉宏武,2*,張迪*,劉書成,2,蘇偉明,宋文奎

1(廣東海洋大學 食品科技學院,廣東省水產品加工與安全重點實驗室,廣東省海洋生物制品工程實驗室,廣東省海洋食品工程技術研究中心,水產品深加工廣東普通高等學校重點實驗室,廣東 湛江,524088)2(海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,大連工業大學,遼寧 大連,116034)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是當今世界養殖產量最高的三大蝦種之一,也是我國對蝦養殖中的主要經濟種類。目前,新鮮對蝦一般采用新鮮售賣、冷凍運輸、干制運輸等方式進行流通,其中熱風干制是一種重要的加工方式,方便運輸同時可在室溫下長期貯藏[1]。然而,對蝦在熱風干制過程中易產生三甲胺(trimethylamine, TMA)等強烈刺激性物質,影響產品感官品質的同時,導致蝦類干制品潛在的不安全性。TMA是一種具有腥臭味揮發性含氮物質,它被認為是蝦干制品的關鍵特征香氣成分之一[2],在熱風干制各階段皆可檢出[3]。胺類化合物主要來源于蛋白質、游離氨基酸和核苷酸的降解,而干制過程TMA的產生被認為是氧化三甲胺(trimetlylamine oxide, TMAO)高溫非酶分解引起[4-6],凡納濱對蝦熱風干制過程中TMA的形成機制鮮見報道。

TMA具有魚腥臭味,是判定海產品新鮮程度的標準之一[7]。國內外研究發現,TMA是一種具有安全風險的胺類化合物,它與非傳染性疾病的發病機制有關,包括動脈粥樣硬化、癌癥和糖尿病等[8-9]。頭足類與甲殼類水產動物中均含有高濃度的TMAO,且頭足類動物TMAO濃度約為甲殼類的10倍,但蝦蟹等甲殼類動物干制過程TMA的產生情況更為嚴重[10]。在水產干制品不同加工階段中,TMA含量顯著上升,欲抑制或解決腥味物質的產生既是技術問題,更是毒理學問題[11]。近年來,研究者主要對TMAO在高溫熱分解生成FA的機制和抑制TMAO的高溫熱分解來控制甲醛的增長展開分析。例如,郭芮等[12]對南美白對蝦的TMAO熱分解產生甲醛(formaldehyde,FA)進行研究。LI等[13]利用藍莓葉中酚類化合物來抑制TMAO熱分解,使得TMA、二甲胺(dimethylamine,DMA)和FA的含量顯著降低。對蝦熱風干燥過程中存在蛋白質降解、美拉德反應、脂質氧化和蝦青素降解等多方面復雜因素,導致體系中總還原力和pH值也隨之發生變化[1],促進內源性TMA的形成。因此,明確三甲胺的形成條件和規律,對解析凡納濱對蝦在熱風干制過程中的形成機制具有重要意義。

本研究通過監測對蝦熱風干制過程中TMA的形成規律、跟蹤其主要前體物質TMAO和伴生化合物如FA和DMA的含量變化,以TVB-N值為參考指標,探討加熱時間與加熱溫度對TMA形成特性的影響,進一步從加熱時間、加熱溫度和pH值等條件探究了對蝦上清液中形成TMA的關鍵因素,以期為水產干制品中TMA的產生、安全限量標準的制定和控制技術提供一些理論基礎和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活凡納濱對蝦,湛江市霞山水產品批發市場,平均體長(13.5±0.5) cm,平均體重(14.0±0.5) g。甲苯和苦味酸,廣州化學試劑廠;TiCl3,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;冰乙酸、三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)、甲醛、無水Na2SO4,西隴科學股份有限公司;三羥甲基氨基甲烷、CH3COONa和KOH,上海麥克林生化科技有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器和設備

DHG-9023A鼓風干燥箱,上海合恒儀器設備有限公司;Cary 60 UV-Vis紫外可見分光光度計,美國Agilent公司;Varioskan Flas全自動酶標儀、Thermo Lynx6000高速落地離心機,美國Thermo Fisher Scientific公司;BSA224S-CW萬分之一天平,德國Sartorius公司;Vap450全自動凱氏定氮儀,德國Gerhardt公司;PHS-3E pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;HX204水分測定儀,瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 蝦干樣品制備[14]

不同干制溫度:鮮活凡納濱對蝦經蒸餾水清洗后,沸水漂燙3 min,用濾紙擦干表面水分,分別置于65、75、85、95、105 ℃的鼓風干燥箱,風速為1 m/s,干燥量約1 000 g,干制至蝦干水分含量約20%,測定TMA、TMAO、FA和DMA的含量。

不同干制時間:將漂燙后的凡納濱對蝦置于(85±1) ℃,風速為1 m/s,干燥量約1 000 g,分別于0、1、2、3、4、5、6、7、8 h取樣,測定TMA、TMAO、FA和DMA的含量。

1.3.2 水分含量測定

將蝦干用萬能破碎機絞碎為蝦粉,取1.0 g樣品置于水分測定儀測定。

1.3.3 TVB-N值測定

參考GB 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》,采用全自動凱氏定氮儀法。

1.3.4 pH值測定

取5.0 g蝦粉加入50 mL蒸餾水,均質2 min,用pH計測定。

1.3.5 總還原力測定[15]

取5.0 g樣品與50 mL水混勻,離心過濾。取1 mL濾液依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)、1 mL 1% K3[Fe(CN)6]溶液,50 ℃水浴20 min,迅速冷卻,再加1 mL 10%TCA,振蕩混勻,3 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液加入1 mL蒸餾水、0.2 mL 質量分數0.1% FeCl3溶液,混勻,室溫靜置10 min,700 nm測吸光度。吸光度值代表還原力大小。

1.3.6 TMA、TMAO、FA和DMA的含量測定

稱取5.0 g蝦粉加入15 mL質量分數5%TCA,10 000 r/min均質1 min,4 ℃下8 000 r/min離心10 min后,沉淀進一步用15 mL質量分數5%TCA提取,離心,合并上清液,過濾后定容到30 mL,分別測定TMA、TMAO、FA和DMA。

1.3.6.1 TMA含量測定

參考李穎暢等[16]的方法并進行改進。取2 mL上清溶液,依次加入0.5 mL甲醛、4 mL無水甲苯、1.5 mL質量分數25%KOH,旋渦振蕩2 min,靜置5 min,取甲苯層經無水Na2SO4脫水后,取2 mL脫水甲苯層,加入2 mL質量分數0.02%苦味酸甲苯溶液,在410 nm下測定吸光度,以無水甲苯做空白。

1.3.6.2 TMAO含量測定

取2 mL上清溶液,實驗組加入0.25 mL質量分數1% TiCl3溶液,對照組加入0.25 mL蒸餾水,80 ℃水浴2 min后,迅速冰水冷卻,依據1.3.6.1節測定TMA含量。在410 nm下測定吸光度A1(經TiCl3還原后TMA含量),A2(高溫降解產生的TMA含量),TMAO含量為A1-A2。

1.3.6.3 FA含量測定

參考朱軍莉等[17]的方法并進行改進。取2 mL上清液加入Nash試劑0.4 mL,混合均勻,60 ℃水浴10 min,冷卻后413 nm下測吸光度。

1.3.6.4 DMA含量測定

參考靳肖等[18]的方法,略有改動,吸取反應液2 mL加入0.4 mL銅氨試劑,混合1 min,再加入4 mL體積分數5%二硫化碳-甲苯溶液,50 ℃水浴2 min,混合1 min,迅速加入0.4 mL體積分數30%醋酸溶液,混合2 min,渦旋振蕩至甲苯層澄清,用0.2 g無水Na2SO4進行甲苯層脫水,在440 nm下測定吸光度。

1.3.7 TMA形成體系建立

凡納濱對蝦漂燙后,絞碎,取10.0 g蝦肉加25 mL溶液(20 mmol/L Tris-乙酸,0.1 mol/L NaCl,pH 7.0)混合,10 000 r/min均質1 min,9 000 r/min離心15 min,分別測定蝦肉、沉淀和上清液在100 ℃反應1 h前后的TMA和TMAO的含量。

1.3.8 蝦肉提取液TMA形成特性研究

1.3.8.1 加熱時間對蝦肉提取液TMA形成的影響

取1.3.7節提取的上清液分別在100 ℃反應0、15、30、45、60、75、90 min,冰水冷卻,測定TMA和TMAO的含量。

1.3.8.2 加熱溫度對蝦肉提取液TMA形成的影響

取1.3.7節提取的上清液分別在60、70、80、90、100 ℃反應1 h,冰水冷卻,測定TMA和TMAO的含量。

1.3.8.3 pH值對蝦肉提取液TMA形成的影響

分別用pH值3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的緩沖液提取蝦肉,各上清液在100 ℃反應1 h,冰水冷卻,測定TMA和TMAO的含量。

1.4 數據處理

以上實驗均作3個平行試驗,結果用“平均值±標準差”表示。使用SPSS 26.0中ANOVA檢驗的Waller-Duncan假定等方差檢驗顯著性差異(P<0.05),同時使用Origin 2022b進行繪圖。

2 結果分析

2.1 干制溫度對凡納濱對蝦中TMA、TMAO、DMA和FA含量的影響

不同熱風干制溫度制備的蝦干樣品揮發性成分存在差異,溫度越高產生的揮發性物質種類越多[14]。如圖1所示,熱風干制的溫度升高,TMAO高溫非酶分解程度變大,TMA、FA和DMA等含量均表現為明顯上升。在65 ℃時,TMA與DMA含量相近,當熱風溫度大于65 ℃后,產生的TMA含量明顯高于DMA和FA。其中,當熱風溫度為105 ℃時,TMAO分解量從955.51 mg/kg顯著降至476.60 mg/kg (P<0.01),TMA含量從29.37 mg/kg顯著增長至336.79 mg/kg (P<0.01)。加熱溫度越高,TMAO高溫分解程度越大,表明TMAO分解的溫度依賴性[12]。然而,TMAO標準品熱分解溫度達220 ℃,高溫下較為穩定,不易分解[17, 19]。而在熱風溫度為65～105 ℃時,蝦中TMAO可分解產生TMA,推測蝦肉體系中存在一定促進物質,使得TMAO在100 ℃附近發生降解。朱軍莉等[17]證明Fe2+可通過降低TMAO的活化能,促進其在低于沸點溫度下分解。因此,推測蝦肉中含有TMAO非酶熱分解的促進因子,使得TMAO隨著溫度升高而快速降解。

2.2 干制時間對凡納濱對蝦中TMA、TMAO、DMA和FA含量的影響

TMAO在高溫非酶條件下可分解產生TMA、FA和DMA等物質。如圖2所示,隨著干制時間的增加,TMAO從開始的955.51 mg/kg降至313.55 mg/kg,在干制后期呈現為顯著降低(P<0.01)。TMA、FA和DMA等含量均表現為逐漸上升趨勢,其中TMA在干制后期從開始的29.36 mg/kg顯著上升至565.11 mg/kg (P<0.01),在3種產物中含量最大。在干制前5 h,TMAO表現為緩慢下降趨勢,TMA、FA和DMA等含量表現相似增長趨勢。而在干制5 h后,TMAO含量發生急劇下降趨勢,同時TMA含量表明為快速上升趨勢,但FA與DMA含量上升趨勢變化不大。說明干制后期受蝦肉反應體系如美拉德反應產生還原性物質的影響下,促進了TMAO的非酶分解,且主要產物為TMA[20]。HU等[4]表明對蝦干燥過程中TMA含量顯著增加,并在干燥后期4 h時達到最大濃度121.88 ng/g,認為干燥過程可以促進TMAO的分解,從而導致形成高濃度的TMA。ZHANG等[3]在不同部位蝦干制備中發現干制各階段均可檢測到TMA生成?？偟膩碚f,熱風干制過程產生高含量的TMA備受關注,而對其具體產生機制鮮見報道。

圖2 凡納濱對蝦在85 ℃熱風干制過程TMA、DMA、FA和TMAO含量變化圖(結果以干基計)Fig.2 Effect of different hot-air-drying times on the content of TMA, DMA, FA and TMAO in shrimps from L. vannamei at 85 ℃ (results in dry basis)

圖3 凡納濱對蝦在85 ℃熱風干制過程TVB-N值變化圖Fig.3 The change of TVB-N value during hot-air-drying of L. vannamei at 85 ℃

2.3 熱風干制過程對蝦的TVB-N值變化

TVB-N是水產品變質的常用評估指標,蛋白質在內源性蛋白酶的分解代謝下,被降解成小分子肽和氨基酸[21],并產生大量的揮發性氨和生物胺,導致TVB-N含量顯著增加[22]。熱風干制過程TVB-N值變化結果見圖1。隨著干制時間的增加,TVB-N值含量呈現顯著上升趨勢(P<0.01),主要說明了蛋白質熱分解產生氨和三甲胺等胺類物質含量的變化。在干制前期,TVB-N變化并不明顯,隨著對蝦干制后期隨著TMA的產生,使得其TVB-N值不斷變大,而在干制時間為8 h時,TVB-N值高達40.52 mg/100 g。值得注意的是,這區別于因微生物和酶的腐敗變質,胺類物質的產生對產品的感官和安全造成一定威脅[23]。WANG等[24]發現隨著干燥時間的增加,青魚干制品的TVB-N含量顯著增加,但未超過變質值。在干制后期,蝦干制品產生大量TMA引起TVB-N值含量變大應受到重視,對其進一步研究是非常必要的。

2.4 熱風干制過程對蝦的pH值變化情況

pH值對反應速率有較大的影響,在堿性條件下有利于TMAO的熱分解[19]。熱風干制過程pH值含量變化結果如圖4所示,pH整體呈現下降趨勢。在熱風干制過程,對蝦蛋白質結構變化,生成堿性物質。同時,在干制過程蝦肉中蛋白質熱降解、氨基酸與還原糖的美拉德反應和脂肪酸熱降解等多種復雜反應,改變了蝦肉酸堿性,造成體系pH發生明顯變化。隨著干制時間的增加,pH值呈現先上升后下降趨勢(P<0.05),在干制后期,pH值約為8.0左右,有利于美拉德反應的產生,產生美拉德中間產物具有一定還原力,可促進了TMAO熱分解[16]。

圖4 凡納濱對蝦在85 ℃熱風干制過程pH值變化圖Fig.4 The change of pH value during hot-air-drying of L. vannamei at 85 ℃

2.5 熱風干制過程對蝦的總還原力變化情況

物質自身的抗氧化能力與還原性質有關,總還原力可以表示抗氧化能力的強弱。熱風干制過程對蝦的總還原力變化見圖5,隨干制時間的增長,蝦肉中美拉德反應的影響,造成總還原力顯著增大(P<0.05)。TMAO還原產生TMA,需要一定還原條件,而總還原力的上升,間接說明在干制后期TMAO熱分解的可能性。有別于頭足類動物,凡納濱對蝦含有蝦青素,其對DPPH自由基、·OH和ABTS陽離子自由基有較高的清除能力,且隨著加熱時間的延長,蝦青素對DPPH自由基的清除能力逐漸增強[25]。DONG等[15]通過添加茶多酚可抑制TMAO轉化為FA和DMA,認為茶多酚與魷魚干產品中自由基清除劑的高能力有關。陳帥等[20]認為還原性糖類物質如乳糖對TMAO的熱分解具有促進作用。因此,推測干制過程總還原力的變化對TMAO的熱分解起到重要作用。

圖5 凡納濱對蝦85 ℃干制過程總還原力變化圖Fig.5 The change of total reducing power during the drying process of L. vannamei at 85 ℃

a-溫度;b-時間;c-pH圖6 凡納濱對蝦上清液不同反應時間、溫度和pH條件下TMAO熱分解產生TMA含量變化圖Fig.6 Change of TMA content of thermal decomposition of TMAO under different reaction time, temperature, and pH conditions of shrimp extract from L. vannamei

2.6 蝦上清液在不同反應條件下TMA、TMAO含量的影響

2.6.1 建立TMA形成的模擬體系

為進一步探究TMA形成特性,將對蝦進行分離提取,分別測定了蝦肉,沉淀物與上清液產生TMA的特性,結果見表1。蝦肉整體表現為TMAO熱分解產生TMA,在反應后產生了TMA。因TMAO易溶于水,幾乎被提取在上清液,沉淀部分顯示僅存在少部分TMAO[13]。上清液中TMAO與TMA反應前后含量變化與蝦肉相一致,而TMAO沸點約220 ℃,需在一定還原條件下才可產生TMA,說明上清液含有促進TMAO分解產生TMA的還原促進物質,與前面研究一致。ZHANG等[19]表明隨著加熱時間的增加,魷魚勻漿液和上清液中的TMAO均有不同程度的降解,證實了魷魚上清液和勻漿液中含有促進TMAO熱分解的還原成分或離子。陳帥等[20]從熱分解動力學角度研究還原糖添加促進溶液中美拉德反應從而加速TMAO分解。這為后續研究TMA的形成提供良好的模擬體系。

表1 不同處理樣品類型在100 ℃反應1 h前后TMA與TMAO含量變化表 單位:mg/kgTable 1 Content of TMA and TMAO before and after 1 h reaction at 100 ℃ for different treatment sample types

2.6.2 加熱時間、加熱溫度和pH值對凡納濱對蝦上清液中TMAO熱分解的影響

對蝦肉提取液中TMA的形成特性進一步研究,觀察提取液在3種不同條件下產生TMA的情況。結果表明,隨著反應時間的增長和反應溫度的升高,內源性TMA產生量越大,且主要由TMAO分解產生,與熱風干制過程TMA形成特性相一致。ZHU等[26]表明自由基的形成增加取決于加熱溫度。值得注意的是,在不同pH條件下,TMAO熱分解存在一定差異,酸性條件有利于抑制TMA生成和TMAO熱分解,其中當反應pH=8.0時,TMAO降解程度最大,TMA產生最多,這與蝦干制作后期pH較為相近,間接說明了干制后期蝦干內源性TMA累積量越來越大的原因。研究者發現當溫度90～130 ℃時TMAO熱分解增強,產生大量TMA、DMA和FA,但通過抑制自由基來抑制甲醛的形成[27]。楊美竹等[28]證明加熱時間越長,魷魚上清液中的TMAO分解速度越快,相應的FA、DMA和TMA生成量越多。蝦肉中蛋白質含量較高,熱加工過程中易發生蛋白質熱降解、脂質氧化、美拉德反應等一系列化學反應。隨著熱加工過程蛋白質結構的改變和氨基酸組成的變化[29],對TMAO的非酶熱分解有重要作用,使得TMAO快速分解產生TMA。熱加工過程中體系蛋白質或氨基酸等物質的變化,能更好地解釋TMAO熱分解的溫度依賴性,而關于其影響TMA形成的機制有待進一步研究。

3 結論

熱風干制溫度越高,凡納濱對蝦產生TMA的含量越大。隨著熱風干制時間增長,凡納濱對蝦水分含量減少,TVB-N值增加,pH值在反應后期變為8.0左右,蛋白質氧化和美拉德反應產物作用導致總還原力值增大,蝦干中TMAO高溫非酶分解產生TMA、DMA和FA,且干制后期TMA最大達到565.11 mg/kg,并進一步探究了TMA形成體系,發現體系中上清液TMA的形成特性與蝦干一致。本研究為蝦干生產加工過程中TMA控制提供科學基礎,對TMA具體形成機制有待進一步研究。