寄生性原蟲影響宿主上皮細胞凋亡研究進展

吳善博,邵天人,張雅芳,李娟鋒,孫露露,邊嘯坤,王榮軍

(河南農業大學動物醫學院,河南鄭州 450046)

細胞凋亡(apoptosis)又稱程序性細胞死亡,對維持細胞內環境穩態至關重要[1]。凋亡的發生是信號分子通過多種信號通路將信息傳遞至細胞內,激活關鍵信號靶點從而誘導細胞凋亡[2]。細胞凋亡途徑主要包括死亡受體介導的外源性途徑、線粒體介導的內源性途徑、顆粒酶/穿孔素介導的途徑以及內質網應激介導的途徑[3]。凋亡途徑涉及一系列基因的激活、表達及調控,如半胱氨酸蛋白酶(caspase)、凋亡抑制蛋白(IAPs)的激活,microRNAs、Bcl-2家族基因的表達調控等,最終使細胞發生凋亡[4-6]。

研究表明,腸道寄生性原蟲可誘導宿主上皮細胞發生凋亡,如隱孢子蟲(Cryptosporidium)感染誘導人膽管上皮細胞(H69)發生凋亡;十二指腸賈第蟲(Giardiaduodenalis)誘導人回盲腸癌細胞(HCT-8)發生凋亡;芽囊原蟲(Blastocystis)感染誘導大鼠小腸隱窩上皮細胞(IEC-6)凋亡等[7-9]。隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲和芽囊原蟲等腸道寄生性原蟲通過誘導或抑制宿主上皮細胞凋亡,從而達到利于自身發育的目的,可見寄生蟲的生長、發育、感染與宿主細胞凋亡有著重要聯系[10-12]。寄生性原蟲感染宿主腸道時,其腸道屏障被破壞導致腸道穩態紊亂,這時機體可通過調節凋亡機制以維持腸道穩態平衡,而這種穩態平衡更是寄生蟲-宿主相互作用的結果[12-13]。為進一步探索凋亡機制在寄生蟲-宿主間的作用,論文主要對隱孢子蟲、十二指腸賈第蟲和芽囊原蟲誘導上皮細胞凋亡機制做一綜述。

1 隱孢子蟲

隱孢子蟲是全球分布的重要人畜共患原蟲,寄生于人和多種動物的胃腸道上皮細胞中。目前已發現47個有效種,感染人類的蟲種約20個,其中以微小隱孢子蟲(C.parvum)、人隱孢子蟲(C.hominis)最為常見[14-16]。微小隱孢子蟲可通過改變關鍵緊密連接和黏附連接蛋白的表達來破壞腸上皮屏障功能,引起宿主腹瀉[17]。

隱孢子蟲主要通過死亡受體/配體(Fas/FasL)和腫瘤壞死因子相關凋亡誘導受體/配體(TRAI/TRAIL)途徑調控宿主上皮細胞凋亡[7,18-19]。將微小隱孢子蟲感染的H69細胞和未感染的Fas敏感的人T淋巴細胞白血病細胞(Jurkat E6-1)共培養24 h,Jurkat E6-1細胞凋亡率增加,免疫細胞化學技術和共聚焦顯微鏡檢測表明微小隱孢子蟲增加FasL的遷移率,誘導其裂解為可溶性FasL,而通過半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抑制劑與Fas/FasL中和抗體的作用可抑制該凋亡途徑,表明微小隱孢子感染可以依賴Fas/FasL途徑的自分泌和旁分泌方式誘導H69細胞發生凋亡[7]。另一研究顯示,微小隱孢子蟲感染HCT-8細胞后使護骨素(OPG)表達上調,通過不同濃度TRAIL和OPG重組蛋白處理細胞可阻斷TRAIL途徑誘導的凋亡并減少蟲體感染量[18]。

PI3K/AKT信號通路和NF-κB信號通路調控微小隱孢子蟲誘導宿主上皮細胞凋亡。微小隱孢子蟲更易感染營養不良的C57BL/6小鼠,且被感染小鼠體重明顯下降;caspase-3蛋白表達量降低,對caspase-3蛋白免疫染色,表明凋亡細胞發生于腸絨毛頂端;微小隱孢子蟲感染營養不良小鼠后,可激活PI3K/AKT信號通路,從而抑制caspase-3活性和細胞凋亡,進而增加宿主感染負荷[20]。微小隱孢子蟲感染細胞激活NF-κB系統,并且伴隨白介素-8(IF-8)的分泌;而抑制劑MG-132和SN50可抑制NF-κB與DNA結合和降低IF-8的分泌,但顯著促進了微小隱孢子蟲誘導H69細胞凋亡;結果表明微小隱孢子蟲誘導細胞凋亡受NF-κB的影響,當NF-κB被抑制時,微小隱孢子蟲誘導細胞凋亡能力增加[21]。文獻[19]研究結果與此一致,微小隱孢子蟲通過抑制NF-κB進一步增加腸上皮細胞凋亡,將微小隱孢子蟲體外感染HCT-8細胞,并加入誘導凋亡藥物進行試驗,微小隱孢子蟲顯著降低了這些藥物誘導的細胞凋亡作用,表明隱孢子蟲可減弱促凋亡因子誘導凋亡的作用,以利于自身的增殖發育。

Bcl-2基因家族、Survivin基因、及microRNAs等參與調控微小隱孢子蟲感染誘導的宿主上皮細胞凋亡。隱孢子蟲在感染HCT-8細胞早期(6～12 h)抗凋亡基因表達上調,促凋亡基因表達下調;感染后期(24～72 h)促凋亡基因表達上調,抗凋亡基因表達下調;而沉默Bcl-2基因后,細胞凋亡增加,表明Bcl-2基因家族調控微小隱孢子蟲感染誘導的宿主上皮細胞凋亡[22]。另一研究表明,微小隱孢子蟲體外感染HCT-8細胞可誘導抗凋亡蛋白家族基因Survivin表達上調,從而抑制caspase-3、caspase-7活性,使細胞凋亡減弱;但沉默Survivin表達后,細胞凋亡又明顯增加,蟲體數量減少;表明微小隱孢子蟲感染期間可通過調節Survivin表達,以抑制細胞凋亡促進蟲體自身發育[23]。

微小隱孢子蟲感染H69細胞后通過下調miR-513表達從而促進程序性死亡配體-1(B7-H1)表達;與微小隱孢子蟲感染的H69細胞共培養的Jurkat細胞凋亡率明顯增加;使用B7-H1中和抗體或轉染miR-513過表達前體后Jurkat細胞凋亡被部分阻斷,表明miR-513介導B7-H1的表達參與調控隱孢子蟲感染上皮細胞凋亡[24]。微小隱孢子感染細胞后通過miR-942-5p靶向調控干擾素誘導蛋白27(IFI27)的表達進而通過TRAIL途徑影響細胞凋亡,從而調控微小隱孢子蟲的內生發育;即感染前期下調IFI27的表達量,抑制細胞凋亡進而促進蟲體發育;后期上調IFI27的表達量,促進細胞凋亡而抑制蟲體發育[25]。Wang等[26]研究微小隱孢子蟲感染早期HCT-8細胞發現一些microRNA表達水平發生顯著變化,功能預測分析結果顯示Hsa-miR-18b-3p、Hsa-miR-3976等與細胞凋亡也有一定的聯系,這對為進一步研究microRNAs調控隱孢子蟲感染誘導細胞凋亡的機制提供新理論基礎。

2 十二指腸賈第蟲

十二指腸賈第蟲是寄生于人和多種動物十二指腸內的一種機會性致病原蟲。該蟲具有A-H共8種集聚體,其中A和B被認為是人獸共患集聚體,可感染人和多種哺乳動物;集聚體C和D常見于犬科動物,而集聚體E在蹄類動物中最為常見[16,27]。生活史僅有滋養體和包囊兩個階段,包囊可長期在環境中生存,使十二指腸賈第蟲在宿主間的傳播更為廣泛,從而增加了人類食源性和水源性感染的風險,感染者主要表現為腹瀉、腹痛、腹脹等臨床癥狀[28-29]。

研究表明,十二指腸賈第蟲感染引起腸上皮細胞緊密連接蛋白Claudin 1表達下調,進而導致腸上皮屏障功能障礙,引起吸收不良和慢性腹瀉,并誘導腸上皮細胞凋亡[30]。將蟲體與一種新型未轉化的人十二指腸上皮(SCBN)細胞共培養,結果表明賈第蟲以依賴caspase方式增加細胞膜通透性,同時破壞胞質緊密黏連蛋白ZO-1,并誘導腸上皮細胞發生凋亡[31]。十二指腸賈第蟲感染HCT-8細胞可誘導Bax表達上調、Bcl-2表達下調,并激活內、外兩種途徑依賴于caspase級聯反應誘導細胞凋亡[8]。

腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)信號通路調控十二指腸賈第蟲誘導的上皮細胞外源性凋亡。十二指腸賈第蟲滋養體與人克隆結腸腺癌細胞(Caco-2)共培養可降低Caco-2細胞活性;通過高通量測序技術(RNA-seq)分析表明,一些凋亡相關基因和去泛素酶基因的表達發生了顯著性變化,而滋養體感染Caco-2細胞后可通過上調腫瘤抑制因子(CYLD)表達,進而激活TNFR1通路和受體相關蛋白(RIP1)的K63泛素化,從而激活caspase-3和caspase-8信號通路,誘導Caco-2細胞發生外源性凋亡[32]。

十二指腸賈第蟲可通過活性氧介導上皮細胞發生線粒體內源性凋亡。在體外將十二指腸賈第蟲WB蟲株和Caco-2細胞共培養,通過熒光顯微鏡、透射電鏡、流式細胞儀和Western blot等技術對細胞凋亡水平進行檢測,結果表明十二指腸賈第蟲滋養體通過刺激細胞產生活性氧(ROS),并通過調節細胞內相關凋亡因子Bax和Bcl-2的表達,引起線粒體外膜通透性增加,線粒體膜電位(MMP)下降和細胞色素C(Cyt-C)的釋放;從而激活caspase-9和caspase-3,促使DNA修復酶(PARP)裂解,最終引起線粒體介導的內源性凋亡[33]。

環氧化酶-2(COX-2)作為抗凋亡啟動子并激發潛在因子調控十二指腸賈第蟲感染誘導的腸上皮細胞凋亡。研究表明,十二指腸賈第蟲體外感染腸上皮細胞后通過抑制COX-2活性從而降低細胞活性;增加ROS生成并減少NO的釋放,促進caspase-3激活和PARP裂解,抑制Survivin等抗凋亡蛋白的表達從而促進IEC細胞凋亡,而COX-2過表達則抑制IEC細胞凋亡;進一步研究表明,p38/ERK/AKT/NF-κB信號通路可調控十二指腸賈第蟲感染過程中COX-2介導的ROS和NO生成和抗上皮細胞凋亡作用,并且COX-2介導的抗上皮細胞凋亡作用與Toll樣受體4(TLR4)依賴的p38-NF-κB信號通路激活有關[34]。

十二指腸賈第蟲不同蟲株誘導宿主上皮細胞凋亡水平存在差異。Chin等[31]使用賈第蟲NF、S2、WB和PB蟲株分別感染十二指腸上皮細胞并加入Caspase-3抑制劑(Z-DEVD-FMK),其中NF和S2蟲株可誘導細胞凋亡,而WB和PB蟲株未誘導細胞凋亡,表明不同蟲株誘導胃腸道上皮細胞凋亡能力有所不同,此結果與新生大鼠感染十二指腸賈第蟲引起小腸損傷具有蟲株依賴性的研究結果一致[35]。賈第蟲感染不局限于誘導細胞凋亡,還會引起一些促炎癥因子的釋放,甚至改變腸上皮細胞基因表達的變化等[36]。

3 芽囊原蟲

芽囊原蟲是一種寄生于人和動物腸道的厭氧性單細胞原生生物,其形態結構較復雜,可分為包囊型、空泡型、顆粒型等形態,但目前對該蟲生活史了解尚不明確[37-38]。芽囊原蟲可與其他寄生蟲共感染,如隱孢子蟲、賈第蟲和阿米巴原蟲等;其感染與其他疾病的發生有一定聯系,如肺結核、艾滋病和其他慢性疾病等[39]。盡管目前對芽囊原蟲的生物學、遺傳多樣性和流行病學有了一定的認識,但其致病力仍存在爭議。有關芽囊原蟲在體內外的研究表明,其不僅能引起腸道緊密連接蛋白的降解和腸道膜通透性的改變,還能誘導細胞炎性因子的釋放、以及腸道細胞的凋亡等[40-42]。

芽囊原蟲感染引起大鼠腸上皮通透性增加,并誘導腸上皮細胞凋亡從而破壞腸屏障功能[43]。研究證明,鼠源芽囊原蟲WR1蟲株以非接觸方式誘導IEC-6細胞凋亡[9],并且重新排列纖維狀肌動蛋白(F-actin)的分布、降低上皮間電阻并增加上皮通透性。值得注意的是,該研究顯示抗原蟲藥物甲硝唑可消除鼠源芽囊原蟲WR1蟲株對上皮屏障功能作用的影響,表明該藥物對芽囊原蟲引起的腸道疾病具有一定的治療潛力[9]。

芽囊原蟲感染小鼠進行體內試驗,與未感染組相比,感染組小鼠腸道細胞乳糖酶活性降低;免疫組化試驗表明感染組小鼠腸道細胞炎癥細胞因子TNF-α水平降低、Bax表達上調,Bcl-2表達下調,結果表明芽囊原蟲通過TNF-α相關途徑誘導小腸上皮細胞凋亡,從而降低乳糖酶活性[44]。

芽囊原蟲不同蟲株誘導宿主上皮細胞凋亡的能力有所差異。用分離出的不同亞型芽囊原蟲株(ST4和ST7)與Caco-2細胞共同培養[45],用流式細胞術檢測Caco-2細胞早期凋亡的變化,免疫組化技術和共聚焦顯微鏡觀察芽囊原蟲感染Caco-2細胞不同時期ZO-1連接蛋白的重組情況,以及用蛋白印跡法對相應凋亡蛋白分子檢測,結果表明ST7蟲株可激活caspases-3和caspase-9,而未激活caspases-8,并引起上皮間電阻、上皮通透性和緊密連接蛋白ZO-1分布的改變,用caspases抑制劑Z-VAD-FMK處理后檢測發現,可顯著性抑制以上變化,結果表明芽囊原蟲誘導上皮細胞凋亡,并且引起細胞屏障的改變[45]。ST7蟲株可誘導Caco-2細胞凋亡,而ST4蟲株不可以,表明芽囊原蟲在致病性方面表現出宿主特異性和蟲株間的差異[46]。深入研究芽囊原蟲感染宿主期間誘導細胞凋亡的機制和與宿主間的相互作用關系,對研發該病原引起的腸道性疾病的治療藥物具有一定的作用。

4 展望

寄生性原蟲誘導宿主上皮細胞凋亡是寄生蟲與宿主共進化過程中形成的重要調控機制之一,影響寄生蟲在宿主體內的發育以及疾病的發展過程。絕大數寄生性原蟲調控宿主細胞凋亡機制尚不清楚,一些關鍵技術性問題限制了凋亡機制的相關研究,如隱孢子蟲等一些寄生性原蟲未有穩定的動物感染模型,對隱孢子蟲進行遺傳操作尚存在一定的困難。因此,未來在解決技術瓶頸基礎上,利用體內外試驗探索寄生性原蟲感染誘導宿主細胞凋亡的調控機制,揭示參與調控細胞凋亡的一些關鍵蛋白分子的作用機制以及宿主非編碼RNA的調控機制,為設計開發抗寄生蟲性原蟲病藥物和疫苗等提供新策略。