‘申華’葡萄果實特征香氣成分分析

奚曉軍,查 倩,殷向靜,蔣愛麗

(上海市農業科學院林木果樹研究所,上海市設施園藝技術重點實驗室,上海 201403)

葡萄是世界性的重要經濟果樹之一,其果實酸甜可口、風味俱佳且富含多種維生素及營養成分,深受消費者的喜愛。 香氣作為重要的品質性狀,既豐富了葡萄果實的風味,又強化了葡萄的果實屬性,是吸引消費者購買的重要指標[1]。 目前已知葡萄和葡萄酒中具有香氣的揮發性化合物有1 300 多種,主要為醇類、酯類、醛類、萜烯類、酮類和C13 降異戊二烯類等物質。 然而,并不是所有檢測到的揮發性物質都對葡萄果實的香味起作用,真正起決定性作用的是其中的少數特征香氣物質[2]。 如玫瑰香型葡萄的特征香氣主要來源于萜類化合物,尤其是單萜物質,如里那醇、香葉醇、橙花醇等[3]。 酯類物質被認為是草莓香型葡萄的特征化合物,包括乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、鄰氨基苯甲酸甲酯等[4]。 葡萄果實中特征香氣成分的鑒定主要是利用氣味活性值(Odor activity value,OAV)進行,即通過計算揮發性物質的實際含量與其氣味感官閾值(Sensory thresholds)的比值判斷對香味的貢獻程度,具有量化、簡便、精確等優點,已被廣泛應用于葡萄和葡萄酒特征香氣成分的鑒定分析[5-8]。

‘申華’葡萄是由上海市農業科學院選育的優質新品種,具有成熟期早、色澤好、無核果粒大、風味濃郁等特征,已在上海市郊及周邊地區有了一定的栽培面積和知名度[9]。 然而,與同類型‘巨峰’系品種不同的是,‘申華’葡萄成熟時在草莓香味中還含有一股濃郁的酒香,因而被戲稱為“酒香葡萄”。 目前此類香型葡萄果實的關鍵呈香成分尚不明確。 本研究以‘申華’和‘巨峰’為試材,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術(HS-SPME-GC-MS)檢測兩個葡萄在成熟期時果實中的揮發性香氣物質的種類和含量,并通過氣味活性值及果實香氣輪廓來綜合分析這兩個品種在活性香氣成分上的差異,篩選‘申華’葡萄酒香氣味形成的特征香氣成分,以期為后續‘申華’葡萄更好地開發利用以及香味葡萄品種選育提供參考依據和科學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗于2021 年在上海市農業科學院莊行葡萄試驗基地進行,試驗園土壤以黏土為主,20—40 cm 土層有機質含量1.79%,全氮含量0.1%,全磷含量0.17%,全鉀含量7 718 mg∕kg。 葡萄果實香氣檢測在上海交通大學分析測試中心進行。

1.2 試驗材料

以8 年生‘申華’和‘巨峰’葡萄樹為試材,8 m 鋼管大棚設施栽培,株行距4 m×2.8 m,采用高干籬架配合“V”形葉幕的栽培架式。 各品種成熟期隨機采集5 穗生長良好、大小一致、無病蟲害的果實,每穗在上、中、下部位各取葡萄果實2 粒,重復3 次。 采集的果粒迅速用液氮冷凍,-80 ℃儲存備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 果實香氣物質的提取

參照Xi 等[10]的方法進行果實揮發性香氣物質的提取。 稱取50 g 樣品,剪掉果梗并去籽后用液氮研磨成粉,4 ℃、10 000 r∕min 離心10 min,取上清液待用。 取6 mL 葡萄汁,加入預裝1.5 g NaCl 的20 mL 螺蓋樣品瓶中,再添加4 μL 內標物質2-辛醇(53.84 mg∕L),加蓋密封后用于進樣及GC-MS 分析。 重復3 次。

1.3.2 氣相色譜條件和香氣物質的定性定量分析

氣相色譜-質譜聯用的檢測條件和香氣物質定性定量分析方法參見Wu 等[5],利用全離子掃描圖譜,將質譜圖在NIST11 標準譜庫匹配檢索,并根據已有標準品的色譜保留時間和質譜信息進行定性分析。對于有標準品的化合物,利用其相應的標準曲線進行定量,沒有標準品的化合物,使用內標進行半定量。

1.3.3 氣味活性值(OAV)和果實香氣輪廓

通過查閱文獻確定各香氣化合物的相關描述和感官閾值,利用各成分的定量結果與感官閾值的比值計算OAV,OAV≥1 即定性為具有貢獻的活性香氣成分。 根據化合物的香氣描述共分為植物類、花香類、果香類、脂肪類等8 個香系,通過對應香系的活性香氣成分的OAV 累計值進行果實香氣輪廓分析,當活性香氣成分對應多個香味系列時,每個系列均獲得該OAV 值。

1.4 數據分析

采用Excel 2017 軟件對數據進行統計整理和作圖,采用SPSS 18.0 進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 ‘申華’和‘巨峰’葡萄果實香氣的定量分析

由表1 可知,‘申華’葡萄果實中共檢測到42 個香氣化合物,包括C6 化合物6 個、醇類5 個、酯類14 個、醛類12 個、萜烯類5 個。 ‘巨峰’葡萄果實中共檢測到香氣化合物37 個,包括C6 化合物6 個、醇類4 個、酯類15 個、醛類11 個、萜烯類1 個。 其中有6 個化合物僅在‘申華’中能檢測到,主要為萜烯類化合物。 而異丁酸乙酯只出現在‘巨峰’葡萄果實中。 此外,酯類化合物在兩個品種中檢測到的數量都是最多的,醛類次之。

表1 ‘申華’和‘巨峰’葡萄果實的香氣成分含量Table 1 Content of aroma components in ‘Shenhua’ and ‘Kyoho’ grapes

如圖1 所示,‘申華’和‘巨峰’葡萄均以酯類和C6 化合物為主,這兩類化合物的含量之和占比達98.31%和98.81%,其中酯類含量最高,尤其是‘申華’葡萄,酯類化合物含量占比達92.78%。 ‘申華’葡萄果實中揮發性香氣物質的總含量達到33 038.17 μg∕L,顯著高于‘巨峰’果實中的13 826.38 μg∕L(表1)。

圖1 ‘申華’和‘巨峰’葡萄果實香氣成分種類占比Fig.1 Percentage of aroma components in ‘Shenhua’ and ‘Kyoho’ grapes

‘巨峰’葡萄果實中C6 化合物的總含量顯著高于‘申華’,其中反式-2-己烯醛在‘申華’和‘巨峰’葡萄的含量均最高,分別為1 158.51 μg∕L 和1 190.62 μg∕L,是C6 化合物總含量的63.43%和47.53%,但兩個品種間無顯著性差異。 1-己醇、反式-2-己烯-1-醇在‘巨峰’葡萄中的含量顯著高于‘申華’,而‘申華’中正己醛和順式-3-己烯-1-醇的含量顯著高于‘巨峰’(表1)。

醇類化合物在‘申華’和‘巨峰’果實中的含量均不高,分別為13.17 μg∕L 和8.45 μg∕L,在‘申華’中的含量明顯大于‘巨峰’。 除2-乙基己醇之外,其余4 個醇類化合物在‘申華’果實中的含量均顯著高于‘巨峰’。 (表1)

‘申華’葡萄果實中的酯類化合物總含量為30 652.60 μg∕L,明顯大于‘巨峰’的11 156.93 μg∕L。 乙酸乙酯是兩個品種中含量最高的酯類化合物,在‘申華’和‘巨峰’果實中的含量分別達到30 333.54 μg∕L和10 589.12 μg∕L,是酯類化合物總含量的98.96%和94.91%。 剩余的14 個酯類化合物中,丁酸乙酯的含量較高,在‘申華’和‘巨峰’中的含量分別為161.42 μg∕L 和312.98 μg∕L,兩者差異顯著。 在所有檢測到的酯類化合物中,有8 個化合物在‘申華’中的含量顯著高于‘巨峰’,4 個化合物含量顯著低于‘巨峰’(表1)。

‘申華’和‘巨峰’在醛類化合物含量上同樣差異顯著,其中3-甲基丁醛是含量較高的化合物,在‘申華’和‘巨峰’中的含量分別為333.18 μg∕L 和79.78 μg∕L,是醛類化合物總含量的65.42%和51.54%。其他11 個醛類化合物中,有8 個在‘申華’中的含量明顯高于‘巨峰’,因此,‘申華’果實中的醛類化合物總含量顯著高于‘巨峰’(表1)。

萜烯類物質在兩個品種中的含量均極低,尤其是‘巨峰’,其含量僅為1.34 μg∕L。 在‘申華’葡萄中檢測到的5 個萜烯類化合物,僅對傘花烴在‘巨峰’葡萄果實中也能檢測到,且含量顯著低于‘申華’(表1)。

2.2 ‘申華’和‘巨峰’葡萄的果實活性香氣成分

由表2 可知,在兩個品種中共有21 個化合物被認定為活性香氣成分,包括5 個C6 化合物、1 個醇類化合物、7 個酯類化合物以及8 個醛類化合物,其中‘申華’和‘巨峰’葡萄中的活性呈香成分數量均為19個。 此外,活性香氣成分的OAV 值在兩個品種間存在差異,其對果實香氣的貢獻也不同。 C6 化合物中主要的活性香氣成分包括反式-2-己烯醛、3-己烯醛和正己醛,是植物類氣味的重要貢獻成分。 其中‘申華’葡萄中的反式-2-己烯醛和正己醛的OAV 值高于‘巨峰’,而3-己烯醛的OAV 值低于‘巨峰’。 兩個品種醇類化合物中僅1-辛烯-3-醇的OAV 值≥1,其在‘申華’葡萄中的OAV 值高于‘巨峰’,對植物類和脂肪類氣味都有貢獻,而其他醇類化合物均不是活性香氣成分。 酯類化合物是果香類氣味的主要貢獻成分,其中,2-甲基丁酸乙酯雖然在兩個品種中的含量均不高,但由于其極低的閾值使得它在‘申華’和‘巨峰’中的OAV 值分別達到107.14 和82.52,是最重要的果香類氣味貢獻成分。 而乙酸乙酯雖然在兩個品種中的含量極高,但由于其感官閾值高達5 000 μg∕L,使得OAV 值在‘申華’和‘巨峰’分別只有6.07 和2.12,對果實整體的香氣貢獻不大。 己酸乙酯是另一個對果香類氣味有較大貢獻的酯類物質,其在‘申華’和‘巨峰’中的OAV 值分別為41.91 和71.84。 值得一提的是,‘巨峰’果實中戊酸乙酯的OAV 值為83.14,遠高于‘申華’中的10.97,但是戊酸乙酯只對植物類氣味有貢獻。 醛類化合物的感官閾值普遍較低,因此,兩個品種中的醛類活性香氣成分較多。 這些成分在‘申華’中的OAV 值均大于‘巨峰’,而且對植物類、果香類、脂肪類以及花香類氣味都有貢獻。 萜烯類化合物在‘申華’和‘巨峰’葡萄中的OAV 值均小于1,對這兩個品種果實的整體香氣均無貢獻。

表2 ‘申華’和‘巨峰’葡萄活性香氣成分氣味活性值(OAV)Table 2 Odor activity value of active aroma components in ‘Shenhua’ and ‘Kyoho’ grapes

2.3 ‘申華’和‘巨峰’葡萄的果實香氣合成途徑分析

由表3 可知,‘申華’和‘巨峰’葡萄的果實香氣合成均以脂肪酸途徑為主,其合成香氣含量分別占香氣總含量的98.57%和99.23%。 ‘申華’果實中通過脂肪酸途徑合成的香氣含量為32 564.87 μg∕L,顯著高于‘巨峰’的13 720.55 μg∕L,其中含量較高的香氣物質主要為反式-2-己烯醛、1-己醇、乙酸乙酯等直鏈脂肪族醇、醛和酯類物質。 在‘申華’和‘巨峰’中通過氨基酸途徑合成的香氣物質分別有9 個和8 個,主要是2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁醛等支鏈脂肪族醛和酯類物質,這些香氣物質在‘申華’中的含量為446.29 μg∕L,顯著高于‘巨峰’中的105.83 μg∕L。 相比脂肪酸途徑,氨基酸途徑合成的香氣物質在這兩個葡萄品種中的含量都不高,但代謝形成了一些重要的呈香活性成分,尤其是2-甲基丁酸乙酯,對‘申華’和‘巨峰’葡萄果香類氣味有著重要的貢獻。 因此,氨基酸途徑是‘申華’和‘巨峰’葡萄果實香氣形成的重要方式。 ‘申華’葡萄果實中通過異戊二烯途徑合成的香氣含量僅為27 μg∕L,且不存在萜烯類的活性香氣化合物,而在‘巨峰’果實中甚至都沒有檢測到相關的香氣物質,所以異戊二烯合成途徑對這兩個品種果實香氣物質形成貢獻可忽略。

表3 ‘申華’和‘巨峰’果實香氣物質合成途徑分析Table 3 Biosynthetic pathway of aroma components in ‘Shenhua’ and ‘Kyoho’ grapes

2.4 ‘申華’和‘巨峰’葡萄的果實香氣輪廓分析

如圖2 所示,‘申華’和‘巨峰’葡萄在果實香氣輪廓上存在一定差異。 植物類和果香類氣味是兩個品種果實共同的主要特征,‘申華’葡萄中植物類氣味強度為443,略高于‘巨峰’中的372。 果香類氣味強度在‘申華’和‘巨峰’果實中分別為294 和200。 脂肪類氣味是兩個品種的次要特征,其在‘申華’葡萄果實中的強度為131,明顯高于‘巨峰’中的68,而剩余的其他氣味系列如香料類、溶劑類等在兩個品種中的強度極低或無。 因此,‘申華’葡萄的整體氣味強度要高于‘巨峰’。

圖2 ‘申華’和‘巨峰’葡萄的果實香氣輪廓Fig.2 Aroma profiles of ‘Shenhua’and ‘Kyoho’ grapes

3 討論與結論

香氣是鮮食葡萄風味形成的重要組成部分,也是衡量果實品質的重要指標。 研究表明,不同葡萄品種果實中的香氣成分和含量存在很大的差異[3]。 C6 化合物是葡萄果實中最重要的香氣組分,被認為是所有葡萄品種中的基礎性香氣物質[27]。 陳迎春等[28]通過對6 個鮮食葡萄品種的揮發性香氣物質進行比較,發現C6 化合物在成熟果實中的含量很高,是貢獻最大的揮發性化合物。 牛早柱等[29]研究發現,2-己烯醛和己醛等C6 化合物在15 個鮮食葡萄品種中的相對含量和香氣值均較高,是對葡萄果實香氣影響較大的物質。 李凱等[7]對‘醉金香’和‘香玉’葡萄的香氣成分進行分析,發現反式-2-己烯醛、正己醛等C6 化合物的含量較高,是兩個品種植物類氣味的重要貢獻化合物。 本研究通過分析比較‘申華’和‘巨峰’葡萄的香氣成分,同樣發現反式-2-己烯醛、正己醛和3-己烯醛等C6化合物是這兩個品種重要的活性香氣物質,對植物類氣味有較大貢獻。

‘申華’葡萄是‘京亞’和‘86-179’的雜交后代[9],而‘京亞’和‘86-179’均是‘巨峰’的后代,因此,‘申華’也是四倍體巨峰系品種,有著‘巨峰’果實中的典型草莓香味。 研究表明,酯類化合物是草莓香型歐美雜交種葡萄的特征化合物,對葡萄果香類氣味有著重要的貢獻[30-31]。 張文文等[6]研究發現,丁酸乙酯是‘巨峰’葡萄果香氣味的主要香氣貢獻化合物,而另一個巨峰系品種‘藤稔’果香顯著的原因主要是2-甲基丁酸乙酯的存在。 酯類化合物異丁酸乙酯和丁酸乙酯在‘醉金香’和‘香玉’葡萄中具有高OAV 值,被認為是這兩個品種果香類氣味的重要貢獻化合物[7]。 與前人的研究結果類似,本研究中,‘申華’和‘巨峰’葡萄果實中酯類物質的數量最多且含量最高,其中2-甲基丁酸乙酯是兩個品種最重要的果香類氣味的貢獻成分,尤其是在‘申華’葡萄中,其OAV 值高達107.14。 己酸乙酯、丁酸乙酯等也是果香類氣味的重要貢獻成分,但其在‘申華’葡萄中的OAV 值都低于‘巨峰’。 乙酸乙酯在兩個品種中的含量非常高,占所有酯類化合物總含量的90%以上,但由于其過高的感官閾值,使得它對果實整體的香氣貢獻不大,這與前人的研究結果一致[5-7]。 另外,‘申華’葡萄果實中除了具有巨峰系典型草莓香味外,還含有一股濃郁的酒香氣味,本研究通過比較分析‘申華’和‘巨峰’葡萄中的活性香氣成分和含量,發現酯類化合物庚酸乙酯可能是‘申華’葡萄果實酒香氣味的重要貢獻物質,其香味描述為葡萄酒香、白蘭地香以及果香[6],而且它在‘申華’葡萄中的OAV 值顯著高于‘巨峰’。

醛類也是葡萄果實中香氣物質的重要組成部分,對植物類、花香類等氣味均具有貢獻。 研究表明,2-苯乙醛、3-甲基丁醛等醛類化合物是陳釀葡萄酒中重要的香氣貢獻成分[24],反式-2-壬烯醛、反式-2-順式-6-壬二烯醛則是鮮食葡萄‘戶太8 號’果實中植物類氣味的重要貢獻物質[32]。 本研究發現,‘申華’和‘巨峰’葡萄中的醛類活性香氣成分較多,尤其是3-甲基丁醛、反式-2-壬烯醛和壬醛,在‘申華’中的OAV 值均顯著高于‘巨峰’,對植物類、果香類以及脂肪類氣味有重要的貢獻。

萜烯類化合物是玫瑰香型葡萄的特征香氣成分,在歐亞種‘玫瑰香’、歐美雜交種‘巨玫瑰’等玫瑰香型品種中能檢測到數量較多且OAV 值較高的萜類化合物,其中里那醇、香葉醇等單萜類化合物對玫瑰香味的貢獻最大[10,26]。 ‘申華’和‘巨峰’葡萄果實并不具備玫瑰香味,在兩個品種中只檢測到極少量的萜烯類化合物,OAV 分析結果也表明這些萜烯類物質對兩個品種的果實香氣均無貢獻。 因此,萜烯類化合物不是‘申華’和‘巨峰’葡萄中的活性香氣成分。

鮮食葡萄香氣物質的合成主要通過脂肪酸、氨基酸和異戊二烯等代謝途徑,即底物在酶的直接催化下合成揮發性物質。 葡萄果實中的C6、C9 醇和醛類及其所形成的酯主要是以脂肪酸為前體而形成,氨基酸途徑產物以支鏈或芳香族結構為主,而萜烯類物質由異戊二烯途徑合成,包括類赤霉素、胡蘿卜素、甾醇等在內的單、倍半、二和多萜等組分[33]。 周建梅等[34]研究發現,‘巨峰’葡萄果實香氣的合成以脂肪酸途徑為主,同時氨基酸途徑香氣合成也占有較大比重。 在本研究中,‘申華’作為巨峰系的歐美雜交種,其果實香氣合成同樣以脂肪酸途徑為主,推測‘申華’葡萄果實中具有較高活性的脂氧合酶參與脂肪酸氧化,進而促進酯類物質的合成。 此外,通過氨基酸途徑合成的2-甲基丁酸乙酯是‘申華’葡萄最重要的果香類氣味貢獻成分,表明氨基酸途徑也是‘申華’果實香氣形成的重要方式。 葡萄果實香氣的合成與積累是一個極為復雜的過程,大量研究表明,果實的怡人香氣不只是由其遺傳特性決定,還受到環境因子、栽培措施等多種因素的影響[31,34-36]。 因此,針對‘申華’果實香氣成分的生物合成及其變化的調控技術還有待進一步深入研究,從而更好地助推‘申華’葡萄的開發利用。

綜上,‘申華’和‘巨峰’葡萄果實中分別發現42 個和37 個香氣物質,主要以酯類和C6 化合物為主,其中酯類含量極其突出,尤其是在‘申華’葡萄中,占總含量的92.78%。 除了C6 化合物之外,其他酯類、醛類等化合物在‘申華’中的含量均顯著高于‘巨峰’。 OAV 結果明確‘申華’和‘巨峰’葡萄均有19 個活性香氣成分,反式-2-己烯醛、正己醛和3-己烯醛等C6 化合物是這兩個品種重要的活性香氣物質,對植物類氣味有較大的貢獻。 2-甲基丁酸乙酯是‘申華’葡萄最重要的果香類氣味的貢獻成分,‘巨峰’則是2-甲基丁酸乙酯和己酸乙酯。 香氣描述發現庚酸乙酯可能是‘申華’葡萄果實酒香氣味的重要貢獻成分。3-甲基丁醛、反式-2-壬烯醛和壬醛是植物類、果香類以及脂肪類氣味的重要貢獻成分,尤其是在‘申華’中,其OAV 值顯著高于‘巨峰’。 果實香氣合成途徑分析顯示,‘申華’和‘巨峰’葡萄的果實香氣合成均以脂肪酸途徑為主,同時氨基酸途徑在香氣合成中也發揮著重要的作用。 果實香氣輪廓直觀地表明植物類和果香類氣味是兩個品種果實共同的主要特征,而‘申華’葡萄果實整體氣味強度高于‘巨峰’。