枯草芽孢桿菌降解油茶餅中茶皂素及成分變化

羅彥玉,王磊,鄒春霞,賈玉龍

(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550000)

油茶餅是油茶籽榨油后的副產物,茶油的普及造成其產量增加,在中國每年約產生1 000萬t[1]。油茶餅含有豐富的蛋白質、多糖和多酚[2],具有很高的經濟價值,是潛在的飼料資源。但其因含茶皂素、單寧,會呈現苦、澀味,有刺激性,會影響動物吸收導致飼用價值低[3]。目前關于油茶餅的研究主要是通過溶劑提取酚類、多糖、茶皂素等開發其特性價值,從而實現油茶油工業廢棄物的再利用[4-6]。但這對油茶餅的整體利用率極低,耗費溶劑、造成原料營養流失的同時,濾渣也會造成環境污染,于是實現其資源利用最大化應從降解茶皂素的角度出發。

微生物發酵法是目前最為常見的方法,已有研究證明芽孢桿菌屬、乳桿菌屬、檸檬酸桿菌屬等含皂素降解酶,對茶皂素有降解效果[3, 7-8],其中芽孢桿菌的發酵效果良好[9]。CHANG 等[10]用混合培養的枯草芽孢桿菌和黑曲霉固態發酵降解油茶粕中茶皂素,最佳條件發酵4 d降解率為(67.84±0.23)%。黃浦等[11]用地衣芽孢桿菌與銅綠假單胞菌混合發酵降解茶皂素,優化后發酵12.8 d降解率達到(73.76±0.63)%。研究表明,用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌進行液態發酵,最優條件下茶皂素降解率均低于70%[12-13]。鑒于此,本研究旨在研究單菌降解效果更好、發酵時間更短、操作更簡便的固態發酵油茶餅的最優條件。

考慮到枯草芽孢桿菌有顯著的益生菌潛力[14],會加快腸道對營養物質的吸收、抑制有害菌種及促進禽畜生長等[15-16],故本研究通過單因素、響應面試驗優化降解茶皂素的發酵條件,并對比此時發酵終點各物質含量。一是有助于發酵期間菌株良好生長,以達到所需目的,提高茶皂素降解率和降低能耗對于工業生產具有重要意義;二是綜合評價最優條件下其營養物質變化規律,為我國油茶餅綜合利用提供實際參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油茶餅,貴州恒生源有限公司;枯草芽孢桿菌,自然發酵的油茶餅中篩選所得,菌株保藏編號CCTCCM 2022623。營養瓊脂(去除瓊脂則為營養肉湯)、茶皂素標品(≥98%),貴州慕為美生物有限公司;無水乙醇、NaCl、香草醛、Na2CO3、HCl、福林酚、AlCl3等化學試劑為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Spectra Max190型光吸收酶標儀,美谷分子儀器有限公司;H2-16KR型冷凍離心機,湖南可成儀器設備有限公司;L-8800氨基酸自動分析儀,日立公司;SCIENTZ-18 N 型冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司;JK9870型全自動凱氏定氮儀,上海儀電分析儀器有限公司;BSA224S分析天平,北京賽多利斯儀器系統有限公司;HH-6恒溫水浴鍋,江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子液制備

1.3.2 樣品前處理

油茶餅干燥粉碎,40目篩,按比例與水拌勻,121 ℃滅菌20 min。

1.3.3 茶皂素含量測定

參照田漫漫等[17]的方法提取茶皂素;用香草醛-硫酸顯色法[3]測定茶皂素含量,稍作改動:0.5 mL提取液加0.5 mL 8%香蘭素-乙醇溶液,置冰水浴加4 mL 77% H2SO4溶液輕微晃動搖勻,60 ℃水浴10 min,冷卻至室溫,550 nm記錄吸光度。取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL的1 mg/mL茶皂素標品溶液補水至0.5 mL同上步驟作標準曲線。降解率按公式(1)計算:

(1)

式中:X,茶皂素降解率,%;w0,發酵前油茶餅中茶皂素含量,mg/g;w,發酵后油茶餅中茶皂素含量,mg/g。

1.4 單因素試驗

初始條件:發酵時間2 d,溫度37 ℃,接種量10%,翻樣(間隔12 h)。分別設置初始含水量70%、80%、90%、100%、110%、120%;發酵溫度25、28、31、34、37、40 ℃;接種量2%、4%、6%、8%、10%、12%;發酵時間12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h。每確定一個因素再進行下一步試驗。

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1.5 響應面試驗

1.5.1 Box-Behnken響應面優化設計

以單因素試驗中得到的對茶皂素降解率影響較大的因素——含水量(A)、接種量(B)和發酵溫度(C)進行響應面優化試驗。

1.5.2 驗證試驗

對響應面所得最佳工藝進行驗證,判定其結果是否可信。

1.6 成分測定

1.6.1 基本成分

灰分測定參照GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中總灰分的測定》;蛋白質測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》;脂肪測定參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》;粗纖維測定參照GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》;單寧測定參照 NY/T 1600—2008《水果、蔬菜及其制品中單寧含量的測定 分光光度法》;還原糖測定使用DNS法[18],稍改動,1 mL待測液加1 mL水、1.5 mL DNS試劑,混勻,沸水浴5 min,冷卻加水至10 mL,540 nm測吸光度。

1.6.2 游離氨基酸

樣品前處理參照WEN等[19]的方法,稍作修改,樣品按體積比1∶50加入0.01 mol/L的鹽酸,超聲波浸泡30 min,過濾,上清液按體積比1∶1加入8%的磺基水楊酸,搖勻放置10 min,10 000 r/min離心10 min,上清液過膜(0.22 μm),上機測定。

1.6.3 活性成分

總糖參照蒽酮硫酸法[20];多糖參照苯酚硫酸法[21]。

總酚參照Folin-Ciocalteau法[22],稍作修改:0.5 mL提取物按V(樣品)∶V(80%甲醇)=1∶10,40 ℃超聲波浸提1 h,循環3次,過濾定容到50 mL,加水7.5 mL、福林酚0.5 mL、20%的Na2CO31.5 mL混勻黑暗反應30 min,765 nm讀數。取0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL按1.3.3節的方法作標準曲線。

總黃酮采用硝酸鋁比色法[23],1.0 mL提取物按V(樣品)∶V(60%乙醇)=1∶30,浸泡過夜,45 ℃超聲波45 min,重復提取,定容至100 mL,分別加10%的Al(NO3)3、5%的NaNO2各0.3 mL,搖勻,黑暗放10 min;加4%的NaOH 3.5 mL,定容到10 mL,黑暗放30 min,510 nm測定吸光度。質量濃度為1 mg/mL蘆丁標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL按1.3.3節的方法作標準曲線。

1.7 數據處理

利用Microsoft Excel和SPSS 26.0軟件數據處理,結果以平均值±標準差表示,利用Design-Expert 13軟件完成響應面優化,利用Origin 2021軟件中的Heat Map with Dendrogram APP進行聚類熱圖的繪制。各組重復3次,P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 初始含水量對茶皂素降解率的影響

初始含水量是固態發酵的一個重要影響因素,低水分時微生物生長會最小化,高水分時基質會被水占據導致氧氣被排出[24]。圖1-a中90%含水量時降解率達到66.29%,最適合固態發酵降解茶皂素。高于90%時降解率持續降低,這可能是由于含水量增加使混勻后的油茶餅黏度增加通氣量減少的原因引起的,含水量過低也會影響茶皂素的降解,因此初始含水量選擇90%。

a-初始含水量;b-發酵溫度;c-接種量;d-發酵時間圖1 不同單因素對茶皂素降解率的影響Fig.1 Effects of different single factors on degradation rate of tea saponin注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 發酵溫度對茶皂素降解率的影響

影響微生物生長的所有生態生理參數中最重要的是溫度,其通過影響酶活性對微生物生長、代謝產物的積累產生作用[25]。圖1-b中隨溫度升高菌株對茶皂素的降解率呈現先升后降的趨勢,這是因為高溫會使酶失活,低溫會影響菌體生長和產酶速度。37 ℃時茶皂素降解率達到61.06%顯著高于其他溫度,因此發酵溫度選擇37 ℃。

2.1.3 菌株接種量對茶皂素降解率的影響

菌株生長速度與接種量直接相關,接種量將影響菌株的降解能力。圖1-c中接種量10%時降解率達到最大值63.61%。接種量2%～10%時,降解率隨接種量增加而增加,原因是細菌數增加縮短了對數期,其通過種內互助快速適應新環境,生長良好,提高降解率。而超過10%時,營養物質缺乏使得菌株相互競爭,降解率停止增加甚至減少[26]。故選擇10%的接種量。

2.1.4 發酵時間對茶皂素降解率的影響

圖1-d是發酵時間對菌株茶皂素降解率的影響。發酵前期,隨時間推移降解率一直升高,這是因為菌株產生的某些酶類對油茶餅中大分子物質進行分解[8],促進了菌株生長。而60 h后降解率開始逐漸下降,這是營養物質消耗殆盡,后期不足以供菌體正常生長所致。60、72、84 h時,茶皂素降解率均在60%以上且無顯著性差異,但實際生產中發酵周期較短為好,故確定發酵時間為60 h,此時降解率為64.99%。

2.2 響應面試驗設計和結果

單因素試驗中已確定發酵時間為60 h,為進一步優化發酵條件,利用初始含水量(80%～100%)、發酵溫度(34～40 ℃)、接種量(8%～12%)進行響應面試驗,降解率為響應值,其Box-Bnhnken試驗設計與結果分析見表1。

表1 響應面試驗設計與結果Table 1 Design and results of response surface experiment

回歸方程方差分析結果見表2,模型極顯著、失擬項不顯著、相關系數R2接近于1,表明本試驗模型合理、可靠性較高。由F值得各因素對降解率的影響順序為:發酵溫度(B)>接種量(C)>初始含水量(A)。茶皂素降解率(Y)的二次回歸方程:Y=69.80-0.91A-4.02B+3.82C-1.31AB-2.80AC-2.57BC-0.71A2-8.17B2-11.43C2。加以軟件分析得最佳條件為初始含水量83.669%,發酵溫度36.301 ℃,接種量10.535%,降解率預測值71.230%?？紤]實際操作,確定初始含水量83.7%、發酵溫度36.3 ℃、接種量10.5%進行驗證試驗,茶皂素降解率為72.18%,接近預測值,證明本試驗的優化方法可信。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

2.3 基本成分變化

如表3所示,發酵后茶皂素和單寧含量分別顯著降低72.18%、27.27%。發酵后僅剩6.24%的茶皂素,含量較低,將其添加于飼料中可能會具有改善動物生長性能的潛力[27]。粗蛋白和粗脂肪增加了26.89%和33.48%,粗蛋白增加是由于微生物會向胞外分泌多肽和酶蛋白等物質[28]。粗脂肪增加是因為油茶餅發酵時某些營養物質可能會降解成小分子物質,如醇和酸發生酯化反應,形成酯類物質,使得乙醚提取物增多[29]。發酵過程中,基本成分比例會發生變化,如油茶餅中某些物質會被菌株當做碳源以供營養所需。而粗纖維和還原糖的變化是由于枯草芽孢桿菌產生纖維素酶,將纖維素降解成低分子還原糖所引起。相比發酵前,油茶餅發酵后不良屬性被改善,抗營養因子大量降解使得苦、澀味消失,適口性變好;含有營養價值更高的蛋白、脂肪,可用于生產生物發酵飼料[3],在動物蛋白飼料方面具有一定的應用前景。

表3 油茶餅發酵前后的基本成分Table 3 Basic components of C. oleifera cake before and after fermentation

2.4 游離氨基酸變化

發酵前后油茶餅的游離氨基酸變化情況見圖2,共16種氨基酸,含7種必需氨基酸。熱圖表明2個樣品的氨基酸含量差異顯著,發酵后油茶餅總氨基酸含量顯著降低31.42%,必需氨基酸顯著增加16.18%,其中蛋氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸分別顯著增加27倍、1.41倍、1.39倍,這和DAI等[28]用枯草芽孢桿菌進行固態發酵豆粕后必需氨基酸含量增加的研究結果一致。其他氨基酸如天冬氨酸增加(1.17倍)和甘氨酸降低(57.83%)與YAO等[30]研究相似,枯草芽孢桿菌發酵豆粕后其含量會顯著增加和減少,這是大分子蛋白質水解所引起的。天冬氨酸由小分子肽(2～20個氨基酸殘基)和游離氨基酸組成[31],可直接被動物腸道系統吸收,側方面也證實發酵油茶餅可作為飼料的潛在可能性。此外,丙氨酸、精氨酸分別急劇下降70.50%和58.97%,造成總氨基酸的整體下降,這是由于最優工藝下菌株長勢良好,消耗過多氨基酸所引起。氨基酸可提供微生物生長所需營養,也是重要的呈味物質,與產品風味密切相關。異亮氨酸、組氨酸、精氨酸等是苦味氨基酸[32],其含量降低表明苦味有所減少,這與2.3節中茶皂素大幅度降解相對應,減少了牲畜拒食的可能性?？偟膩碚f,微生物發酵會使氨基酸有不同程度的變化,如CHEN等[33]發現納豆芽孢桿菌在不同發酵時間下大豆粉氨基酸會產生顯著差異。

圖2 油茶餅發酵前后氨基酸含量的熱圖Fig.2 Heatmap of amino acid content in C. oleifera cake before and after fermentation注:DZB為發酵前,FJB為發酵后。

2.5 活性成分變化

黃酮、總酚和糖類是油茶餅最主要的活性成分。表4中總糖和多糖顯著下降28.22%和23.66%,這說明菌株將油茶餅中的糖類當作了自身生長所需的碳源,不斷消耗造成了大量減少。這與WAGNER等[34]研究發現枯草芽孢桿菌可以降解或使用碳水化合物作為發酵中自身代謝的能量來源的觀點一致。多糖中葡萄糖是主要的組成單糖之一,可用于菌株的生物合成和代謝,這也是造成其含量下降的原因。多酚和類黃酮是科學研究中經常評估的生物活性化合物,由分析可知枯草芽孢桿菌發酵油茶餅后總酚和總黃酮含量分別增加了5.56%和30.88%。這與XU等[35]和DAI等[28]的研究一致,大豆發酵產品與原料的總酚與黃酮含量存在差異;枯草芽孢桿菌發酵豆粕會使總酚和類黃酮含量顯著增加。芽孢桿菌能代謝纖維素并釋放酚類化合物,因為酚類化合物與纖維素酶和果膠酶的產生之間具有強烈的相關性[36];在發酵時,微生物會產生各種酶類分解植物細胞的細胞壁成分,實現酯鍵水解,釋放酚類物質,使得總酚含量增加。酚類物質是最大的次生代謝物組分之一,也是非必需膳食成分的主要組分,具有廣泛的生物特性,如抗氧化、抗炎和抗癌活性[37]。而發酵后活性成分增加,為較高市場價值功能性食品、藥物等產品的生產創造了新的契機。

表4 油茶餅發酵前后的活性成分Table 4 Active components of C. oleifera cake before and after fermentation

3 結論與討論

本研究利用枯草芽孢桿菌固態發酵油茶餅,通過響應面優化得到降解茶皂素的最佳工藝為初始含水量83.7%,發酵溫度36.3 ℃,接種量10.5%,發酵時間60.0 h,此時降解率達到72.18%。而后對比發酵終點各類物質含量,結果表明:發酵會使油茶餅中茶皂素、單寧等抗營養因子顯著降低;粗蛋白、粗脂肪、還原糖、必需氨基酸等營養物質顯著增加;黃酮等主要活性成分顯著增多,糖類物質顯著減少;此外粗纖維、灰分含量也產生變化。綜上,本研究證實枯草芽孢桿菌固態發酵可以一定程度提升油茶餅的營養與活性成分含量,有利于其在發酵產品中的應用與發展。