固相凈化結合超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定九香蟲及其成方制劑中10種真菌毒素*

胡 珀，卜媛媛，趙祥杰，何曉希，金 鵬**

1淮安市食品藥品檢驗所，淮安 223001；2淮陰工學院，淮安 223001

真菌毒素是一類由產毒真菌在一定環境條件下產生的具有毒性作用的次級代謝產物[1]，部分真菌毒素已被證實具有致癌、致畸、致突變作用，對人類健康造成很大威脅。目前已知的真菌毒素有300余種，其中常見的易對人體產生危害的有黃曲霉毒素、單端孢霉烯族類毒素、玉米赤霉烯酮等[2]。近年來中藥材污染真菌毒素的現象層出不窮，從中藥材種植（養殖）、采收到加工、儲藏、運輸等環節，若條件控制不好就會產生真菌毒素。動物類中藥材成分為油脂、蛋白質等高營養物質，貯存不當易受真菌侵染而霉變，真菌毒素污染風險高[3]。污染后的真菌毒素難以徹底消除，須及時檢測處理，避免含量超標。目前，對中藥材真菌毒素標準的制定及研究主要集中在果實種子類和動物類藥材和飲片中，而對制劑的研究卻較少?！吨袊幍洹?020 年版規定了24 種中藥材黃曲霉毒素限量標準，中藥污染真菌毒素問題在業內已引起廣泛重視[4]。

九香蟲是我國傳統的動物藥，2020 版《中國藥典》 增加了其中藥材和飲片的黃曲霉毒素檢查項，而含有九香蟲制劑暫無該檢查要求。本機構在含九香蟲制劑日常檢驗的同時，進行了黃曲霉毒素風險項探索性研究，發現有黃曲霉毒素超標的情形。本研究通過MFC100 固相凈化柱凈化，超高效液相色譜-串聯質譜法（UHPLC-MS）檢測，建立了九香蟲及其成方制劑中10 種真菌毒素 [黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）、黃曲霉毒素 G2（AFG2），伏馬毒素B1（fumonisin B1，FB1）、伏馬毒素B2（FB2），T-2 毒素（T-2 toxin，T-2），嘔吐毒素（deoxynivalenol，DON），赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）及玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZON）]的檢測方法，并成功用于實際樣品的污染風險評估。

1 材 料

1.1 儀器

UltiMate3000 超高效液相色譜儀（美國ThermoFisher 公司）；QTRAP 4500 三重四極桿質譜儀、Analyst 采集軟件和MultiQuant 3.0.2 分析軟件（美國SCIEX 公司）；XS205DU 電子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；T25 easy clean 均質分散機（德國IKA 公司）。

1.2 藥品和試劑

10 種真菌毒素混標溶液（批號S095939，濃度AFB1：0.8 μg·mL-1、AFB2：0.4 μg·mL-1、AFG1：0.8 μg·mL-1、AFG2：0.4μg·mL-1、FB1：8μg·mL-1、FB2：8μg·mL-1、T-2：8μg·mL-1、DON：199.7μg·mL-1、OTA：0.8μg·mL-1、ZON：2 μg·mL-1）購自阿爾塔科技有限公司；MFC100固相凈化柱購自青島普瑞邦生物工程有限公司。

九香蟲藥材（產地：貴州、云南）購自亳州市同善堂中藥材有限責任公司；九香蟲飲片購自安國市東方紅藥材公司（批號202209，產地云南；批號202208，產地湖南）和江蘇承開中藥有限公司（批號220901，產地湖北）；疏肝益陽膠囊（規格：0.25 g，批號：221115）購自貴州益佰制藥股份有限公司；茸血補心丸（規格：9 g，批號：220301）購自遼源譽隆亞東藥業有限責任公司；康力欣膠囊（規格：0.5 g，批號：20220802）購自云南名揚藥業有限公司。

甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，實驗用水由Milli-Q純水機制得。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（2.1mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫30℃；自動進樣器10℃；0.1%甲酸水溶液為流動相A，甲醇-乙腈（1∶1）為流動相B，以0.3 mL·min-1的流速梯度洗脫（A∶B）：0 min（95∶5）→2.0 min（95∶5）→2.1 min（60∶40）→7 min（45∶55）→10 min（30∶70）→10.5 min（10∶90）→11 min（95∶5）→13 min（95∶5）；進樣體積5 μL。

2.2 質譜條件

電噴霧離子化多反應監測正負離子同時檢測。霧化電壓5500 V；離子傳輸溫度500℃；去簇電壓和碰撞能量見表1。對照品溶液的總離子流圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液總離子流圖

表1 10 種真菌毒素對照品質譜分析參數

2.3 溶液的制備

2.3.1 供試品溶液的制備 取九香蟲粉末及其成方制劑粉末約5 g，精密稱定，分別置于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙腈-水-甲酸（84∶15.9∶0.1），均質2 min，用定性濾紙過濾，精密量取4 mL 濾液至無熒光的玻璃管中，過MFC100 固相凈化柱，取凈化液，待測。陽性超標樣品，取續濾液定量稀釋后檢測。

2.3.2 系列基質混合對照品溶液的制備 取空白基質樣品產地湖北約5 g，精密稱定，按“2.3.1”項下方法處理，取凈化液作為空白基質，分別精密加入10 種真菌毒素混標溶液，配制成系列基質混合對照品溶液，其中AFB1、AFG1和OTA 濃度為0.2、0.4、1、2、4 ng·mL-1，AFB2和AFG2濃度為0.1、0.2、0.5、1、2 ng·mL-1、FB1、FB2和T-2 濃度為2、4、10、20、40 ng·mL-1、DON 濃度為49.9、99.8、249.6、499.2、998.5 ng·mL-1，ZON 濃度為0.5、1、2.5、5、10 ng·mL-1。

2.3.3 系列溶劑混合對照品溶液的制備 取10 種真菌毒素混標溶液適量，用乙腈-水-甲酸（84∶15.9∶0.1）稀釋配制成系列溶劑混合對照品溶液，10 種真菌毒素濃度同“2.3.2”。

2.4 方法學驗證

2.4.1 專屬性、重復性和穩定性試驗 同步開展空白試驗，空白樣品無干擾，表明該方法專屬性良好。取九香蟲樣品粉末5 g，稱取6 份，加入25 μL 10 種真菌毒素混標溶液，制備加標供試品溶液測定，10種真菌毒素的峰面積RSD 均≤10%，表明該方法重復性良好；取基質混合對照品溶液放置0、2、4、8、12、24 h 后測定10 種真菌毒素的峰面積，結果峰面積的RSD 均≤10%，表明基質混合對照品溶液中10 種真菌毒素在24 h 內均穩定。

2.4.2 校準曲線、檢出限和定量限 測定系列基質混合對照品溶液，以各化合物的質量濃度和響應值峰面積繪制標準曲線。結果表明，10 種真菌毒素在各自質量濃度范圍內線性關系良好，r>0.999。以3倍信噪比（S/N）計算檢出限LOD，以10 倍S/N 計算定量限LOQ。結果見表2。

表2 線性方程及檢出限、定量限

2.4.3 準確度和精密度試驗 取同一批次九香蟲樣品粉末約5 g，精密稱定，稱取18 份，6 份為一組，按低、中、高3 個濃度水平分別精密加入10 種真菌毒素混標溶液10、25、50 μL，依次制備供試品溶液并測定含量，計算回收率，結果見表3?？梢?0 種真菌毒素的平均回收率為62.3%～106.6%，RSD ＜10%。

表3 回收率試驗結果（n=6）

2.4.4 實際樣品分析測定 檢測收集的2 批九香蟲藥材、3 批九香蟲飲片、3 批含九香蟲制劑，其中7批樣品有檢出，結果見表4。

表4 實際樣品分析測定結果

根據《中國藥典》2020 年版九香蟲[1]項下規定，本品每1000 g 含AFB1不得過5 μg，含AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的總量不得過10 μg，共5 批超出限量標準。

3 討論

3.1 液-質條件的優化

針對真菌毒素的ESI-MS/MS 檢測,在流動相水相中添加揮發性有機酸時，響應明顯增強。分別考察了乙腈-0.1%甲酸水，甲醇-乙腈（1∶1）-0.01%甲酸水、甲醇-乙腈（1∶1）-0.1%甲酸水流動相系統。采用甲醇-乙腈（1∶1）-0.1%甲酸水流動相系統獲得了良好分離和檢測靈敏度。

T-2 毒素分子量為466.52，在《中國藥典》2020年版中，選擇的母離子為489.2，結合形式為[M+Na]+。本研究中發現T-2 毒素更易結合為[M+NH4]+，峰強度也較高，其定量離子對，定性離子對均有較好的峰型，故選擇484.2 為母離子。

3.2 前處理條件的優化

本實驗采用均質提取法能夠快速分散樣品，制得更均一的混合溶液。目前，常用的毒素提取溶劑主要包括甲醇、乙腈和水，本實驗比較了不同比例甲醇-水、乙腈-水提取效果，乙腈-水（84∶16）的提取效率高，溶液峰形較好且較為穩定，乙腈-水（84∶16）對大多數化合物具有適當的極性，加入0.1%甲酸后，OTA 和ZON 回收率變高，綜合考慮選擇乙腈-水-甲酸（84∶15.9∶0.1）作為提取溶劑。

凈化的前處理耗材一般有通用性固相萃取柱、免疫親合柱和固相凈化柱。固相萃取柱以硅膠、C18、硅酸鎂等作填料，可選擇性吸附和洗脫，是目前國際上較為常用的檢測真菌毒素樣品的前處理方法之一，適用于簡單基質，但凈化時間長。免疫親合柱既可單獨凈化得到一種或一類毒素，也可同時凈化得到幾類毒素，但是凈化效果容易受樣品基質、pH、溶劑等因素的影響，同時價格昂貴、凈化時間長。已商品化的真菌毒素固相凈化柱中的填料包含活性炭、硅膠、氧化鋁、極性或非極性材料、離子吸附樹脂等，其原理是過柱后將干擾物等截留在柱內，樣液中的毒素不被吸附而直接通過，與免疫親合柱和固相萃取柱的原理相反[5]，因待測組分直接通過柱子，無平衡、淋洗和洗脫過程，而使凈化時間縮短。本實驗使用的固相凈化柱MFC100 可吸附雜質、脂類和蛋白質，適用于多毒素凈化，凈化時間短，回收率在可接受范圍，故選擇MFC100 固相凈化柱前處理方法。

3.3 基質效應

ESI 源中基質效應的產生是受到共流出物質的干擾，產生競爭性電離，導致目標物響應增強或者降低的現象[6，7]?；|效應（matrix effect，ME）在±20%之間為可接受范圍，其計算公式為ME（%）=[（A2-A1）/A1]×100，式中：A1為加標溶劑的峰面積；A2為同濃度加標空白基質峰面積[8]，結果＞0 說明有基質增強效應，＜0 則說明有基質抑制效應。結果顯示，10 種真菌毒素的基質效應除DON 為基質增強效應，其余9 個均為基質抑制效應，因此基質效應不可忽略。如FB1在九香蟲基質抑制作用嚴重，達-77.6%，而DON 在九香蟲基質中則存在基質增強效應，為17.7%。這可能是由于樣品提取液中的油脂以及磷脂類物質等影響了某些目標物的離子化效率導致的結果。消除基質效應最佳方法是采用適宜的同位素內標，但是在真菌毒素較多的情況下，找到適用于每種真菌毒素的內標物較為困難且價格昂貴，本研究標準曲線通過空白基質加標制備，可以在現有條件的基礎上最大程度的減弱基質效應，保證實驗結果的準確性。

4 結論

本研究建立了九香蟲藥材、飲片及其制劑中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、FB1、FB2、T-2、DON、OTA、ZON 共10 種真菌毒素的檢測方法，該方法簡便、快速、準確。實驗結果表明除一批九香蟲飲片未檢出真菌毒素外，其他7 個樣品均被真菌毒素污染，說明九香蟲易受黃曲霉和鐮刀菌污染，應為九香蟲制劑建立殘留限量標準。

動物藥基質營養豐富，易霉變產生真菌毒素，且后者與周圍環境的溫度、濕度、基質、pH 值有密切關系。目前，多數動物藥并未明確規定冷藏、防潮等貯藏條件，霉變的樣品在市場上多見。有研究表明，適宜的干燥程度和較低的貯藏溫度可以有效控制霉菌生長[8]，需要進一步研究霉菌在不同條件下的生長規律，遏制污染，為九香蟲藥材、飲片及其制劑的安全使用提供保障。