HPLC法同時測定兒童化妝品中達克羅寧與新康唑的含量*

吳 旭，金 鵬，劉 洋，蘇 晶

淮安市食品藥品檢驗所，淮安 223300

隨著社會的發展和生活水平的提高，兒童化妝品的普及率越來越高,其安全性亦備受消費者關注。在某次江蘇省化妝品省級監督抽檢中，某公司生產的兒童用護膚品中檢出了新康唑和達克羅寧兩種未列入化妝品原料的物質。

新康唑為酮康唑（Ⅱ）的衍生物，主體結構與酮康唑完全相同,是一種咪唑類新型廣譜抗生素，可抑制真菌麥角甾醇生物合成，并改變細胞膜其它脂類化合物的組成[1]。酮康唑不能用于個人護理品中[2]，而新康唑主要用以去屑、殺菌和調節皮膚油脂[3]。達克羅寧多以鹽酸鹽形式存在，是一種新型處方類局部麻醉藥[4]，作用于皮膚及粘膜表面，具有鎮痛、止癢及殺菌作用[5]。新康唑和達克羅寧在我國主要用于醫學領域，在化妝品中屬于禁用成分，不應在化妝品特別是兒童化妝品中使用。

本研究建立了化妝品中新康唑和達克羅寧的檢驗方法，彌補了現行化妝品安全檢測方法的不足，為行政監管打擊個別企業非法添加違禁成分的行為提供了技術支撐。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器與試劑

Waters2695/2998 高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；島津LC-2030 高效液相色譜儀（日本島津公司）；METTLER XS205 電子天平（瑞士梅特勒-托利多科技有限公司），KH7200 型超聲波清洗儀（昆山禾創超聲儀器有限公司），Thermo MULTIFUGE X1R高速離心機（美國賽默飛世爾科技公司），XW-80A渦旋混合儀(上海馳唐電子有限公司)，SevenCompact S220pH 計（瑞士梅特勒-托利多科技有限公司）；Milli-QR 型超純水機（美國密理博公司）。

甲醇、乙腈為色譜純；甲酸、磷酸（85%，w/v），優級純；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉分析純；水為GB/T 6682 規定的一級水。

1.2 材料

鹽酸達克羅寧對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號100423-201102，105℃干燥3 小時后使用，按C18H27NO2·HCl 計，含量為99.8%）；新康唑對照品（Cato Research Chemicals Inc，批 號1028-RC-0061，含量99.8%）。

兒童化妝品共17 批次，均來自江蘇省化妝品監督抽檢。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性實驗

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）或等效色譜柱；流動相A 為0.02 moL·L-1磷酸二氫鈉水溶液（H3PO4調pH 值至3.0），流動相B為甲醇，梯度洗脫（A∶B）：0 min（40∶60）→9 min（40∶60）→13 min（30∶70）→30 min（30∶70）→30.1 min（40∶60）→34 min（40∶60）；流速1.0 mL·min-1；檢測波長280、202 nm；柱溫30℃；進樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合標準儲備溶液 取達克羅寧對照品和新康唑對照品各適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋制成每1 mL 中含達克羅寧1 mg 和新康唑1 mg的溶液。

2.2.2 供試品溶液 稱取樣品0.5 g（精確到0.1 mg）于25 mL 具塞比色管中，加入乙腈2 mL，渦旋分散均勻后，加入乙腈20 mL，渦旋30 s，冰浴超聲提取30 min，加入乙腈定容至刻度，置冰箱冷藏3 h，以5000 r·min-1離心5 min，取上清液經0.22 μm 濾膜過濾，濾液作為供試品溶液。

2.2.3 空白基質溶液 稱取空白樣品0.5 g，按照“2.2.2”項下方法處理，得空白基質溶液。

2.2.4 空白基質加標溶液 稱取空白樣品0.5 g，加入混合標準儲備溶液，按照“2.2.2”項下方法處理，得空白基質加標溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 提取效果 樣品前處理的方法主要參考了《化妝品安全技術規范》2015 版中 “2.1 氟康唑等9種組分”的前處理方法，比較了乙腈和甲醇兩種提取溶液的提取效率。達克羅寧和新康唑在乙腈中都有很好的溶解性，最終確定以乙腈作為提取劑，并加用超聲波振蕩。

稱取11 號陽性樣品0.5 g 于25 mL 具塞比色管中，加入乙腈2 mL，渦旋分散均勻后，定容至刻度，渦旋30 s，考察冰浴、室溫、60℃三個條件下，超聲0、10、20、30、40 min 條件下乙腈的提取效果。結果達克羅寧在冰浴30 min 時提取效果最好，新康唑在60℃30 min 時提取效果最好，考慮到達克羅寧易降解，且含量較新康唑少，所以選擇冰浴30 min 為提取條件。

2.3.2 特異性 選擇溶劑（乙腈）、空白基質溶液（“2.2.3”）、空白基質加標溶液（“2.2.4”）按照“2.1”色譜條件進行分析，記錄色譜圖（圖1）。結果表明達克羅寧和新康唑與相鄰峰之間分離度均＞1.5，溶劑和基質中存在的因子對被測目標因子均不存在干擾。

圖1 達克羅寧（A）與新康唑（B）HPLC 圖

2.3.3 耐用性 為保證實驗方法的適用性，結合本實驗室的實際情況，分別考察了流動相的比例（35∶65、40∶60、45∶55）、流動相pH 值（2.5、3.0、3.5）、檢測波長（275、193 nm，280、202 nm，285、207 nm）、流速（0.9、1.0、1.1 mL·min-1）、柱溫（25、30、35℃）、不同品牌色譜柱（Diamonsil C18、Waters Bridge C18、Capcell Pak C18）對實驗的影響。結果實驗條件在適當范圍內變化時，新康唑和達克羅寧與相鄰峰的分離度依舊＞1.5，且含量沒有變化，說明耐用性良好。

2.3.4 標準工作曲線 稱取空白樣品0.5 g（精確到0.1 mg）6 份，分別加入“2.2.1”項下混合標準儲備溶液適量，按“2.2.2”項下方法處理，得基質標準工作溶液系列，濃度分別為1、2、5、10、50、100 μg·mL-1。量取乙腈2 mL 6 份，同法操作，得標準工作溶液系列。按“2.1”項下色譜條件檢測，以濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標進行線性相關性分析（表1）。結果表明空白基質加標曲線相關系數更好，故本方法選擇空白基質加標制作標準工作曲線。

2.3.5 準確度 向空白基質中加入混合標準儲備液，按 “2.2.2” 項下方法處理，制成方法定量限（LOQ）、兩倍方法定量限（2 LOQ）和十倍方法定量限（10 LOQ）三種濃度的溶液，進行加標回收率實驗，結果見表2，不同添加水平均符合回收率試驗的要求。

表2 回收率考察測定結果記錄表（n=6）

2.3.6 精密度 選擇5 種典型的空白化妝品作為驗證基質進行重復性試驗，分別編號為空白樣品A（爽膚水）、B（凝膠）、C（潤膚霜?）、D（精華油）、E（潤膚乳?），被測組分添加水平同準確度中回收率試驗要求，結果均符合要求，見表3。將不同實驗室的數據進行統計分析，再現性的RSD 指標同樣符合要求。

表3 各空白樣品中2 種待測物質的精密度（n=6）

2.3.7 檢出限和定量限 以信噪比3∶1 為檢出限，信噪比10∶1 為定量限，本方法對2 種物質的檢出限情況及定量限見表4。

表4 定量限與檢出限

2.3.8 樣品含量測定 對市售的14 種樣品共計20批次化妝品進行檢驗，檢測結果見表5。結果有4 種化妝品違規添加達克羅寧和新康唑。

表5 樣品信息及測定結果

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

掃描新康唑和達克羅寧在190～400 nm 處的紫外吸收情況，新康唑在202nm 有最大吸收，達克羅寧在280nm 有最大吸收。因新康唑在280 nm 沒有紫外吸收，且達克羅寧在202 nm 吸收較小，所以選擇雙波長進行檢測。經實際樣品檢測驗證，可消除基質干擾，靈敏度滿足方法檢測需要。

3.2 色譜條件的選擇

3.2.1 流動相的選擇 參考相關文獻，在色譜柱相同，柱溫30℃，流速1.0 mL·min-1的條件下，本實驗分別選擇乙腈-水（50∶50）、甲醇-水（74∶26）、水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4調pH 值至3.0）-乙腈（40∶60）、水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4調pH值至3.0）-甲醇（40∶60），進行液相分離，實驗結果表明，選擇乙腈-水（50∶50）時,由于乙腈洗脫能力太強，達克羅寧在2.2 min 出峰，新康唑19.1 min 出峰，與雜質峰分離度不符合要求，且峰形較差。甲醇-水（74∶26）時，達克羅寧在7.3 min 出峰，新康唑31.1 min 出峰，其中達克羅寧響應低且峰形較差。以水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4調pH 值至3.0）為水相時，峰形較好。以乙腈為有機相時，峰形存在拖尾，且與相鄰雜質峰分離度不符合要求，以甲醇為有機相時，峰形較好，不存在拖尾現象，所以本方法選用甲醇作為有機相，以水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4調pH 值至3.0）為水相。

3.2.2 流動相pH 的選擇 考慮色譜柱的耐受性，結合實驗的實際情況，在相同液相色譜條件下，分別選擇pH 值為3.0、4.8、7.0 三個點作為考察對象，當pH=3.0 時的分離效果和峰形最好，故選用水相pH 值為3.0。

3.2.3 洗脫方式的選擇 本實驗考察了等度條件和梯度條件對實驗結果的影響。等度條件下水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4調pH 值至3.0）∶甲醇為30∶70 時，達克羅寧在4.0 min 出峰，新康唑在13.4 min 出峰，出峰時間較快，但與雜質峰分離度不符合要求；水（0.02 mol·L-1NaH2PO4，H3PO4調pH 值至3.0）∶甲醇為40∶60 時，達克羅寧在6.9 min 出峰，新康唑在40.6 min 出峰，雖然與雜質峰分離度符合要求，但是出峰時間較長。在分離度符合要求的基礎上，選擇梯度條件來縮短分析時間。

3.3 穩定性考察

選擇空白基質加標溶液，分別在0、2、4、6、8、10、12 h 時進樣，于0 h 比較峰面積變化＜2%，說明新康唑和達克羅寧在12 h 內穩定；分別在0、1、2、3 d時進樣，于0 h 比較峰面積變化，發現新康唑3 d 時峰面積變化＜2%，而達克羅寧在1 d 時峰面積變化＞2%，說明達克羅寧易降解。將空白基質加標溶液進行冷藏（2～10℃），分別在10、20、30 d 時進樣，于0 h比較峰面積變化均＜2%，說明新康唑和達克羅寧在冷藏條件下可保存30 d。含有達克羅寧的樣品建議在12 h 內完成進樣，或者選擇樣品盤可以控溫的高效液相色譜儀進行檢測。