連貫抗病毒顆粒的HPLC指紋圖譜研究及含量測定*

陸杰霖，郭曼曼，殷文娟，錢葉飛，汪 怡**

1昆山市中醫醫院，昆山 245347；2蘇州市藥品檢驗檢測研究中心，蘇州 215104

流行性感冒是流感病毒引起的一種急性呼吸道感染，在中醫學被稱為“時行感冒”，屬疫癘類（即傳染?。1]。醫院制劑連貫抗病毒顆粒由連翹、貫眾、香薷及青蒿組成，具有疏表達邪、清熱解毒之功效，治療病毒性感冒、支氣管炎、肺炎及病毒感染性疾病。連翹藥理結果表明，其具有抗甲型流感病毒作用，也有很好的抗呼吸道合胞病毒的作用[2-4]；綿馬貫眾能降低感染FM1 株流感病毒的小鼠肺指數，降低病毒引起的肺損傷[5]；香薷及青蒿也有相似的抗流感病毒活性，能減輕小鼠肺部的病變[6，7]。

目前，該制劑的質量標準僅檢測酸堿度、密度等，無法適應現代中藥制劑對質量控制的要求。本文采用HPLC 法建立連貫抗病毒顆粒的指紋圖譜，同時測定了制劑中咖啡酸、連翹酯苷A 及連翹苷的含量，提升院內制劑質量控制水平。

1 儀器與試藥

e2695 型色譜系統（美國沃特世公司）；BT25S型分析天平（德國賽多利斯公司）；KQ-500DE 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

咖啡酸（MUST-22062118）、蘆?。∕UST-22022507）、連翹酯苷A（MUST-22033105）、連翹苷（MUST-22042111）對照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司，純度均≥98%。10 批次連貫抗病毒顆粒均由昆山市中醫醫院制劑室提供，樣品編號（批號）分別為LG1（20211120）、LG2（20211125）、LG3（20220106）、LG4（20220120）、LG5（20220304）、LG6（20220501）、LG7（20220508）、LG8（20220707）、LG9（20220725）、LG10（20220801）。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 試液與條件

供試品溶液：取裝量差異下的本品，研細，取約2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加稀乙醇25 mL，稱重，超聲處理（功率600 W，頻率40 kHz）30 min，冷卻至室溫，再用稀乙醇補足失量，搖勻，高速離心，取上清液，過0.45 μm 有機濾膜，取續濾液。

對照品溶液：分別取連翹酯苷A、連翹苷、蘆丁、咖啡酸對照品適量，精密稱定，加稀乙醇配制成濃度 分別為4 938.13、3 386.88、133.40 和648.83 μg·mL-1的對照品儲備液。

色譜條件：YMC-Pack Pro C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相A 為乙腈，流動相B 為0.2%甲酸水，性線梯度洗脫（A∶B）：0 min（10∶90）→15 min（10∶90）→60 min（16∶84）→90 min（28∶72）→110 min（70∶30）；柱溫35℃；檢測波長280 nm。

2.2 指紋圖譜方法學考察

2.2.1 進樣精密度試驗 取編號LG8 樣品供試品溶液，連續進樣6 次，以連翹酯苷A 為參照峰，記錄并計算得各共有峰相對保留時間RSD ＜0.77%（n=6），相對峰面積RSD ＜4.98%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.2 重復性試驗 取編號LG8 樣品供試品溶液共6 份，進樣測定，以連翹酯苷A 為參照峰，記錄并計算得各共有峰相對保留時間RSD ＜0.97%（n=6），相對峰面積RSD ＜4.77%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.2.3 穩定性試驗 取編號LG8 樣品供試品溶液，于0、4、8、12、16、20 h，進樣測定，以連翹酯苷A 為參照峰，記錄并計算得各共有峰相對保留時間RSD ＜0.73%（n=6），相對峰面積RSD ＜4.80%（n=6），表明供試品溶液在20 h 內穩定性良好。

2.3 連貫抗病毒顆粒的HPLC 指紋圖譜建立

2.3.1 指紋圖譜建立 取10 批連貫抗病毒顆粒適量，按上述方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件進行測定，記錄色譜圖，將色譜圖導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2012 版）軟件中，將S1 設置為參照圖譜，時間寬度設定為0.10 min，采用中位數法，進行Mark 峰匹配，得到10 批HPLC 指紋圖譜疊加圖，見圖1。

圖1 10 批連貫抗病毒顆粒HPLC 疊加圖譜

2.3.2 連貫抗病毒顆粒相似度分析 使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 版）對10 批連貫抗病毒顆粒的色譜圖譜進行處理，計算各樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度。結果S1～S10 的相似度分別為0.985、0.992、0.976、0.963、0.948、0.999、0.953、0.987、0.924、0.964，10 批次制劑相似度均＞0.92，說明10 批連貫抗病毒顆粒指紋圖譜有較好的相似性，生產穩定性較好。

2.3.3 共有峰的標定與歸屬 對10 批樣品圖譜進行分析，其中連翹酯苷A 紫外響應明顯，色譜保留時間適中，且為處方中主要活性成分，故以其為參照峰（s），10 批次連貫抗病毒顆粒的13 個共有峰的保留時間及相對峰面積見表1。共標定了13 個共有峰，通過相對保留時間和紫外光譜與對照品一致的比較，指認出4 號峰為咖啡酸、6 號峰為蘆丁、8 號峰為連翹酯苷A，13 號峰為連翹苷，見圖2。

表1 10 批次連貫抗病毒顆粒各峰保留時間及相對峰面積（n=10）

圖2 連貫抗病毒顆粒指紋圖譜共有模式圖

分別取連翹、香薷、貫眾、青蒿單味藥，按照處方工藝制備單味藥對照品。按“2.1”項下方法制備單味藥對照品溶液，按“2.1”項下條件進行測定，記錄色譜圖，見圖3。將單味藥對照品與樣品圖譜進行比對，1、4、5、6、7、8、9、10、13 號峰來自于連翹；12 號峰為連翹、貫眾和香薷的共有峰；3 號峰來自于香薷；2 號峰和11 號峰為香薷和青蒿的共有峰。

圖3 連貫抗病毒顆粒色譜峰歸屬圖

2.4 連貫抗病毒顆粒中3 種成分含量測定

2.4.1 系統適用性試驗 精密吸取“2.1”項下制備的咖啡酸儲備液1 mL、連翹酯苷A 儲備液7 mL、連翹苷儲備液2 mL，置25 mL 容量瓶中，用稀乙醇定容，得混合對照品溶液；取編號LG8 的連貫抗病毒顆粒供試品溶液；精密吸取混合對照品稀釋液與供試品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，得到混合對照品HPLC 圖及連貫抗病毒顆粒HPLC圖，見圖4。結果顯示，咖啡酸、連翹酯苷A 及連翹苷之間分離度良好，理論塔板數均大于5000，分離度均大于1.5。

圖4 混合對照品溶液（A）和連貫抗病毒顆粒（B）HPLC 圖

2.4.2 線性關系 精密吸取“2.1”項下的咖啡酸儲備液1 mL、連翹酯苷A 儲備液7 mL、連翹苷儲備液2 mL，定容至10 mL，配制成儲備液，以稀乙醇稀釋配制成不同質量濃度的系列混合對照品溶液，（咖啡酸、連翹酯苷A、連翹苷質量濃度分別為5.19～64.88 μg·mL-1、276.54～3 456.69、54.19～677.38 μg·mL-1）。進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標，質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得到標準曲線，咖啡酸回歸方程Y=3.30X×104-1.10×103（r=0.9996），連翹酯苷A 回歸方程Y=9.94X×103+1.04×105（r=0.999 5），連翹苷回歸方程Y=6.50X×103+7.31×103（r=0.999 6），均與峰面積線性關系良好。

2.4.3 進樣精密度試驗 取線性曲線中間點的對照品溶液適量，按“2.1”項下條件，連續進樣6 次，測得各成分的峰面積，結果咖啡酸、連翹酯苷A、連翹苷峰面積RSD 分別為1.56%、1.51%、2.04%，表明儀器進樣精密度良好。

2.4.4 穩定性試驗 取編號LG8 連貫抗病毒顆粒供試品溶液，按“2.1”項下條件分別于0、4、8、12、16、20 h 進樣測定，記錄峰面積，結果咖啡酸、連翹酯苷A、連翹苷峰面積RSD 分別為0.61%，1.53%，2.26%，表明供試品溶液中咖啡酸、連翹酯苷A 及連翹苷在20 h 內穩定。

2.4.5 重復性試驗 取編號LG8 連貫抗病毒顆粒供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積并按標準曲線法計算樣品含量。結果供試品中咖啡酸、連翹酯苷A、連翹苷平均含量分別為0.3238、16.411 5、2.950 8 mg·g-1（n=6），RSD 分別為1.40%、1.54%、1.83%（n=6），表明該方法重復性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗 取編號LG8 連貫抗病毒顆粒6 份，每份2.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，各份分別加入咖啡酸、連翹酯苷A、連翹苷對照品儲備液1.25、8.50、2.25 mL，再用稀乙醇補足至25 mL，按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積并按“2.5.2”項下咖啡酸、連翹酯苷A 及連翹苷的對應標準曲線計算含量及回收率，結果連翹酯苷A、連翹苷、咖啡酸的平均回收率分別為97.55%、98.98%、97.37%、RSD 分別為2.38%、3.27%、1.92%，表明該方法的回收率良好，結果見表2。

表2 回收率試驗結果（n=6）

2.4.7 樣品含量測定 取10 個批次連貫抗病毒顆粒各2.5 g，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，按“2.1”項下條件進樣測定，記錄峰面積，通過回歸方程計算含量。結果10 批次連貫抗病毒顆粒中咖啡酸含量為0.271 1～0.342 8 mg·g-1，連翹酯苷A 的含量為13.22～18.05 mg·g-1，連翹苷的含量為2.432～3.540 mg·g-1。

3 結論

3.1 色譜方法考察

本實驗在建立連貫抗病毒顆粒HPLC 指紋圖譜的過程中，考察了乙腈、甲醇及不同種類、濃度的酸對樣品的分離效果影響，發現乙腈-0.2%甲酸水作為流動相時，基線平穩，各個峰之間分離效果最好，雜峰少，故選用乙腈-0.2%甲酸水作為最優指紋圖譜流動相條件。連貫抗病毒顆粒全波長掃描時，在280 nm 波長下，綜合色譜峰的響應值明顯，峰型較好，峰信息全面，能夠很好展現全方的化學成分特征，最終選擇280 nm 波長作為檢測波長。

3.2 結果分析

對10 批次連貫抗病毒顆粒進行指紋圖譜的聚類分析及主成分分析發現，基本聚為一類，表明10批次的連貫抗病毒顆粒制劑的質量具有良好的一致性。連翹作為方中君藥，連翹酯苷A 及連翹苷為其主要成分，連翹酯苷A 可抑制TLR4/NF-κB p65/NLRP3 信號通路改善宮內感染致新生大鼠肺損傷[8]，也能抑制哮喘小鼠的氣道炎癥反應[9]，連翹苷流感病毒株、人呼吸道合胞病毒、人腸道病毒71 型、人腺病毒3 型及人單純皰疹病毒均具有一定的抑制作用，且能明顯減輕間質性肺炎的肺部病變[10]。因此，本文建立的以連翹酯苷A、連翹苷和咖啡酸為指標成分的連貫抗病毒顆粒的指紋圖譜具有代表性。

連貫抗病毒顆粒來源于我院的名醫經方，在抗病毒性感冒、肺炎等病毒性感染方面，具有一定的療效。但我院自制制劑質量標準相對簡單，因此，本文采用HPLC 建立了連貫抗病毒顆粒的指紋圖譜，提高自制制劑的質量標準，全面反映連貫抗病毒顆粒質量的整體面貌，也為臨床使用提供穩定的產品。