激活CB2R抑制凋亡減輕肺缺血再灌注損傷的機制研究

馬 琪,黃 偉,李雪寒,王儒蓉

肺缺血再灌注損傷(lung ischemia-reperfusion injury,LIRI)是指肺組織在缺血缺氧一段時間后,當肺部血流恢復時發生肺功能損害的病理現象。LIRI是臨床上常見的并發癥,可對病人預后產生不良影響,當前仍缺乏有效的治療方法。LIRI是一個復雜的病理生理過程,涉及多種細胞及分子機制,仍有待進一步研究[1-2]。內源性大麻素系統存在于人體內多種器官組織中,如肺臟、心臟、肝臟和腦組織等,肺組織中的許多細胞類型都表達大麻素受體2(cannabinoids 2 receptor,CB2R)[3],內源性大麻素系統在LIRI過程中可能發揮著至關重要的作用。CB2R廣泛分布于外周免疫組織和細胞,與免疫炎癥反應密切相關[4-5],調節CB2R在治療疼痛、關節炎和癌癥等疾病中廣泛應用[6]。研究[7]結果表明,通過給予內源性大麻素降解酶抑制劑URB602可以增加小鼠內源性大麻素2-花生四烯酸甘油水平,減輕LIRI。2-花生四烯酸甘油主要通過激活CB2R發揮其生理功能,在心、腦、肝和脊髓等肺外器官中的研究顯示,激活CB2R能夠減輕因缺血缺氧導致的器官損傷[8-11],因此,我們推斷激活CB2R可能會減輕因缺血缺氧導致的肺組織損傷。本實驗基于C57BL/6小鼠LIRI模型,在肺缺血再灌注前給予高選擇性的CB2R激動劑JWH-133和拮抗劑AM-630,通過檢測氧合指數、肺濕干比、肺損傷和凋亡相關蛋白等指標,明確激活CB2R是否會通過影響細胞凋亡對缺血再灌注后小鼠產生肺保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選擇及分組 本實驗動物均為健康雄性、體質量20～25 g、6～8周齡的C57BL/6野生型小鼠,全部由四川大學動物實驗中心提供。所有小鼠隨機分為4組,假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、JWH133組和AM630+JWH133組,每組各12只。每組小鼠再隨機分為2個亞組,分別用于血氣分析和肺組織濕干比測定、肺組織病理學檢查和凋亡相關蛋白(Bcl-2、Bax、caspase-9)的檢測。

1.2 主要實驗器材 小動物呼吸機(美國,Harvard),小動物操作臺,電子天平(中國,沈陽龍騰),血氣分析儀(美國,雅培),LEICA切片刀(德國,Leica),24G靜脈留置針(德國,貝朗),一次性無菌注射器,無菌0.9%氯化鈉溶液,黑色醫用縫合線(慕絲),戊巴比妥鈉(德國,MErck),JWH-133試劑(美國,Cayman Chemical),AM-630試劑(美國,Sigma),Bcl-2抗體(美國,Proteintech),Bax抗體(美國,Proteintech),caspase-9抗體(美國,Proteintech),BCA蛋白濃度測定試劑盒(中國,碧云天)。

1.3 模型制備及指標檢測

1.3.1 麻醉方式 將C57BL/6小鼠稱體質量,然后放入鼠籠,通過在小鼠腹腔內注射1%戊巴比妥鈉60 mg/kg對其進行麻醉,麻醉效果每30 min評估一次,視情況單次追加戊巴比妥鈉5～10 mg/kg維持麻醉深度。

1.3.2 氣管插管及機械通氣 麻醉結束后,將小鼠妥善固定在小動物操作臺上,依次完成備皮、75%乙醇消毒氣管頸部區域、鋪無菌洞巾等步驟,用解剖刀沿正中切開小鼠頸部氣管,以24G靜脈留置針代替氣管導管插入小鼠氣管切口,置管深度為0.5～1.0 cm,然后連接HARVARDA小動物呼吸機進行機械通氣,使用縫合線固定留置針以防脫落或移位。機械通氣參數如下:吸入氧濃度21%(壓縮空氣),潮氣量8 mL/kg,呼吸頻率100次/分,吸呼比1∶2。

1.3.3 建立LIRI模型 根據本小組既往研究建立所需小鼠LIRI模型[12],氣管插管操作完成后常規消毒手術區域,沿小鼠左側胸骨旁3～4或4～5肋間切開,撐開器撐開并暴露左側肺門,雙肺通氣10 min后,腹腔注射500 U/kg肝素鈉進行抗凝,1%利多卡因注射液0.05～0.1 mL滴于肺門表面實施表面麻醉,5 min后調整呼吸機參數,潮氣量減為6 mL/kg、呼吸頻率增加為120次/分,吸呼比維持不變。使用微血管鉗夾閉小鼠左側肺門(包括左主支氣管和左肺動靜脈)。右肺進行單肺通氣(通氣參數同上)1 h后,松開血管鉗,使左肺恢復通氣和血流,然后把呼吸機參數重新調整至缺血前,對雙肺行肺復張后恢復雙肺通氣,左肺再灌注2 h。實驗進行過程中使用紗布覆蓋切口部位以防液體蒸發丟失,使用保暖毯對小鼠實施保溫,使小鼠直腸溫度維持于36～37 ℃。實驗結束時,在小鼠腹腔內注射超量(100 mg/kg)戊巴比妥鈉致死并采取標本。

1.3.4 標本的檢測 血氣分析:因C57BL/6小鼠體型較小,抽取外周血液操作困難,容易干擾檢測結果。在實驗結束后,我們采用開胸獲取小鼠左心室動脈血行血氣分析的方式計算氧合指數(PaO2/FiO2)。肺濕干比測定:在實驗結束時,取小鼠左肺放在濾紙上,擦干肺組織表面血跡,然后使用分析天平重復稱重3次,計算平均值記為總濕重,所得測量數值精確到小數點后1位。然后再把肺組織標本放置在烤箱(60 ℃)中烘干,48 h后每24 h稱量一次,直至標本重量恒定不變,記為總干重。肺組織濕干比=總濕重/總干重。肺組織病理學檢測:使用4 ℃預冷PBS溶液對小鼠肺組織進行灌洗,然后切取小鼠左肺中段相同位置約0.5 cm3大小肺組織放入甲醛溶液固定液中,固定24～48 h,然后依次完成脫水透明、浸蠟包埋、切片與貼片、脫蠟、蘇木精-伊紅(HE)染色及脫水程序后,將切片自然晾干并封片保存。本實驗采用美國胸科學會肺損傷病理學評分評估肺組織損傷程度,在顯微鏡下選取每張切片的4個400倍視野進行評分,其中肺泡上皮細胞至少占據每個視野的50%,主要由大氣管或血管腔構成的區域應當排除,然后計算平均值為所得分數。Bax、Bcl-2和caspase-9蛋白檢測:首先取C57BL/6小鼠肺組織樣本,加入RIPA裂解液后進行離心,取上清液提取肺組織總蛋白。然后采用BCA法測定樣本蛋白濃度,在樣本蛋白變性后依次進行電泳、轉膜、封閉、孵化抗體、顯色、曝光等程序,最后通過凝膠圖像分析成像系統進行掃描分析,分析結果以目標蛋白相對表達量表示。計算目標蛋白積分吸光度值與β-actin積分吸光度值的比值作為目標蛋白相對表達量。

1.4 統計學方法 采用單因素方差分析和q檢驗。

2 結果

與Sham組比較,I/R組小鼠氧合指數顯著降低,肺濕干比、肺損傷病理學評分、Bax和caspase-9蛋白表達水平均顯著增加(P<0.01),而Bcl-2蛋白差異無統計學意義(P>0.05),肺組織結構紊亂,鏡下可見透明膜和蛋白碎片形成,肺間隔顯著增厚,肺泡和肺間質中呈現出明顯的炎性滲出,同時伴有出血、肺水腫和肺不張;與I/R組比較,JWH-133組小鼠氧合指數明顯改善,肺濕干比顯著下降,肺損傷病理學評分明顯降低,Bax和caspase-9表達水平顯著降低,Bcl-2蛋白表達水平顯著增加(P<0.01),肺組織形態結構較前改善,光鏡下可見肺泡和肺間質中中性粒細胞少量滲出;AM630+JWH133組與JWH133組比較,小鼠氧合指數顯著降低,肺濕干比顯著增加(P<0.01),而與I/R組小鼠比較差異均無統計學意義(P>0.05);給予AM-630預處理后,JWH-133引起的上述病理學改變被逆轉,小鼠肺損傷病理學評分增高,Bax和caspase-9表達水平顯著增加,Bcl-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05～P<0.01)(見表1、圖1)。4組小鼠的凋亡相關免疫印跡見圖2。

表1 4組小鼠的各指標檢測結果

3 討論

當前較常用的LIRI模型有以下3類[13]:(1)離體模型,即切除單側肺后,將其離體灌注保存,肺組織完全缺血,無氣體交換,此模型在心肺移植研究領域應用較多;(2)手術過程中阻斷肺動脈,但保留主支氣管、肺靜脈和支氣管動脈,較多應用于肺動脈栓塞研究;(3)手術過程中將肺動脈、肺靜脈和主支氣管全部阻斷,使單側肺處于完全缺血缺氧的狀態,從而達到完全阻斷單側肺門的目的,該方式在外科手術中較多見。本實驗采用第3種方式來模擬術中阻斷肺門所致LIRI的病理生理過程,通過檢測多項肺功能學和形態學指標,我們觀察到缺血再灌注后I/R組小鼠肺氧合指數顯著降低,肺濕干比顯著增高,光鏡下可見肺組織結構紊亂,肺間質和肺泡中出現明顯的炎性滲出,伴有出血、肺水腫、肺不張、透明膜及蛋白碎片形成等病理改變,肺損傷病理學評分顯著增高,說明我們的肺I/R模型構建成功。

JWH-133和AM-630為研究CB2R較理想的試劑,二者分別為高選擇性的CB2R激動劑和拮抗劑[14-16]。CHENG等[17]對大鼠的研究發現,激活CB2R可減輕H2O2誘導的氧化應激損傷,抑制體內的炎癥反應;同時,DEFER等[18]研究發現,在缺血再灌注前給予JWH-133可顯著減輕缺血再灌注引起的心肌損害;CAKIR等[19]證實了使用JWH-133預處理可不同程度地降低缺血再灌注導致的腎功能損害;WANG等[20]研究結果顯示,在給予選擇性CB2R激動劑HU308 前,使用AM-630預處理逆轉了前者對小鼠心肌的保護作用。本研究采取缺血1 h、再灌注2 h的方案來構建C57BL/6小鼠LIRI模型,采用缺血前5 min腹腔內注射JWH-133(5 mg/kg)、使用JWH-133前30 min腹腔內注射AM-630(2 mg/kg)的方案驗證激活CB2R是否具有肺保護作用。

本研究中,缺血再灌注后小鼠肺氧合指數顯著降低,肺濕干比顯著增高,肺損傷病理學評分顯著增高。氧合指數反映肺換氣功能,肺濕干比可通過測定肺組織中的含水量反映肺水腫的程度。因此,缺血再灌注嚴重損害了小鼠的肺換氣功能,導致小鼠肺水腫的發生,同時引起凋亡相關蛋白caspase-9、Bax表達水平顯著增加。然而,在使用JWH-133激活CB2R后,小鼠的LIRI得到明顯改善。當我們在給予JWH-133前使用AM-630預處理,從而阻斷CB2R和JWH-133的作用時,研究結果顯示上述作用被逆轉,說明AM-630可消除JWH-133的肺保護效應,進一步證明JWH-133是通過激活CB2R而發揮了肺保護作用。

凋亡是細胞的一種死亡方式,可在缺血導致的低氧應激和再灌注損傷期活性氧生成時被激活[21]。缺血時間較短或輕微的再灌注損傷可以通過激活細胞生存機制,減少細胞活性氧的產生,從而減輕細胞損傷,但缺血再灌注損傷較嚴重時可能會導致細胞凋亡、壞死[22]。肺組織內皮細胞是缺血再灌注損傷的主要靶點,可導致嚴重的肺功能損害,肺移植過程中不可避免地會發生LIRI[23-24]。有研究[25]表明,在人體肺移植過程中,再灌注2 h內肺組織中即可出現大量凋亡細胞。再灌注前使用胱天蛋白酶抑制凋亡可明顯減輕肺移植術后的缺血再灌注損傷[26-27]。Bcl-2、Bax均為凋亡調節蛋白,是凋亡轉導通路中的主要靶分子,Bcl-2通過減少細胞色素C和凋亡誘導因子等的釋放,降低線粒體的通透性和減少內質網上Ca2+的跨膜流動發揮抑制細胞凋亡的作用,而Bax可促進細胞凋亡。caspase-9被稱為凋亡啟動子,處于信號轉導的上游,啟動子被激活后進而激活下游的凋亡執行蛋白caspase-3,后者介導最終的細胞死亡[28]。

HERRERA等[29]證實了CB2R通過神經酰胺依賴的線粒體內在途徑激活凋亡信號。同時,LI等[30]研究發現,在大鼠心肌缺血再灌注模型中使用JWH-133激活CB2R后,caspase-9和caspase-3表達減少,細胞色素C向胞漿釋放減少,減輕了心肌缺血再灌注損傷。還有學者[31]研究結果表明,小鼠體內CB2R缺乏可降低巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白/羥甾醇誘導凋亡的易感性。本實驗結果顯示,與Sham組比較,I/R組促凋亡蛋白caspase-9和Bax的表達水平明顯增加,凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達水平差異無統計學意義,說明缺血再灌注誘導了細胞凋亡的發生。腹腔內注射JWH-133預處理后,caspase-9和Bax表達顯著減少,Bcl-2表達顯著增加,提示JWH-133發揮了抗凋亡作用。給予JWH-133前使用AM-630預處理時,上述抗凋亡作用消除,表明JWH-133通過激活CB2R干擾Bcl-2、Bax和caspase-9蛋白的表達,抑制細胞凋亡。因此,細胞凋亡可能參與了CB2R激活所介導的肺保護作用。

本研究采用術中完全阻斷單側肺門的方法成功構建了C57BL/6小鼠LIRI模型,在小鼠腹腔內注射高選擇性CB2R激動劑JWH-133后可以抑制肺組織細胞凋亡,LIRI明顯減輕。然而,注射JWH-133前給予AM-630預處理可逆轉上述抗凋亡作用,因此,我們推斷激活CB2R可能通過抑制凋亡機制減輕小鼠LIRI。