蛋白乙?；揎棇ι抽T氏菌感染作用的影響

狄傳遠,付道斌,陳 晨,劉 偉*

(1.揚州大學獸醫學院,江蘇揚州 225009;2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心,江蘇揚州 225009)

沙門氏菌(Salmonella)屬腸桿菌科人獸共患革蘭氏陰性菌,其感染可以引起人和動物的傷寒、副傷寒、胃腸炎和敗血癥,還可以造成懷孕母畜發生流產,導致畜禽死亡,還會因畜禽生長遲緩、產量下降等原因造成重大經濟損失。沙門氏菌也是人類食物中毒的主要病原之一,具有重要的公共衛生學意義[1]。目前,已確認2 500多個沙門氏菌血清型,據估計每年沙門氏菌會引起9 300萬例腸道感染,導致15.5萬人死亡[2]。沙門氏菌致病性是由于大量毒力相關因子相互作用的結果從而導致機體感染,而這些與沙門氏菌毒力相關的因子主要分布在毒力島、毒性質粒和菌毛等。沙門氏菌毒力基因存在其染色體和質粒中,在沙門氏菌染色體中編碼毒力相關基因的特定區域被稱為沙門氏菌致病島(Salmonellapathogenicity island,SPI),含有許多與毒力相關的基因,還編碼與細菌侵襲力直接相關的Ⅲ型分泌系統(type Ⅲ secretion system,T3SS)[3]。T3SS是一種針狀結構,將效應蛋白注入宿主細胞質基質。SPI-1參與沙門氏菌入侵非吞噬細胞,而SPI-2則與沙門氏菌在宿主吞噬細胞中的生存和增殖有關[4]。當沙門氏菌通過受污染的水或食物進入宿主時,它們會侵入宿主的胃腸上皮,并釋放由SPI編碼的效應蛋白。這些細菌效應物會改變宿主肌動蛋白細胞骨架的結構,從而激活宿主的信號轉導途徑,導致宿主上皮細胞的細胞膜增大和皺折。這種改變的宿主細胞會以吞噬細胞的形式吞噬沙門氏菌,隨后由細胞膜組成的液泡將沙門氏菌包圍[5]。

沙門氏菌在從口腔到小腸的過程中會遇到各種環境變化,包括溫度、pH、滲透壓、營養物質的變化,以及宿主免疫反應的生化變化。而沙門氏菌則使用一個雙組分系統來調節與其毒力和生存相關的基因的表達,從而適應環境變化。這個雙組分系統由識別外部信號的組氨酸激酶和起轉錄調節作用的反應調節器組成。當組氨酸激酶被自動磷酸化時,這些磷酸化基團隨后被轉移到反應調節器上。磷酸化的反應調節器隨后被激活并與DNA結合以調節蛋白轉錄[6]。細菌可以通過適當地調節轉錄和翻譯來識別和適應變化的環境。然而,細菌的響應性適應是耗時和耗能的。相對而言,翻譯后修飾可以更快地調節細菌的生理功能。

翻譯后修飾(PTMs)是蛋白質中氨基酸殘基共價修飾的生化機制。質譜等新的試驗技術幫助確定了大量的PTM位點,并揭示了各種修飾的重要性。目前,已鑒定出200多種不同類型的翻譯后修飾,包括從小的化學修飾(例如磷酸化和乙?；?到添加完整的蛋白質(例如泛素化)。對于某一種蛋白質,不同的PTM可以組合在一起,它們的開關狀態在不同的條件下會有所不同,從而微調它們的活性、定位以及與其他蛋白質的相互作用。

賴氨酸是一種帶有疏水側鏈的兩親性殘基,具有一個正電荷的N?基團。賴氨酸的?；饔弥泻土税被恼姾?可能會改變蛋白質的構象。目前已鑒定出多種?；?但是研究最多的賴氨酸?；揎検且阴；?。這種修飾首先在組蛋白上被發現。后來,更多的真核非組蛋白被鑒定可以發生乙?；?。這些乙?；瘏⑴c細胞代謝、細胞周期、衰老、生長、血管生成和癌癥[7]。相比之下,原核生物中的乙?；芯枯^少,有限的研究主要集中在少數微生物物種上。在這篇綜述中,我們主要集中在蛋白質翻譯后修飾方式之一乙?；c沙門氏菌感染的關系。

1 沙門氏菌中的賴氨酸乙?；到y

沙門氏菌有兩種類型的蛋白質賴氨酸乙?；到y。第1種是酶系統,其中蛋白質賴氨酸殘基被蛋白質乙酰轉移酶(protein acetyltransferase,Pat)乙?；痆8]。GNAT(gcn5-related N-acetyltransferase)家族是重要的賴氨酸乙酰轉移酶(lysine acetyltransferase,KATs)之一,是大多數細菌KATs的組成部分[9]。Pat屬于GNATs家族,以乙酰輔酶A為底物。它的首次報道發現Pat與依賴NAD+的去乙?；窩obB一起調節乙酰輔酶A合成酶的活性[10-11]。第2種類型的蛋白質賴氨酸乙?；w系依靠乙酰磷酸(acetyl phosphate,ACP)的非酶反應。ACP是參與Pta-AckA途徑的高能中間體,可以提供磷酸基和乙?；鵞12]。通過敲除AckA基因獲得的ACP過量的突變體與通過同時敲除Pta和AckA基因獲得的ACP生產缺陷的突變體之間的比較表明,ACP可以乙?；S多蛋白質[9]。

2 乙?；€態對細菌耐酸性的影響

一般情況下,腸道病原體鼠傷寒沙門氏菌必須在胃的強酸性環境中生存,直到它們能夠進一步侵入腸道上皮和其他器官,包括脾臟和肝臟。耐酸性對于巨噬細胞內細菌的生存和復制是必要的,而破壞參與酸反應調控的基因則會導致細菌毒性的衰減。因此,沙門氏菌對酸性環境的感知和反應能力對其毒力和致病作用至關重要。酸脅迫可以全面下調乙?；?RNA轉錄組圖譜顯示,酸脅迫信號可能通過調控Pat的轉錄和細胞內NAD+/NADH的比例來降低乙?；?。該研究構建了沙門氏菌株的Pat突變體和CobB突變體,與野生型菌株在對數期和生長靜止期比較耐酸性相比,酸脅迫的突變菌株中會下調Pat的正調節因子基因CyaA和Crp的轉錄水平,同時與酸脅迫下的野生型菌株和CobB缺失株相比,Pat突變株的細胞內pH更穩定,并顯示出更高的存活率[13]。這些研究表明,較低的乙?；接欣谠鰪娚抽T氏菌的耐酸性,并提示乙?；赏ㄟ^促進耐酸性來調節病原在腸道中的毒力水平。

3 乙?；{節沙門氏菌致病性島1(SPI-1)調節因子HilD的活性和穩定性

沙門氏菌通過表達SPI-1編碼T3SS-1基因以穿透宿主上皮細胞。在T3SS-1基因中,SPI-1編碼關鍵的轉錄調節因子,如HilD、HilA和InvF。HilD是一種AraC型顯性調控因子,不僅影響HilA的轉錄,還影響SPI-1以外的許多基因的轉錄[4,14]。研究表明,乙?；投玖χg關系的其他直接證據是來自沙門氏菌Pat缺失株的毒力表型[15]。Pat的缺失減少了SPI-1的表達,降低了沙門氏菌對HeLa細胞的侵襲,并削弱了沙門氏菌在巨噬細胞內的復制。在小鼠模型中,盡管CobB缺失株似乎沒有毒力缺陷,但與野生型相比,Pat缺失株的毒力有所減弱。乙?；嚓P的毒力調節可能是由在SPI-1內占據調控級聯的頂端位置的關鍵轉錄調控因子HilD介導的。此外,Pat對HilD的乙?；Ｕ狭薍ilD的穩定性,這對SPI-1的激活是必不可少的。賴氨酸297(K297)是Pat的底物殘基,位于HilD的螺旋-轉角-螺旋基序中。有研究證明K297的乙?；鰪娏薍ilD的穩定性,但降低了它與DNA結合的能力。與K297去乙?；纳抽T氏菌相比,K297乙?；纳抽T氏菌在HeLa細胞中的侵襲性減弱,在小鼠模型中的毒力減弱,這表明K297的去乙?；瘜ι抽T氏菌的毒力是必不可少的[16]。因此,賴氨酸殘基K297的乙?；日{節了HilD的蛋白穩定性,又調節了其與DNA的結合能力。這種新的調控機制維持了細胞中適量的HilD的數量和活性,因為大量的HilD不利于細菌在宿主細胞內的生長,而適當的去乙?；腍ilD保證了其與DNA的結合活性,從而提高了細菌的致病性。然而,乙?；{節HilD的穩定性的潛在機制仍未被完全闡明。

4 乙?；{節Phop/PhoQ的活性以影響毒力基因的表達

細菌使用多種雙組分系統來識別外部環境信號,并調節各種基因的表達以適應這些信號。其中雙組分系統PhoP/PhoQ是由位于細菌細胞膜上的組氨酸激酶PhoQ和在細胞質中發揮作用的反應調節因子PhoP組成[6]。在宿主巨噬細胞中,當細胞膜上的PhoQ組氨酸激酶接收到低鎂離子濃度、酸性應激和抗菌肽等信號時,它會自磷酸化并被激活。隨后自磷酸化的PhoQ會引起細胞質中的PhoP響應調節器的磷酸化。磷酸化的PhoP通過與靶基因啟動子結合來啟動轉錄,以促進RNA聚合酶的募集,調節約5%的鼠傷寒沙門氏菌基因的轉錄[17]。已知PhoP/PhoQ系統可調節諸如鼠疫耶爾森氏菌、銅綠假單胞菌以及沙門氏菌等革蘭氏陰性病原體毒力基因的表達[18-20]。而PhoP/PhoQ在發揮作用時受到各種因素的影響,例如在弱酸條件下RNA伴侶CspC會促進PhoP的激活[21];甲基轉移酶CheR通過對PhoP的甲基化負調控來調節其活性[22];抑制蛋白 EIIANtr通過干擾 PhoP 與 DNA 的結合來阻礙 PhoP對其調節基因的激活[23]。此外,一項沙門氏菌PhoP的研究表明乙?；谏抽T氏菌毒力中起著重要作用。PhoP可以分別被Pat和CobB乙?；腿ヒ阴；?。尤其是位于PhoP 羧基端DNA結合域的賴氨酸201(K201)能夠被Pat乙?；?。當沙門氏菌處于低濃度Mg2+、酸脅迫環境或由于宿主細胞吞噬而出現在巨噬細胞中時,PhoP的K201乙?；窖杆傧陆?。當沙門氏菌缺失Pat基因后,PhoP與DNA的結合活性增加。此外,與野生型菌株相比,用谷氨酰胺替代賴氨酸201殘基來模擬乙?；癄顟B可降低細菌的致病性[24]。這些結果表明PhoP的 DNA結合域的賴氨酸乙?；种屏似渑cDNA的結合活性,從而抑制了其對沙門氏菌致病基因表達的促進作用。

有研究表明,無論在革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌中,PhoP受體結構域中的賴氨酸102殘基(K102)都是保守的。但在富含乙酰磷酸(ACP)的條件下,鼠傷寒沙門氏菌的PhoP中共有5個賴氨酸殘基可以乙?；?其中包括賴氨酸102。該殘基的乙?；磻蕾囉贏CP的劑量,而不依賴于Pat和CobB。當賴氨酸102殘基被乙?；瘯r,PhoP在體外不被磷酸化。同時模仿非乙?；问降腜hoP K201R突變體,發現PhoP能夠與DNA結合,并上調PhoP和PhoP靶基因。在用精氨酸取代PhoP K201和K102的菌株中,PhoP和PhoP靶基因的轉錄減少[17,24]。因此,可以認為ACP介導的PhoP K102乙?；?通過終止PhoP活性所必需的PhoP磷酸化來降低沙門氏菌毒力基因的表達。研究發現,PhoP 的一個高度保守的賴氨酸殘基K88可以被ACP而非Pat特異性乙?；?這削弱了PhoP的二聚體形成并抑制其與DNA結合的能力,從而影響PhoP的活性并導致沙門氏菌毒力的減弱[25]。這些研究都表明沙門氏菌的毒力可以被在PhoP的賴氨酸殘基處的乙?；绊?而且未來可能會發現更多的賴氨酸殘基位點影響沙門氏菌的毒力。

5 某些轉錄調節因子的賴氨酸乙?；瘜ι抽T氏菌毒力的影響

鼠傷寒沙門氏菌中的Lon蛋白酶可以引起入侵蛋白的水解和毒力的負調節。Lon是一種應激誘導的依賴ATP的蛋白酶,是HilD的負調控因子[26]。并且有研究通過質譜分析發現,HilD的賴氨酸23、34和132位點是部分乙?；?而HilD的賴氨酸297是完全乙?；?。此外,用谷氨酰胺取代HilD的賴氨酸297(模擬乙?；问?會影響沙門氏菌對HeLa細胞的入侵,導致HilD與DNA的結合活性存在缺陷[16]。因此,乙?；腍ilD無法與DNA結合從而降低沙門氏菌的毒力,但Lon蛋白酶是否參與到HilD的乙?；^程來調節入侵蛋白的水解和毒力還有待進一步探索。

還有其他轉錄因子,如Lrp和RcsB也受到乙?；挠绊慬27-28]。Lrp是一個全局性的調控因子,大概參與大腸埃希氏菌10%的基因表達。在鼠傷寒沙門氏菌中,它調節編碼Ⅰ型菌毛的薄膜操縱子,會刺激細菌和腸道細胞之間的結合,從而促進其致病性[29]。有研究證實鼠傷寒沙門氏菌的Lrp在體外可以分別被Pat和CobB乙?；腿ヒ阴；?乙?；稽c是其DNA結合域的螺旋-轉角-螺旋(HTH)基序中的第36個賴氨酸(K36)殘基。它的乙?；种屏似渑cDNA的結合,減少了Lrp調控基因(菌毛)的轉錄,從而削弱了沙門氏菌的致病性。RcsB是一種反應調節因子和轉錄因子,通過與RcsC和RcsD形成一個雙組分系統來調節腸桿菌科的基因轉錄[30]。當細菌收到外部信號時,RcsC發生自磷酸化;然后RcsC上的磷酸基通過RcsD傳遞到RcsB。磷酸化的RcsB與其共激活子RcsA或轉錄因子BglJ和GadE形成一個同源二聚體或多個異源二聚體,以控制150多個大腸埃希氏菌基因[30]。有研究證實位于與DNA結合的HTH基序中的RcsB的第180個賴氨酸(K180)殘基被沙門氏菌乙酰轉移酶Pat和大腸埃希氏菌同系物YfiQ乙?；?并在體外被CobB去乙?；?。但Pat對RcsB 上的K180的乙?；强赡娴?可以改變DNA結合活性,從而影響相關毒力基因表達[31]。這些乙?；稽c的發現進一步解釋了沙門氏菌感染后毒力調節的機制,說明這些修飾位點是相關藥物研制的重要參考。

6 展望

在包括沙門氏菌在內的許多細菌中,乙?；且环N翻譯后動態修飾過程,可以控制蛋白質的酶活性、亞細胞定位、蛋白質之間的相互作用、蛋白質的穩定性以及DNA結合活性。賴氨酸乙?；歉鞣N乙?；问街醒芯孔钌钊氲?。本文從其對蛋白質功能影響的角度,綜述了賴氨酸乙?；瘜ι抽T氏菌基因表達的調控及其毒力的影響。由于酸性環境對沙門氏菌的毒力和致病作用很重要,所以在對由沙門氏菌引起的相關疾病的治療中可以根據這一特點來抑制其生長,但是在酸性環境中沙門氏菌是否還會通過非酶途徑來影響自身的耐酸性還有待進一步探索。另外,無論是依賴于Pat還是依賴于ACP的賴氨酸乙?；寄芤种葡嚓P蛋白質活性從而影響其致病性。通過以上的分析發現細菌毒力是一個非常復雜的表型,這其中涉及到多種因素,無法通過單個的蛋白質翻譯后修飾來解釋。未來的研究可能會發現其他調節毒力因子活性的翻譯后修飾。

目前,一些與毒力相關的蛋白質,包括PhoP和HilD,已經被證明可以發生乙?；?。這些研究表明蛋白質乙?；诩毦玖χ衅鹬匾淖饔?。然而,還需要更多的研究來揭示蛋白質乙?；瘜毦玖Φ挠绊懞吞剿飨嚓P修飾位點與其致病性的關系,并解釋蛋白質乙?；{節細菌毒力的潛在機制,為今后研究治療由沙門氏菌引起相關疾病的藥物提供理論支撐。