豬繁殖與呼吸綜合征病毒結構蛋白和非結構蛋白研究進展

陳 旭,湯德元,曾智勇,王 彬,陳閶崢,羅 柳,袁盛林,廖正波

(貴州大學動物科學學院,貴州貴陽 550025)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)為動脈病毒科囊膜病毒家族,是一種有囊膜病毒粒子呈球型單股正鏈RNA病毒,PRRSV基因組全長約15 kb,包含10個以上開放閱讀框,可編碼參與病毒復制和轉錄的NSP1α、NSP1β、NSP2等至少12種非結構蛋白及GP5、M、N等8種結構蛋白。20世紀90年代初在歐洲和北美幾乎同時出現PRRSV,但兩種毒株基因組序列同源性只有約60%,因此PRRSV基因型被分為歐洲型(PRRSV-1)和北美型(PRRSV-2)。PRRSV感染豬群可引起以繁殖障礙和呼吸系統癥狀為特征的急性、高度傳染性疫病,給養豬業帶來嚴重危害。妊娠母豬染病后主要表現為繁殖障礙,妊娠前期的母豬流產,妊娠中期的母豬產下死胎、木乃伊胎、弱胎、畸形胎,哺乳母豬產后無乳。公豬感染后表現為性欲減弱、精液質量下降、射精量少等癥狀。仔豬染病后表現為呼吸困難,關節腫大,敗血癥等[1]。PRRSV主要感染豬單核細胞/巨噬細胞,如豬肺泡巨噬細胞(PAMs)和樹突狀細胞(DC),病毒在增殖過程中利用宿主細胞的物質合成自身結構蛋白、非結構蛋白及核酸,但成熟的病毒顆粒中只含有結構蛋白及核酸,非結構蛋白則與宿主受體結合參與病毒的轉錄和復制。PRRSV因其自身基因組特性及各種內外因素的影響,一直處于持續不斷的變異中,臨床呈現多毒株并存的局面,增加了疾病的防控難度,文章對從多個方面對PRRSV結構蛋白和非結構蛋白進行闡述,以期能對PRRSV作進一步的研究并制定防控PRRS的策略。

1 結構蛋白

目前已知的PRRSV結構蛋白由核衣殼蛋白(N)、基質蛋白(M)、包膜蛋白(E)和5種糖蛋白構成,PRRSV的ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6、ORF7開放閱讀框分別編碼這些結構蛋白。其中ORF5a存在于ORF4和ORF5之間,編碼GP5a 囊膜糖蛋白,ORF2a編碼GP2a蛋白,ORF2b編碼E蛋白,ORF3編碼GP3蛋白,ORF4編碼GP4蛋白,ORF5編碼GP5蛋白,ORF6編碼M蛋白,ORF7編碼N蛋白,這些結構蛋白與宿主細胞內特定細胞因子相互作用并介導PRRSV侵入易感細胞。

糖蛋白是病毒主要的表面抗原,它們與細胞受體相互作用觸發病毒感染,有些還介導病毒侵入宿主細胞。并且它還具有重要的受體結合位點和抗原表位,是疫苗研究的熱點,有研究表明,針對GP2a上B細胞表位的抗體可以抑制豬肺泡巨噬細胞(PAM)中的PRRSV復制[2]。宿主細胞表面的CD163蛋白具有介導病原體的內吞的作用,有研究開發了針對PAM CD163受體的單克隆抗體(mAb),使GP2a不能與CD163結合,從而部分阻斷PRRSV進入細胞,表明PRRSV GP2a在介導PRRSV進入易感宿主細胞時具有積極作用[3]。E蛋白是一種離子通道包膜蛋白,一方面E蛋白與α微管蛋白(α-tubulin)相互作用使微管解開,損壞細胞膜完成性,促進病毒進入細胞[4],另一方面E蛋白參與降低宿主細胞中的ATP水平,胞內低濃度ATP激活了半胱天冬酶-3(caspase-3)進而觸發細胞凋亡,在細胞水平上抵御病毒感染[5]。GP3蛋白與GP2a一樣能促進病毒進入細胞,缺失GP3蛋白的病毒顆粒不具有傳染性。GP4蛋白少量存在于PRRSV表面,具有高度可變性,能夠被宿主細胞的抗體識別誘發免疫反應。研究發現,GP4蛋白中抗體識別表位的氨基酸發生突變可以消除抗體識別,表明PRRSV通過操控GP4蛋白發生變異從而逃避宿主細胞的免疫檢測[6]。GP4的另一功能是與GP2a蛋白特異性結合作為PRRSV的附著蛋白,進而與CD163的相互作用,使病毒進入易感宿主細胞。GP5蛋白對于PRRSV在易感細胞內復制和組裝是不可或缺的,它參與病毒與宿主受體結合的過程。研究發現PRRSV GP5將宿主細胞中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)限制在細胞質中,并利用其糖酵解活性促進PRRSV復制[7]。非肌肉肌球蛋白重鏈9(MYH9)在細胞遷移和黏附中發揮重要作用,GP5蛋白與MYH9 C端結構域相互作用,使PRRSV病毒粒子被MYH9捕獲,促進病毒進入宿主細胞[8]。

M蛋白是PRRSV中最保守的膜基質蛋白且具有很強的抗原性,因此M蛋白也成為研發新型亞單位疫苗的候選蛋白。M蛋白不含已知的信號肽,它需要與GP5蛋白結合成二聚體,PRRSV依靠GP5/M復合體與硫酸肝素(HS)相互作用,才能有效黏附在細胞表面。M蛋白與位于細胞器及囊泡膜上的跨膜蛋白相互作用,用其在細胞內運輸和膜融合中的作用促進病毒粒子的移動[9]。

核衣殼(N)蛋白是一種多磷酸化蛋白,N蛋白合成后先磷酸化,再運送到細胞核,在整個病毒生命周期中表現出多種功能。N蛋白的基本功能是形成病毒衣殼以包裝病毒基因組。在N蛋白78 aa的絲氨酸突變為丙氨酸后可以下調病毒基因組和亞基因組RNA的轉錄水平,說明N蛋白突變可以顯著降低病毒在體外的復制效率[10]。N蛋白同時與宿主細胞的細胞質和細胞核上受體結合,并與許多宿主因子相互作用,影響病毒致病基因表達。N蛋白1-15aa區間是一個新的B細胞表位,宿主細胞產生的抗體可以與此抗原表位結合,從而抑制PRRSV在體內的復制[11]。

2 非結構蛋白

PRRSV的非結構蛋白由開放閱讀框ORF1編碼,包括ORF1a和ORF1b,它們分別編碼多聚蛋白pp1a和pp1ab。其中pp1a裂解成9個非結構蛋白NSP1a、NSP1β和NSP2-NSP8,pp1ab裂解成4個非結構蛋白NSP9、NSP10、NSP11、NSP12,這些非結構蛋白在病毒基因組的復制、轉錄和拮抗干擾素等過程中發揮重要作用。

NSP1蛋白是PRRSV感染期間合成的第1個病毒蛋白,編碼NSP1的基因序列高度保守,NSP1參與病毒基因組的復制和亞基因組mRNA的轉錄。NSP1蛋白被自身的木瓜蛋白酶樣蛋白酶(PLP)切割成NSP1α和NSP1β兩個亞基。Nsp1α的鋅指(ZF)結構域刺激白細胞分化抗原83(CD83)啟動子的分泌,CD83抑制了樹突狀細胞(MoDC)呈遞抗原并激活免疫應答的能力,造成宿主細胞的免疫抑制[12]。為進一步探索NSP1對宿主炎癥反應的影響,發現NSP1β蛋白可激活NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)介導的炎癥反應抵御病毒侵染,NLRP3是細胞質內重要的模式識別受體,參與炎性粒子組裝,激活炎癥信號通路,介導炎癥反應的發生和發展,相反,NSP1ɑ蛋白則抑制NLRP3炎癥小體活化,下調炎癥反應的發生,表明NSP1在促進或抑制機體炎癥反應方面也發揮作用[13]。NSP2蛋白是PRRSV中分子量最大的非結構蛋白,同時也是變異最大的非結構蛋白,其中N端木瓜樣蛋白酶(PL2)結構域具有去泛素化和拮抗干擾素功能,并抑制干擾素刺激基因15(ISG15)的抗病毒功能以阻斷先天性抗病毒反應,中心性高變(HV)結構域是PRRSV感染PAM的重要驅動因子,并有助于宿主產生抗體的識別,C端跨膜區(TM)結構域能夠抑制細胞蛋白翻譯。PRRSV NSP2TF能顯著下調豬白細胞抗原I類(SLA-I)在感染宿主細胞中的表達,SLA-I是激活CD8+T細胞進行抗原呈遞的重要因子,下調SLA-I表達意味著抑制宿主免疫應答,從而上調病毒感染能力[14]。NSP3、NSP5是內質網(ER)跨膜蛋白酶,它們誘導PRRSV在易感細胞內形成自噬體,成熟的自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體,然后降解自噬體內容物,最后降解的物質被釋放到細胞質中,轉化為氨基酸和能量完成細胞質內代謝過程[15]。此外,NSP5還可作為Janus激酶/轉錄活化因子3(JAK/STAT3)通路的抑制因子,影響下游基因的轉錄、促炎細胞增殖、分化、凋亡過程以及先天免疫應答[16]。NSP4是一種3C樣絲氨酸蛋白酶(3CLSP),負責大多數非結構蛋白的加工。此外,NSP4與感染細胞內其他成分相互作用,以維持PRRSV在感染細胞內的復制存活。研究發現,NSP4激活促凋亡蛋白(Bim)表達使感染細胞凋亡,被釋放出來病毒再感染其他易感細胞,加重宿主感染[17]。豬mRNA脫帽酶1a(pDCP1a)能刺激IFN分泌,PRRSV NSP4可以下調pDCP1a表達,抑制宿主細胞對PRRSV的防御[18]。PRRSV NSP6作用于宿主信號通路,并調控宿主炎癥反應的發生。黏膜相關淋巴瘤易位基因1(MALT1)是活化NF-κB的信號轉導通路中的重要信號分子,NSP6在轉染后24 h可通過泛素化-蛋白酶體途徑抑制MALT1編碼蛋白的表達,進而抑制NF-κB信號分子激活,降低下游促炎細胞因子的表達,部分阻斷炎癥反應的發生[19]。PRRSV NSP7由基因組中相對保守的區域編碼,具有較強的免疫原性,目前,對它研究的相關報道較少,但可以確定的是它確實影響病毒的復制周期,而具體作用機制仍有待探究。NSP8是NSP9的N末端延伸,因此NSP8的功能可能與NSP9的功能有很大關聯[20]。

PRRSV NSP9是一種RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp),參與形成病毒的復制和轉錄復合物(RTC)。宿主細胞的其他蛋白能夠與NSP9蛋白相互作用,對病毒復制產生負性調控作用。CCCH型鋅指抗病毒蛋白(ZAP)能抑制PRRSV早期復制,有研究提出ZAP與NSP9相互作用進而發揮抑制作用[21]。核苷酸結合寡聚結構域樣受體X1(NLRX1)是參與免疫防御和炎癥反應的關鍵介質,NSP9與NLRX1相互作用來抑制PRRSV的復制[22]。PRRSV解旋酶(NSP10)是具有易位和解旋活性的多功能蛋白,對病毒RNA合成起著至關重要的作用。有研究針對PRRSV NSP10設計單克隆抗體(mAb 4D9)用來區分PRRSV-1和PRRSV-2,試驗表明mAb 4D9可以識別PRRSV-2 NSP10,但不能識別PRRSV-1 NSP10,表明NSP10可作為PRRSV-2的標志性蛋白,以便宿主細胞產生的抗體與之結合發揮免疫效應[23]。NSP11具有核糖核酸內切酶活性,對于病毒基因組復制和亞基因組的合成是必需的。此外,NSP11的過度表達可以提高PRRSV的滴度,具有抑制受感染宿主先天免疫系統等功能[24]。宿主p21基因編碼的內源性蛋白能抑制PRRSV復制,PRRSV感染后NSP11可引起p21降解并促進病毒在MARC-145細胞中的復制[25],PRRSV 感染后NSP11被宿主細胞干擾素調節因子9(IRF9)識別并被抑制表達,同時激活轉錄因子復合物IFN刺激基因因子3(ISGF3)的形成和核易位,從而阻斷IFN-I信號傳導以拮抗宿主先天性抗病毒反應[26]。PRRSV NSP12參與PRRSV亞基因組mRNA(sgmRNA)的合成,若是NSP12中35位與79位半胱氨酸發生聯合突變則影響NSP12參與病毒sgmRNA的合成[27]。此外,PRRSV NSP12通過調節細胞因子參與病毒感染,RING指蛋白114(RNF114)可作為PRRSV復制的抑制因子,RNF114通過介導NSP12的K27多聚泛素化修飾,促進NSP12經蛋白酶體途徑降解,使病毒復制受到抑制[28]。核細胞素α 6(KPNA6)的降解不利于PRRSV復制,PRRSV感染后NSP12阻斷了KPNA6的泛素-蛋白酶體降解,使KPNA6的半衰期延長,為宿主細胞中PRRSV復制提供保障[29]。

3 PRRSV結構蛋白和非結構蛋白對宿主信號通路的影響

為了在宿主細胞中成功存活并持續性感染,PRRSV利用復雜的信號通路抑制或逃避宿主的先天性和適應性免疫系統,并改變宿主某些基因表達從而更好的實現病毒侵入的過程。PRRSV感染其結構蛋白與非結構蛋白能夠激活許多信號通路,觸發下游的趨化因子、轉錄因子和炎性細胞因子的激活,以調節病毒的復制和增殖,例如抑制炎癥細胞因子的表達,調節白細胞介素-10(IL-10)的生成以抑制免疫反應;干擾免疫細胞的功能,抑制IFN-Ⅰ的生成,最終導致受感染者出現病毒血癥和持續感染。

屬于絲裂原活化蛋白激酶家族的細胞外信號調節激酶(ERK)介導PRRSV感染期間炎癥反應的發生。研究表明,PRRSV-2 NSP1能夠阻斷ERK信號傳導,下調ERK下游轉錄因子血清核轉錄因子激活蛋白-1(AP-1),進一步抑制能增加促炎細胞因子產生的細胞通信網絡因子1和結締組織生長因子2(ccn1和ccn2)的轉錄,抑制宿主的炎癥反應的發生[30]。免疫系統中淋巴細胞的生長和分化依賴于細胞因子,酪氨酸蛋白激酶(JAK)/ 轉錄激活因子(STAT)信號通路激活多數細胞因子以發揮免疫學效應,IFN通過激活JAK/STAT信號通路誘導多種基因的表達,在宿主抗病毒反應中起著至關重要的作用,而STAT2在JAK/ STAT信號傳導中是必不可少的。研究發現NSP11的N端域負責誘導STAT2降解,從而拮抗干擾素誘導其下游信號傳導的發生,抑制宿主的先天免疫反應。另外,STAT3蛋白在細胞生長,增殖,分化,免疫和炎癥反應中起著關鍵作用,研究發現,PRRSV感染會導致宿主細胞中STAT3蛋白表達水平顯著降低,PRRSV NSP5通過提高STAT3多泛素化水平并將其半衰期從24 h縮短到3.5 h來加速STAT3降解,導致免疫細胞因子和炎癥因子被抑制,從而實現病毒在宿主細胞中復制和傳播[31]。CD83是樹突狀細胞(DC)分泌的可負反饋調節DC免疫功能的細胞因子,因此CD83是一種抗炎和免疫抑制介質,研究發現PRRSV NSP10和E蛋白通過核因子kappa B(NF-κB)和特異性糖蛋白1(Sp1)信號通路強烈刺激DC中的CD83的表達,進而造成宿主免疫抑制,利于病毒的存活[32]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是單核細胞分泌的一種促炎細胞因子,可被蛋白激酶C(PKC)活化,PRRSV E蛋白可激活 PKCδ,促進機體炎癥反應的發生[33]。PRRSV N蛋白被發現能夠通過NF-κB和p38 MAPK途徑參與上調IL-10的表達,使免疫細胞介導的抗原呈遞和免疫反應受到抑制,對感染機體內的PRRSV起到保護作用[34]。近年來,高致病性豬藍耳病受到廣泛關注,豬感染了高致病性藍耳病病毒(HP-PRRSV)后發生高熱,有研究提出這是因為機體產生的前列腺素E2(PGE2)增加從而使豬發生高熱,而PGE2的產生與環氧合酶2(COX-2)的表達密切相關。NSP2與14-3-3蛋白(GRF)家族相互作用激活細胞外調節激酶1(MEK1)-ERK1/2-CAAT增強子結合蛋白β(C/EBPβ)信號通路以增強COX-2表達,從而促進PGE2的產生,使患病豬發生高熱[35]。無論是PRRSV的結構蛋白還是非結構蛋白,都能影響宿主信號傳導,對宿主免疫機制發揮正性或負性調控作用。

4 PRRSV結構蛋白和非結構蛋白檢測技術

PRRSV感染的豬康復后可長期帶毒,且不定期排毒,若引種了帶毒豬可導致PRRSV在豬群中的傳播和流行,因此必須加強引種豬的快速篩查,避免引進陽性豬造成PRRSV的擴大和流行。當前商品化疫苗對PRRSV的預防作用有限,仍需通過生物安全措施進行防控,早期檢測,及時淘汰陽性豬,降低規?；i場感染PRRSV的幾率。近年來,以PRRSV結構蛋白和非結構蛋白作為抗原開發的檢測方法層出不窮,其中報道最多的當屬核衣殼蛋白(N)作為標記抗原以此來檢測PRRSV特異性抗體。

N蛋白是構成PRRSV病毒粒子的3種主要結構蛋白之一,具有強抗原性,是診斷或監測機體產生病毒特異性抗體的合適靶標。豬感染PRRSV后最早產生的是針對N蛋白的抗體,有研究建立一種基于N 蛋白的間接ELISA 方法,該方法與美國賽默飛世爾科技ELISA試劑盒相比,其特異性和靈敏度分別為 76.18%和82.61%,可用于大型血清學調查[36]。20世紀80年代開發的免疫層析試紙(ICST),因其簡單易行、操作快捷、成本低廉等優點,已被用于各種動物疾病的快速監測。有研究開發一種以膠體金納米顆粒標記的PRRSV-1和PRRSV-2 N蛋白作為捕獲抗原,在PRRSV感染早期檢測機體中PRRSV特異性抗體的ICST檢測方法,該方法用兩種類型的N蛋白作為抗原可提高PRRSV的診斷性能[37]?；谌槟z微球的ICS測試,用乳膠微球標記的PRRSV N蛋白特異性單克隆抗體作為標記探針,檢測宿主體內PRRSV病毒粒子,可用于在現場進行PRRSV的快速診斷[38]。除了用結構蛋白N作為標記抗原建立的檢測方法外,用PRRSV非結構蛋白NSP1α開發了一種基于熒光素酶連接的抗體捕獲測定(LACA),將NSP1α與Rellina熒光素酶底物結合并轉入基因克隆的質粒中,將質粒轉染到T細胞中進行瞬時表達后裂解細胞,將細胞裂解物與豬血清形成的抗原-抗體復合物加入包被有蛋白質G的微孔板上,通過測量熒光亮度值,檢測PRRSV特異性抗體,開發了一種熒光素酶免疫沉淀系統,用于快速檢測臨床樣品是否被PRRSV感染[39]。

5 小結

PRRSV結構蛋白主要作用在于與宿主膜蛋白互作,其中GP2a、E、GP3、GP4參與病毒進入細胞的過程;GP5不僅參與病毒侵入細胞還促進對病毒的復制;M蛋白則參與病毒粒子的移動,將病毒粒子從內質網運輸到高爾基體,參與病毒釋放;N蛋白與宿主細胞因子結合調控病毒的復制和宿主炎癥反應。PRRSV非結構蛋白主要影響病毒的復制,其中NSP1、NSP4、NSP11通過與宿主細胞因子相互作用抑制細胞內IFN-I的產生,下調宿主炎癥反應的發生;NSP2能抑制ISG15的抗病毒功能;NSP9和NSP10都作為病毒感染后宿主識別的靶標,參與抑制PRRSV在細胞內復制,另外NSP11與NSP12與宿主細胞因子作用,抑制免疫反應促進病毒復制,然而NSP12通過阻斷KPNA6降解過程對病毒復制產生抑制作用,因此這些非結構蛋白的存在對病毒的復制增殖并不是絕對有利的。此外,PRRSV某些結構蛋白和非結構蛋白作用于宿主信號通路,同樣能對病毒感染產生影響。如ERK-Ap-1信號通路、JAK/STAT信號通路、MEK1-ERK1/2-C/EBPβ信號通路。PRRSV 的N蛋白、NSP1α蛋白、NSP7蛋白也作為特異性抗原被用來檢測PRRSV特異性抗體,開發了以ELISA、免疫層析檢測為代表的檢測方法,為實現臨床疑似PRRSV感染豬的樣品鑒定及提前防控提供參考方法。隨著分子生物學和分子免疫學的飛速發展,我們需要對PRRSV的基因組結構及其編碼的蛋白有更加全面的認識,了解PRRSV的免疫機制,研制更有效安全的疫苗仍是防控PRRS的主要目標。