重組酶聚合酶擴增技術在動物疫病診斷中的應用研究進展

胡清霞,李 穎,張琰杰,呂 妮,李 鵬,楊增岐,王興龍*

(1.西北農林科技大學動物醫學院,陜西楊凌 712100;2.農業農村部反芻動物重大疫病 防控重點實驗室(西部),陜西楊凌 712100;3.陜西省銅川市新區坡頭街道辦事處,陜西銅川 727000)

動物疫病病原菌檢測方法主要有傳統鑒別方法和分子生物學方法等,聚合酶鏈反應(PCR)以其特異、靈敏、便捷等優點被廣泛應用于各類疾病診斷[1]。但是目前PCR以及后來發展的熒光定量PCR、數字PCR等技術在動物疫病診斷中存在著依賴昂貴儀器設備、專業人員及檢測時間長等局限,不適合疾病暴發時現場快速檢測。近幾年來,恒溫核酸擴增技術解決了以上問題,其中重組酶聚合酶擴增(RPA)技術可在25～42℃條件下進行快速核酸擴增,無需控溫設備,操作簡單,且其特異性、靈敏度與PCR相當甚至高于PCR[2]。被認為是最可能替代PCR的檢測技術,做到真正走出實驗室,在資源匱乏的偏遠地區實現現場快速檢測。

1 RPA反應原理

1.1 反應原理

RPA反應是以T4噬菌體復制為主要反應機理,主要依賴單鏈DNA結合蛋白(SSB),能結合單鏈核酸的重組酶(UvsX)和鏈置換DNA聚合酶[3]。反應體系包括引物、模板DNA、ATP、醋酸鎂、水、聚乙二醇、UvsY蛋白(T4噬菌體重組調節蛋白)、二硫蘇糖醇及Mg2+等。重組酶在ATP、UvsY蛋白的參與下與引物結合形成蛋白-DNA復合物,再在雙鏈DNA中尋找同源序列后,復合物插入雙鏈DNA形成D-環結構。D環的一側是雙鏈,其中引物與模板鏈雜交,啟動鏈交換反應,而D環的另一側與單鏈DNA蛋白結合[4]。重組酶從復合物中水解出來,引物在鏈置換DNA聚合酶作用下從3′端開始延伸,對模板上的目標區域進行擴增,新生成的DNA鏈被用于另一輪RPA。

1.2 RPA引物、探針設計

引物設計是RPA檢測技術中極為重要的一環,30～35 bp是最適引物長度,比PCR引物長。在RPA檢測中,引物過短會使反應靈敏度和速度下降;引物過長易導致非特異性增加形成引物-二聚體[5]。RPA引物設計時堿基含量為30%～70%,過高過低會導致鏈交換速率緩慢;應注意5′端不要連續出現鳥嘌呤,且最好設計有胞嘧啶;在3′端引物序列不匹配會導致RPA工作效率降低,所以3′端設計時最好選擇鳥嘌呤和胞嘧啶。為使RPA擴增效果最佳,其擴增子長度最好為100～200 bp[6]。若要構建熒光定量RPA和LFD-RPA (側流層析試紙條)檢測方法,需要設計專門的探針進行高靈敏度擴增子檢測,長度46～52 bp,在引物設計時留下足夠空間。其中熒光團和淬滅團標記在胸腺嘧啶上,間距1～5 bp,兩者中間以四氫呋喃(THF)取代一個核苷酸,3′端需要用阻斷基團(如C3 spacer)進行修飾封閉[7]。熒光定量RPA可用與RPA技術兼容的exo探針,側流層析試紙條法常用nfo探針。

1.3 RPA的檢測方法

1.3.1 凝膠電泳 用瓊脂糖凝膠電泳檢測RPA擴增產物,即基礎RPA。在進行凝膠電泳前,由于擴增產物中的蛋白質阻礙電泳成像,導致拖帶形成,在擴增產物中加入酚和氯仿抽提取乙醇沉淀純化后再電泳[8],在操作過程中減少開蓋,分區操作減少氣溶膠污染,其他操作同PCR。

1.3.2 實時熒光定量RPA 在基礎RPA上,實時熒光定量RPA加入了核酸外切酶Ⅲ和exo熒光探針,收集熒光信號實時監測目的基因拷貝數。如非洲馬瘟病毒的熒光定量RPA快速檢測方法[9],雖然非洲馬瘟還未傳入我國,但建立高效快速的檢測方法是必要的。

1.3.3 側流層析試紙條 RPA-側流層析試紙條(lateral flow dipstick,LFD)是將RPA與LFD結合檢測擴增產物,與基礎RPA相比,加入了核酸外切酶Ⅳ、nfo探針及帶生物素標記的下游引物。LFD是基于側流層析技術、免疫學技術和膠體金技術制備的一種試紙條,主要由樣品墊、檢測線和質控線組成,擴增產物用LFD檢測可肉眼觀察到結果,降低了操作人員的專業要求,如對豬流行性腹瀉病毒的快速診斷研究[10]。還有電化學生物傳感器、電化學轉導、比色反應、橋聯絮凝分析、硅微環諧振器光子檢測等方法也可以用于RPA擴增產物的檢測[11]。

2 RPA檢測技術在動物疫病診斷中的應用

2.1 RPA在豬疫病診斷中的應用

2.1.1 病毒類 非洲豬瘟的臨床癥狀及病理變化與豬瘟、豬丹毒、沙門氏菌等疾病相似,需要實驗室特殊診斷才能確診,且該病毒基因型較多,變異能力強,目前尚無可靠疫苗,因此快速檢測對其防控非常重要。有研究建立一種改進的實時熒光RPA檢測非洲豬瘟病毒(ASFV),可在39℃、30 min內實現對ASFV P72基因核酸提取、擴增和判定,最低檢測限為 10 拷貝/μL,靈敏性比PCR高。從PCR到改進的RT-RPA,靈敏度從2×103copies升高至10 copies,該方法采用室溫裂解法可取代傳統核酸提取方法,能直接用于RPA擴增,降低了樣品處理時間和成本,同時該研究建立的RT-RPA對實驗儀器的兼容性強,擴大了應用場地范圍[12]。對MGF360-12L基因建立的RPA檢測方法靈敏性為1×103copies,與熒光定量PCR檢測相近[13]。對豬圓環病毒2型建立了一種RPA方法結合側流層析試紙條的可視化(LFS-RPA)檢測技術,該方法基于PCV2cap基因特異性保守序列設計了RPA特定引物和nfo探針,39℃擴增20 min,再用側流層析試紙條檢測擴增產物,短時間內實現豬圓環病毒臨床樣品的可視化快速檢測,檢出限為10 copies,其靈敏性比環介導恒溫核酸擴增(LAMP)方法高10倍,而實時熒光PCR在檢測病毒核酸含量較低的臨床樣品時,效果優于RPA檢測[14]。也有RPA對豬瘟[15]、豬細小病毒[16]、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒[17]等病毒的檢測病毒,都是采用實時熒光RT-RPA檢測方法,檢測限分別達到70重組質粒、300重組質粒、70重組質粒?？梢奟PA技術與實時熒光方法結合檢測擴增產物的方法趨于成熟,具有實時監測擴增產物的優點,但相比于與凝膠電泳和側流層析試紙條兩種檢測方法,實時熒光不適合終點檢測。RPA與凝膠電泳方法結合即與PCR最為類似,稱為基礎RPA,如對豬德爾塔冠狀病毒的檢測,檢出限可達103拷貝/μL[18]。

2.1.2 細菌類 豬大腸桿菌病包括仔豬水腫、仔豬白痢、仔豬黃痢病3種。針對stx基因用RPA結合圓盤式微流控芯技術快速檢測產類志賀毒素大腸埃希氏菌(STEC),該方法可在39℃ 20 min內實現高通量檢測,在人工污染品檢測中,其按照ISO 16140標準計算,未出現假陽性或假陰性結果[19]。針對大腸埃希氏菌O157的rfbE基因研究開發了一種RT-RPA和LFS-RPA,LFS-RPA檢出限為3.5×102fg/μL,比RT-PCR和RT-RPA高出10倍[20]。在實用性驗證中,RT-RPA和LFS-RPA都在15 min內獲得陽性結果,而RT-PCR需要28～45 min,說明RPA檢測方法實用性好、特異性高、靈敏快捷,可用于資源有限的地區作現場檢測。

2.1.3 寄生蟲與支原體 豬是旋毛蟲易感染人,旋毛蟲幼蟲包囊對外界抵抗力較強,日常烹飪如熏烤、腌制、煎炒等一般不能將其殺死。建立一種快捷、靈敏特異的檢測方法有利于對豬旋毛蟲的防控。針對旋毛蟲的rrnS保守基因序列設計引物及探針建立了RPA-LFD檢測方法,檢出限可達100個DNA[21]。豬肺炎支原體病也是危害養豬業發展的重要疫病之一,對其mhp165保守基因建立了實時熒光RPA和RPA-LFD兩種檢測方法,檢出限可達5.0×102fg,前者可實時檢測擴增進程,后者可肉眼觀察檢測結果。在臨床樣品診斷中,RPA檢出率與PCR相當[22]。

2.2 RPA在牛、羊疫病診斷中的應用

2.2.1 病毒類 在對于牛羊病毒類疾病的診斷中,RPA結合實時熒光技術建立了對小反芻獸疫[23]、裂谷熱[24]、綿陽痘[25]等病毒病的診斷方法。檢出限分別為14.98拷貝、10個RNA分子、4.72×102拷貝/μL。在臨床樣品檢測中,實時熒光RPA與實時RT-PCR檢出結果具有一致性。也有RPA技術結合側流層析試紙條診斷牛、羊病毒類疾病的報道,如口蹄疫[26]、羊口瘡[27],針對口蹄疫病毒血清型A、O和Asia的檢測限分別可達3拷貝質粒DNA、50拷貝質粒DNA,RPA-LFD方法在126份臨床樣品檢測中,與rPCR符合率為98.41%;對于羊口瘡病毒的檢測限可達80拷貝。但對于RPA-LFD檢測羊口瘡病毒的臨床應用還需要更多的樣本用以驗證。

2.2.2 細菌類 布魯氏菌病多發于牛、羊、豬等動物,人類直接接觸患病動物易導致感染,因此建立布魯氏菌的靈敏特異的現場檢測方法對防控布魯氏菌病非常重要。針對布魯氏菌的bcsp21保守基因序列設計了特異性引物,建立了RPA技術結合側流層析試紙條(LFD)快速檢測布魯氏菌的方法,最低檢測限度為5.89 CFU/mL,在模擬樣本檢測中,其結果與ELISA檢測結果一致[28]。此外,副結核分支桿菌感染導致牛的副結核病,導致其腸炎、腹瀉、消瘦等癥狀。傳統檢測方法耗時耗力,如變態反應、補體結合試驗等。針對牛副結核分支桿菌的F57基因建立了RPA-LFS檢測方法,檢測限可達12拷貝,對57份牛腹瀉臨床樣本的檢測結果與實時熒光PCR方法檢測結果一致[29]。

2.2.3 寄生蟲與支原體 針對牛支原體的uvrC基因建立了RT-RPA和LFS-RPA兩種方法檢測牛支原體,檢測限均為1.0×101拷貝,在65個臨床樣本中,其結果與實時熒光定量PCR的結果一致[30]。說明RPA不僅可作為牛支原體的實驗室常規檢測手段,也可作為快速現場手段直接檢測牛場中的牛乳支原體含量。日本血吸蟲主要感染人及犬、牛、羊、豬等,針對日本血吸蟲SjCHGCS19基因設計了特異性引物和nfo探針,建立了日本血吸蟲的RPA檢測技術結合側流層析試紙條(RPA-LFD)的快速檢測方法,該方法對日本血吸蟲成蟲基因組DNA的最低檢出限位10-6ng(1 fg),該方法與埃及血吸蟲、曼氏血吸蟲等血吸蟲具有較強交叉反應[31]。

2.3 RPA在禽類疫病診斷中的應用

2.3.1 病毒類 對H5N1亞型禽流感建立了實時熒光定量RT-RPA快速檢測方法,該方法可在39℃ 20 min快速完成檢測,靈敏度可達到10 copies,其結果與標準實時熒光RT-PCR檢出結果一致[32]。說明該方法靈敏性好、特異性強,且不依賴設備,適用于現場快速檢測。對禽白血病毒的J亞群(ALV-J)的gp85基因設計特異性引物和exo探針,建立了實時熒光定量RPA快速檢測方法,該方法可在38℃ 20 min實現快速檢測,檢出限可達10 copies/μL。在臨床樣本檢測實踐中,實時RPA、PCR和實時PCR的禽白血病毒陽性率分別為66.13%(41/62)、59.68%(37/62)和分別為67.74%(42/62)。實時RPA與實時PCR診斷符合率為98.39%(61/62)[33]。說明RPA方法適用于現場檢測,特別是在實驗儀器匱乏的情況下使用,從而更好地進行ALV-J的預防和控制。

2.3.2 真菌類 家禽感染白色念珠菌會引起消化道疾病,消化道黏膜產生潰瘍和白色假膜。針對常見的機會致病菌白色念珠菌,建立了RPA快速檢測方法,同時構建了LFD-RPA方法,該方法針對ITS序列設計引物,可在37℃ 20 min完成檢測,對于1×101copies/μL 標準品陽性檢出率為78%,對1×102～1×107copies/μL標準品陽性檢出率為100%,且靈敏性與PCR相當[36]。說明RPA可用于白色念珠菌早期快速診斷,具有特異型好、靈敏度高和便捷等優點。

2.4 RPA在犬、貓疫病診斷中的應用

2.4.1 病毒類 基于犬細小病毒(CPV)的VP2基因建立了基礎PRA、LFD-RPA快速檢測方法。RPA的兩種檢測方法都可在38℃ 15 min內即可特異檢測出犬細小病毒,兩者檢出限均為1×101拷貝/μL。在臨床CPV糞便疑似陽性的樣本檢測中,RPA、LFD-RPA的犬細小病毒檢出率為88%,高于膠體金(76%)和普通PCR(80%)[34]。說明RPA檢測方法特異性強、靈敏度高,較PCR更簡便快捷,適用于CPV的臨床快速檢測。針對犬副流感病毒(CPIV)建立了核衣殼蛋白基因保守序列的實時熒光定量RPA檢測方法,該方法可于39℃孵育25 min的條件下快速檢測犬副流感病毒,檢測下限為3.0×101.0TCID50/mL[35],在臨床疑似陽性臨床樣品、健康樣本以及其他感染臟器樣本的檢測中,實時熒光RPA與實時熒光PCR方法結果基本相符。

2.4.2 寄生蟲類 弓形蟲病的終末宿主為貓科動物。針對B1基因設計引物建立了弓形蟲Exo-RPA檢測方法,該方法可在39℃ 20 min完成檢測,檢測限達102copies/μL,比實時熒光定量PCR提高了10倍,在對180份肉類樣品檢測結果與qPCR陽性率一致[36]。

2.5 RPA在其他疫病診斷中的應用

RPA技術結合側流層析試紙條檢測志賀毒素大腸埃希氏菌[37]、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌[38]、土拉弗氏菌[39]等,對志賀毒素大腸埃希氏菌stx1、stx2基因序列設計引物及探針,檢出限分別為1 pg、10 pg;對金黃色葡萄菌的nuc基因和沙門氏菌invA基因設計引物及探針,基礎RPA檢測方法檢出限分別為30 CFU/mL、20 CFU/mL,RPA-LFD檢測方法檢出限分別為20 CFU/mL、15 CFU/mL;對土拉弗氏菌的ul4保守基因序列的檢出限達20 fg/μL。也有RPA-LFD診斷寄生蟲的報道,如曼氏血吸蟲[40]、廣州管圓線蟲[41],檢出限分別為10 fg/μL、20 pg/μL。RPA技術診斷真菌病的研究相對較少,有研究建立了酵母菌、霉菌的RPA-LFD檢測方法,檢出限分別達1.0 CFU/50 g、45.7 孢子/50 g[42]。

3 小結與展望

RPA技術在動物疫病診斷中的應用已趨于成熟,其靈敏性、特異性都與PCR相當或者更優,具有脫離實驗室的優點,但仍存在一些不足,如尚無專業軟件對其引物和探針進行設計和篩選;該技術使用引物與探針較長,無對80 bp以下的較短序列進行核酸擴增;由于反應時間短,難以控制大量樣品同時檢測的時間,影響檢測效率;在與瓊脂糖凝膠電泳結合檢測產物時,需要純化產物防止拖帶的形成;操作不當易受到氣溶膠的污染導致假陽性;成本高,即使RPA時間短、僅需用價格低廉的儀器降低了許多成本,但相對于PCR約1元1次,目前商用的液體RPA試劑盒成本約30元1次,其余類型試劑盒價格更為昂貴,這也是RPA技術仍未大量投入臨床應用的原因之一。對RPA技術仍有許多問題有待解決,如開發專業引物探針設計軟件,優化核酸提取方法,如室溫裂解法;開發便攜式、一體化和全自動RPA檢測設備,減少假陽性的產生,提高RPA診斷效率;尋找重組酶替代酶、自主表達所需蛋白等從而降低檢測成本,使RPA技術更貼近缺乏基礎設施的偏遠地區;由于RPA最適反應溫度接近人類體溫,也可開發更為便捷的溫度條件,如手握和提取體液等利用體溫完成RPA的檢測。RPA技術的普及程度還遠不及PCR技術,且短時間內不會替代PCR,RPA用于現場檢測的目標仍有距離,期望在動物疫病診斷及其他領域的應用會超越PCR技術。