連翹脂素通過抑制IL-17信號改善2,4,6-三硝基苯磺酸誘導的小鼠克羅恩病樣結腸炎

張紫凝,楊 子,張文靜,張小鳳,胡建國,5

克羅恩病(Crohn′s disease,CD)歸屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD),以復發性腸道炎癥為主要臨床表現[1-2]。CD具有發病機制不明、無法治愈以及致殘性等特點[3]。近年來,CD在我國的發病率呈現逐年升高趨勢,但其診療水平卻相對滯后[4]。當前可用于CD治療的臨床藥物如免疫抑制劑、糖皮質激素及生物制劑等均有不同程度的不良反應,且長期使用均存在安全性和有效性等問題[5-6],因此,面對日益增長的CD治療需求,更為安全、有效的新藥物亟待開發。近年來,天然植物提取物因其療效穩定、不易產生藥物抵抗和藥物依賴等優點引起了學術界的廣泛關注[7]。連翹脂素(Phillygenin,PHI)是一種從木犀科植物連翹中提取的天然小分子化合物。既往研究顯示,PHI可通過抑制核因子-κB(NF-κB)信號拮抗脂多糖誘導的巨噬細胞炎癥反應[8],同時還能夠激活過氧化物酶體增殖物激活受體-γ信號進而抑制肺上皮細胞的凋亡[9]。PHI拮抗炎癥、保護細胞等多種藥理學作用提示其可能具有改善CD腸炎的潛在價值?；诖?本研究首先觀察PHI干預對2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)誘導的CD模型小鼠結腸炎的作用效果,并進一步采用網絡藥理學和在體實驗共同分析其可能的分子機制,以期為CD臨床治療發掘新的有效藥物。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取18只6～8周齡,體質量(20±3)g的野生型(Wild type,WT;C57BL/6J背景)小鼠,購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。小鼠于無特定病原菌(specific pathogen free,SPF)環境下飼養,自由進食和飲水。本研究通過蚌埠醫學院動物研究倫理委員會的批準。

1.2 動物干預與分組 將WT小鼠隨機分成3組:對照組(WT組)、模型組(TNBS組)和PHI干預組(PHI組),每組6只。TNBS組和PHI組均接受TNBS造模處理,造模過程:采用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠(腹腔注射),待麻醉成功后,于小鼠肛門處涂抹石蠟油,將聚乙烯軟管與1 mL注射器連接后經肛門推注2.5%的TNBS乙醇溶液(5%TNBS與無水乙醇溶液1∶1混合)100 μL,并保持頭低足高位5 min[10]。PHI組小鼠在造模成功后給予PHI干預(20 mg·kg-1·d-1,灌胃),給藥時間持續7 d,WT組和TNBS組小鼠每日灌胃等量的0.9%氯化鈉溶液。造模后第8天處死小鼠,并采集結腸組織標本進行后續檢測。

1.3 小鼠腸炎臨床癥狀評估 采用疾病活動度指數(disease activity index,DAI)評估各組小鼠腸炎癥狀,評分范圍為0～5分,分值越高代表癥狀越重[11]。造模前后稱量各組小鼠體質量并計算變化量。取檢時測量各組小鼠結腸長度。

1.4 小鼠結腸炎癥組織學評估 收集小鼠結腸組織制備石蠟切片,行HE染色,并依據Spencer推薦的腸炎組織學評分量表評估各組小鼠結腸組織炎癥程度。分值范圍為0～4分,分數越高代表炎癥越重。

1.5 小鼠結腸黏膜炎癥介質水平檢測 刮取各組小鼠結腸黏膜組織,稱重后加入0.9%氯化鈉溶液制備組織勻漿,再經離心獲得上清液。采用酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測結腸黏膜組織中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)和干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)水平,實驗操作依據試劑盒說明書進行。

1.6 網絡藥理學預測PHI作用于CD的可能分子機制

1.6.1 CD疾病靶點、PHI藥物作用靶點及兩者交集靶點的獲取 從Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)和SuperPred(http://prediction.charite.de/index.php)數據庫獲取PHI潛在的作用靶點。從GeneCards(https://www.genecards.org)、DrugBank(https://go.drugbank.com)、TTD(db.idrblab.net)、PharmGKB(http-s://www.pharmgkb.org)和DisGeNet(https://www.disgenet.org/)數據庫獲取CD相關疾病靶點。利用VENNY(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)軟件繪制韋恩圖,去除重復值后,取疾病靶點和藥物作用靶點的交集,即為PHI作用于CD的潛在靶點。

1.6.2 PHI作用于CD靶點的GO和KEGG富集分析 采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)數據庫對上述獲得的潛在靶點進行基因本體(Gene-Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以預測PHI治療小鼠CD樣結腸炎的可能機制。

1.7 在體驗證PHI作用于CD的可能分子機制 采用免疫印跡實驗對各組小鼠結腸黏膜組織中IL-17、白細胞介素-17受體A(interleukin-17 receptor A,IL-17RA)以及NF-κB激活劑1(nuclear factor kappa B activator 1,Act1)表達水平進行檢測。使用RIPA裂解液裂解小鼠結腸黏膜組織,提取總蛋白后經BCA法測定蛋白濃度。用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,依次經轉膜、封閉、孵育一抗(IL-17、IL-17RA、Act1或β-actin)、TBST洗膜、孵育二抗、ECL顯色后使用凝膠成像系統進行曝光顯影。最后利用ImageJ軟件對蛋白條帶灰度值進行分析,并計算相對表達量。

1.8 統計學方法 采用t檢驗、方差分析以及q檢驗。

2 結果

2.1 PHI干預改善TNBS模型小鼠腸炎癥狀 通過對各組小鼠腸炎臨床癥狀進行評估發現:PHI組小鼠DAI評分低于TNBS組;PHI組小鼠體質量下降幅度、結腸縮短程度均低于TNBS組,高于WT組,差異均有統計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 各組小鼠腸炎癥狀比較

2.2 PHI干預改善TNBS模型小鼠結腸組織學損傷 基于HE染色對各組小鼠結腸組織進行病理學評分發現:PHI組小鼠結腸炎癥評分(1.67±0.52)分低于TNBS組(3.67±0.52)分(t=6.71,P<0.01)(見圖1)。

2.3 PHI降低TNBS模型小鼠結腸黏膜炎癥介質水平 ELISA檢測結果顯示:PHI組小鼠結腸黏膜炎癥介質水平(TNF-α、IL-6和IFN-γ)低于TNBS組,但仍高于WT組,差異均有統計學意義(P<0.01)(見表2)。

表2 各組小鼠結腸黏膜組織炎癥介質表達水平

2.4 網絡藥理學預測PHI治療CD的潛在作用靶點 從Swiss Target Prediction和SuperPred數據庫獲取PHI潛在的作用靶點,從GeneCards、DrugBank、TTD、PharmGKB和DisGeNet數據庫中獲取CD相關疾病靶點(見圖2A);去除重復值后,取疾病靶點和藥物作用靶點交集,得到交集靶點63個(見圖2B)。2.5 GO和KEGG富集分析 對上述63個交集靶點進行GO和KEGG富集分析,共得到1 072條目,包括生物過程(BP)119個、細胞組分(CC)38個,分子功能(MF)32個,其中生物過程主要涉及對炎癥反應的調控作用等(見圖3A)。KEGG通路富集分析共得到34條通路,包括癌癥通路、IL-17信號通路和趨化因子信號通路等。根據P值大小選取排名前20條通路進行可視化處理(見圖3B)。其中IL-17信號通路與CD的發生發展密切相關,故我們選擇IL-17信號通路進行后續的分子機制驗證。

2.6 PHI改善TNBS模型小鼠結腸炎可能與抑制IL-17信號有關 采用免疫印跡實驗對網絡藥理學預測結果進行在體驗證,結果顯示:PHI組小鼠結腸黏膜IL-17信號蛋白水平(TNF-α、IL-6和IFN-γ)低于TNBS組,但仍高于WT組,差異均有統計學意義(P<0.05～P<0.01)(見圖4、表3)。

表3 各組小鼠檢測信號蛋白水平比較

3 討論

本研究以TNBS誘導的結腸炎小鼠為研究對象,首先通過在體實驗證實PHI干預能夠改善TNBS模型小鼠腸炎臨床癥狀、結腸組織學損傷并抑制腸黏膜炎癥介質水平;進一步通過網絡藥理學預測和在體實驗驗證發現PHI改善TNBS模型小鼠CD樣結腸炎可能與抑制IL-17信號有關。

TNBS誘導的結腸炎小鼠是目前國內外較為公認且運用廣泛的CD動物模型,具有造模周期短、誘導成功率高及腸炎穩定等特點[12]。本研究首先通過在體動物實驗發現,PHI干預可顯著緩解TNBS小鼠DAI評分、體質量下降幅度以及結腸縮短等癥狀。以上結果初步證實PHI具有改善CD模型小鼠腸道炎癥的潛力。腸黏膜組織炎癥細胞浸潤是CD腸道重要的病理學改變[13]。本研究通過HE染色發現,PHI干預后顯著抑制了TNBS模型小鼠結腸黏膜組織中炎癥細胞的聚集和浸潤。同時,對小鼠結腸組織炎癥損傷程度進行量化發現,PHI組小鼠結腸組織病理學評分較TNBS組顯著降低。以上結果進一步證實PHI對CD模型小鼠結腸組織損傷具有改善作用。此外,通過ELISA檢測我們發現,PHI可顯著抑制TNBS小鼠結腸黏膜組織中TNF-α、IL-6及IFN-γ的水平。CD腸道炎癥反應主要由輔助性T淋巴細胞1和經典激活型巨噬細胞(M1型)介導,其可通過分泌TNF-α、IL-6及IFN-γ等促炎因子以直接損傷或誘發炎癥級聯反應等形式損傷腸道[14],因此,我們的實驗結果分別從腸炎臨床癥狀、組織病理學和分子層面共同證實PHI具有保護CD模型小鼠腸道炎癥的作用。

接下來,我們嘗試進一步探究PHI改善CD樣腸炎的可能分子機制。本研究首先通過網絡公共數據庫獲取PHI治療CD的交集靶點,并對其進行GO和KEGG富集分析。GO-BP富集結果顯示PHI主要參與炎癥反應的調控過程。既往報道顯示,PHI不僅可以保護小鼠足跖組織免受角叉菜膠的炎性損傷[15],還能通過調控TLR4/MyD88/NF-κB信號通路抑制脂多糖誘導的人肝星形細胞炎癥反應[16]。我們的研究發現PHI能夠顯著改善TNBS小鼠CD樣結腸炎,這不僅驗證了網絡藥理學的預測結果,還進一步拓寬了PHI發揮抗炎作用的疾病應用領域。同時,KEGG富集分析結果顯示,PHI改善CD樣結腸炎作用可能與IL-17信號通路有關。諸多研究表明,CD病人腸黏膜組織中IL-17水平升高[17]。IL-17是一種主要由Th17細胞分泌的促炎型細胞因子,其可與IL-17受體(IL-17RA)結合傳遞信號,導致細胞內NF-κB激活劑1(Act1)的募集[18]。Act1是IL-17及其受體家族信號傳導的關鍵蛋白,其可通過激活下游不同的信號通路從而誘導促炎介質(TNF-α、IL-6和IFN-γ)的表達[19]。最后,本研究采用免疫印跡實驗對各組小鼠結腸黏膜組織中IL-17信號通路關鍵蛋白進行檢測并發現,PHI能夠顯著抑制TNBS小鼠結腸黏膜組織中IL-17、IL-17RA以及Act1的表達水平,因此,IL-17信號可能在一定程度上解釋PHI改善TNBS小鼠CD樣結腸炎的作用機制。

本研究具有一定的臨床應用價值。CD是一種復發和緩解交替進行的慢性炎癥性疾病,手術切除病變腸管僅是權宜之計,采用藥物誘導或維持腸炎緩解是治療CD的主要手段[20]。然而,缺少更為安全、有效的治療藥物是當前CD臨床治療的主要短板[21]。我們的研究發現PHI可顯著改善TNBS模型小鼠CD樣結腸炎,提示其具有潛在的藥物開發價值,并有望為CD臨床治療藥物選擇提供參考。