木蝴蝶苷B 對大鼠腎間質纖維化的作用及機制研究

李佳凌，陳波

（西南醫科大學基礎醫學院人體解剖與組織胚胎學系，四川瀘州 646000）

腎間質纖維化是幾乎所有類型慢性腎臟疾病的共同病理特征。近5年來，文獻報道了多種治療慢性腎病纖維化的抗纖靶點，其中大麻素受體-1（cannabinoid receptor 1，CB1）被認為具有較高的臨床應用價值，是重要的抗纖維化靶點之一（Nastaseet al.，2018；Liu & Zhuang，2019；Prakouraet al.，2019）。Lecru 等（2015）的研究證實在慢性腎病纖維化過程中，CB1 的編碼基因Cnr1是10 個最顯著上調的基因之一，以CB1 為靶點的抗纖維化治療能顯示出獨特的療效。Prakoura 等（2019）指出抑制CB1 具有抗纖維化作用，這主要與抑制促炎和促纖維化細胞因子分泌、抑制氧化應激和內質網應激、抑制肌成纖維細胞增殖和細胞外基質成分產生有關。CB1 屬A 類G 蛋白偶聯受體家族，是人腦中表達最高的G蛋白偶聯受體，在全身均有表達，以中樞神經系統中的表達水平最高（Yanget al.，2022）。CB1 存在于整個腎臟中，如傳入和傳出小動脈、腎小球、腎小管、Henle 環和集合管，它也在不同的腎細胞中表達，如足細胞、近端和遠端腎小管上皮細胞，以及系膜細胞等（Joseph，2016）。

腎纖維化過程中，腎小管上皮細胞會向間充質表型轉化，形成成纖維細胞和肌成纖維細胞，并產生細胞外基質，即上皮-間充質轉化（epitheliummesen chymal transition，EMT）。EMT 的特征是上皮標志物的喪失、細胞骨架重組和間充質標志物的獲得。上皮細胞標志物E 鈣黏蛋白（E-cadherin）對維持上皮細胞的功能發揮了重要作用。肌成纖維細胞標志物α 平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）是間充質表型的特征性細胞骨架蛋白，隨間充質表型細胞增多而增加。細胞外基質的重要蛋白——纖維連接蛋白（fibronectin，FN）的表達在纖維化早期會顯著增加，并隨細胞外基質增多而升高。鋅指轉錄因子（Snail）被認為是啟動和維持EMT 的重要轉錄因子之一，Snail 的再表達與纖維化有關，具有促進EMT 的作用。檢測上述標記物可以評估EMT（Canoet al.，2000；Boutetet al.，2006；Willis & Borok，2007；Liet al.，2012；Ohnukiet al.，2012；Martiniet al.，2014；Grandeet al.，2015；Lovisaet al.，2015；Simon & Hertig，2015，2017；Chenet al.，2019）。抑制細胞中的CB1 可以減弱蛋白激酶B（Akt）信號（Linet al.，2015），而抑制Akt信號和Snail的表達能抑制纖維化（Zhuet al.，2019）。

目前針對CB1 的中藥抗腎纖維化研究尚未見報道。本課題組在實驗前期利用藥物篩選軟件Schrodinger Maestro 11.4 以CB1 為靶點對中藥單體進行虛擬篩選，從中藥單體數據庫中評估了許多靶向CB1（PDB ID：6N4B）的中藥單體小分子，其中之一是木蝴蝶苷B（oroxin B，OB）。OB 分子式C27H30O15，分子量594.52 g·mL-1，屬于黃酮類單體化合物，存在于常用中藥木蝴蝶中，木蝴蝶是紫葳科Bignoniaceae 木蝴蝶Oroxylum indicum的干燥成熟種子，具有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗微生物、抗炎等，能清肺利咽、疏肝和胃（國家藥典委員會，2015；Rojsangaet al.，2017；胡曉茹等，2020；Fenget al.，2021）。本研究旨在探討OB 通過抑制CB1 抗腎間質纖維化的潛在機制，為OB 的抗腎纖維化研究提供科學依據。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

正常人腎小管上皮（HK-2）細胞購自北京創聯生物技術有限公司（編號：BNCC339833）。32 只健康成年雄性大鼠Rattus norvegicus（平均體重235 g±10 g）由西南醫科大學實驗動物中心提供；動物實驗的相關操作均符合實驗動物的管理條例，獲得西南醫科大學動物倫理委員會批準（編號：SWMU20210257）。

OB（MedChemExpress，USA），DMEM/F-12（1∶1）培養基（Gibco/Life Technologies，Grand Island，NY），FBS 胎牛血清（Gibco/Life Technologies，Grand Island，NY），二甲基亞砜（DMSO；Solarbio，北京），重組人轉化生長因子-β1（TGF-β1；PeproTech，Rocky Hill NJ，USA），花生四烯基-2-氯乙基酰胺（ACEA；MACKLIN，上海），GAPDH 抗體（1∶30 000；Proteintech，USA），α-SMA 抗體（1∶4 000；Proteintech，USA），Snail 抗 體（1∶1 000；Cell Signaling，USA），Akt 抗 體（1∶1 000；Cell Signaling，USA），Phospho-Akt 抗體（1∶1 000；Cell Signaling，USA），Fibronectin 抗體（1∶1 000；Abcam，UK），E-cadherin抗體（1∶1 000；Abcam，UK），Kim-1 抗體（1∶1 000；SAB，USA），CB1R 抗體（1∶1 000；Abcam，UK），腺嘌呤（Ade；Sigma，USA），辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔或小鼠抗體（中杉金橋，北京），HRP化學發光底物（Solarbio，北京），CCK8 試劑盒（DOJINDO，Japan），BCA試劑盒（Thermo，USA），Scr和BUN 測試盒（南京建成生物，南京），HE 染色液和Masson染色液（Solarbio，北京）。

不同濃度的OB 工作液制備：按照OB 說明書先用DMSO 將OB（粉末狀）溶解，再依據說明書的配制比例，用培養基將OB 溶解液稀釋為所需濃度的工作液。0.75 mmol·L-1濃度的ACEA 工作液制備：按照ACEA 說明書配制比例，用培養基將ACEA 原 液 稀 釋 為0.75 mmol·L-1濃 度 的 工 作 液。含10%FBS 的DMEM/F-12（1∶1）培養基配制：將DMEM/F-12（1∶1）培養基與FBS 按照10∶1 的比例進行配制。

1.2 實驗儀器

ELX800 型酶標儀（Biotek，USA），PowerPac 型電泳儀和轉膜儀（BioRad，USA），6000Exp型化學發光成像儀（CliNX，上海），5910R 型高速冷凍離心機（Eppendodf，Germany），恒溫水浴鍋（常州市金壇友聯儀器研究所），MC0-18AI 型二氧化碳培養箱（Panasonic，Japan）。

1.3 細胞培養

HK-2 細胞用含10%FBS 的DMEM/F-12（1∶1）培養基培養，并放入37 ℃含有5%的CO2培養箱中。細胞培養至對數生長期后備用。

1.4 CCK-8試劑盒檢測細胞活力

將HK-2 細胞以5 000 個/孔接種在96 孔板中，分為正常對照組（添加培養基）、濃度梯度組（添加稀釋濃度分別為0 μmol·L-1、6.25 μmol·L-1、12.5 μmol·L-1、25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1的OB 工作液，每組4 個重復孔。根據CCK8 試劑盒說明書檢測各組細胞在實驗12 h、24 h、48 h時的細胞活力。

1.5 OB 抗TGF-β1 誘導HK-2 細胞纖維化的濃度測定

將HK-2細胞（2×105）接種于6 cm培養皿中，隨機分為正常對照組（添加培養基）、TGF-β1組（模型組）、TGF-β1+DMSO 組和TGF-β1+OB 梯度濃度（100 μmol·L-1、50 μmol·L-1、25 μmol·L-1、12.5 μmol·L-1、6.25 μmol·L-1）組。TGF-β1組使用15 ng·mL-1TGF-β1誘導48 h 建立纖維化模型；TGF-β1+DMSO 組使用TGF-β1 組添加1 mL·L-1DMSO 干預24 h；TGF-β1+OB 梯度濃度組使用TGF-β1 組添加濃度分別為100 μmol·L-1、50 μmol·L-1、25 μmol·L-1、12.5 μmol·L-1和6.25 μmol·L-1的OB 工作液干預24 h。根據BCA試劑盒說明書對各組細胞總蛋白濃度進行定量分析。為測定OB 抗TGF-β1 誘導HK-2 細胞纖維化的濃度，Western Blotting 檢測各組細胞CB1、α-SMA、FN、E-cadherin蛋白的表達。

1.6 OB 抗TGF-β1 誘導HK-2 細胞纖維化的時間測定和AKT信號、EMT的變化監測

將HK-2細胞（2×105）接種于6 cm培養皿中，隨機分為正常對照組（添加培養基）、DMSO組、TGF-β1組（模型組）、TGF-β1+OB 不同時間（12 h、24 h）組。DMSO 組為正常組添加1 mL·L-1DMSO 干預48 h；TGF-β1 組使用15 ng·mL-1TGF-β1 誘導48 h 建立纖維化模型；根據步驟1.5 確認OB 抗HK-2 纖維化的最佳濃度為25 μmol·L-1，故TGF-β1+OB 不同時間（12 h、24 h）組使用TGF-β1組添加25 μmol·L-1OB工作液分別干預12 h 和24 h。根據BCA試劑盒說明書對各組細胞總蛋白濃度進行定量分析。Western Blotting檢測各組細胞CB1、α-SMA、FN、E-cadherin、P-Akt、Akt、Snail蛋白的表達，測定OB抗TGF-β1誘導HK-2 細胞纖維化的時間和監測AKT 信號、EMT的變化。

將HK-2細胞（2×105）接種于6 cm培養皿中，隨機分為正常對照組（添加培養基）、TGF-β1組（模型組）、TGF-β1+ACEA組和TGF-β1+OB組。TGF-β1組使用15 ng·mL-1TGF-β1 誘導HK-2 細胞48 h 建立纖 維 化 模 型；TGF-β1+ACEA 組先用0.75 mmol·L-1CB1激動劑ACEA 干預1 h，再用TGF-β1誘導48 h；TGF-β1+OB 組使用TGF-β1 組添加25 μmol·L-1OB工作液干預24 h。根據BCA 試劑盒說明書對各組細胞總蛋白濃度進行定量分析。為監測由CB1 引起的AKT 信號改變和EMT 變化，Western Blotting檢測各組細胞CB1、P-Akt、Akt、Snail、α-SMA、FN、E-cadherin蛋白的表達。

1.7 腺嘌呤構建大鼠腎間質纖維化模型和OB給藥

32 只大鼠飼養于24 °C、50%相對濕度、無特定病原體的環境下，進行12 h 光/暗循環。隨機分為正常對照組、Ade 腎病組（模型組）、Ade+低劑量OB 組（Ade+OBL 組）、Ade+高劑量OB 組（Ade+OBH 組），每組8 只。除正常對照組灌胃等量生理鹽水，其余3組均以150 mg·kg-1Ade灌胃建立腎間質纖維化模型，每日灌胃1 次，連續25 d。模型建立后，Ade+OBL組和Ade+OBH組分別用5.0 mg·kg-1和20.0 mg·kg-1OB 灌胃。正常對照組和Ade 腎病組灌胃等量生理鹽水，每日灌胃1次，連續14 d。

1.8 血清肌酐（Scr）和血尿素氮（BUN）檢測

在灌胃前1 天、灌胃的第25天和灌胃的第39天（即OB 灌胃的第14 天），32只大鼠禁食不禁水12 h，分3 次抽尾靜脈血1 mL，按照Scr 和BUN 測試盒說明書檢測各組大鼠的Scr和BUN 水平，并監測各組大鼠腎功能的變化。

1.9 組織學分析

第3次血樣采集完成后，32只大鼠逐一進行麻醉，每只大鼠均取雙側腎臟制作組織切片，采完腎組織隨即處死大鼠。用HE 和Masson 三色對切片（4.5 μm）進行染色，并通過顯微鏡觀察：通過HE染色評估腎損傷，按Tang 等（2021）報告的盲評法進行評分，即根據腎小管壞死、管型形成和腎小管擴張的分級進行損傷評估；通過Masson 染色評估膠原沉積，使用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，Silver Spring，USA）在每只大鼠的5～10 個等效皮質HPF（200×）中進行膠原沉積量化或膠原沉積面積評分。

1.10 Western Blotting檢測大鼠腎組織蛋白

腎臟采集完成后，將32 只大鼠的雙腎沿其長軸縱切分為前后2 部分，雙腎前部均用于切片制作，雙腎后部均用于組織總蛋白提取。組織總蛋白提取后進行低溫離心，10 000 r·min-115 min。按照BCA 試劑盒說明書對腎組織總蛋白濃度進行定量。Western Blotting 檢測：將蛋白質樣本加載到10%SDS-PAGE 凝膠中，再轉移到PVDF 膜上。用5%脫脂乳封閉膜后，使用以下抗體：GAPDH 抗體，α-SMA 抗體，Snail 抗體，Akt 抗體，Phospho-Akt 抗體，Fibronectin 抗體，E-cadherin 抗體，CB1R 抗體孵育膜，4 ℃過夜。用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的山羊抗兔或小鼠抗體孵育膜2 h，再讓膜與HRP化學發光底物反應。使用化學發光成像儀顯示蛋白條帶，并用ImageJ對蛋白條帶進行定量分析。

1.11 統計學方法

所有數據用xˉ±SD 表示，每個實驗均經過3 次及以上的重復。應用GraphPad Prism 8.0 進行方差齊性分析后進行單因素或雙因素方差分析，事后檢驗采用Turkey 法比較組間差異。P＜0.05 表示組間具有統計學差異。

2 結果

2.1 OB對HK-2細胞增殖的影響

CCK8 結果顯示，HK-2 細胞存活率隨OB 濃度和時間的增加而降低。OB 濃度≤12.5 μmol·L-1時，12 h、24 h、48 h 組的細胞存活率均在90%以上（P＜0.05）；與正常對照組相比，50 μmol·L-1濃度OB干預細 胞12 h 及以上 或25 μmol·L-1濃度OB 干預細胞48 h，細胞存活率明顯降低（P＜0.05）；當OB 濃度＞100 μmol·L-1時，24 h、48 h 的細胞存活率急劇下降（P＜0.05）（圖1）。

圖1 不同濃度OB處理HK-2細胞后的存活率（n=4）Fig. 1 Survival rate of HK-2 cells after the treatment of OD at different concentrations （n=4）

2.2 OB對TGF-β1誘導HK-2細胞纖維化的影響

2.2.1 不同濃度OB 對HK-2 細胞纖維化的影響與正常對照組相比，模型組（TGF-β1組）中α-SMA、FN 蛋白的表 達顯著增加，CB1R、E-cadherin 蛋白的表達顯著減少（P＜0.05）。與模型組相比，TGF-β1+OB（6.25 μmol·L-1）組 和TGF-β1+OB（12.5 μmol·L-1）組中CB1R 蛋白的表達顯著減少（P＜0.05），但α-SMA、E-cadherin 和FN 蛋白的表達未見顯著變化。TGF-β1+OB（≥25 μmol·L-1）組中CB1R蛋白的表達呈梯度下降趨勢，其中，TGF-β1+OB（25 μmol·L-1）組的下降趨勢最多，且與模型組相比，FN 蛋白的表達顯著減少，E-cadherin 蛋白的表達顯著增加（P＜0.05）（圖2）。

圖2 OB對TGF-β1誘導HK-2細胞纖維化中相關蛋白表達的影響（n=3）Fig. 2 Effect of OB on the expression of related proteins in HK-2 cell fibrosis induced by TGF-β1 （n=3）

2.2.2 不同時間的OB（25 μmol·L-1）對HK-2 細胞纖維化的影響與正常對照組和DMSO 組相比，模型組（TGF-β1 組）中CB1R、α-SMA 和FN 蛋白的表達顯著增加，E-cadherin 蛋白的表達顯著減少（P＜0.05）。與模型組相比，TGF-β1+OB（25 μmol·L-1，12 h）組和TGF-β1+OB（25 μmol·L-1，24 h）組 的CB1R、α-SMA、FN 蛋白表達顯著減少，E-cadherin蛋白的表達顯著增加，隨著時間的延長，CB1R、α-SMA、FN 蛋白的表達進一步減少，而E-cadherin蛋白的表達顯著增加（P＜0.05）（圖3：B，F，G，H）。

圖3 OB對TGF-β1誘導HK-2細胞纖維化中的Akt/Snail信號通路的影響（n=3）Fig. 3 Effect of OB on the Akt/Snail signal pathway in HK-2 cell fibrosis induced by TGF-β1 （n=3）

2.3 OB 對HK-2 細胞CB1/Akt/Snail 信號通路和EMT的影響

與正常對照組和DMSO 組相比，模型組的P-Akt/Akt 顯著上升，Snail 蛋白的表達顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，TGF-β1+OB（25 μmol·L-1，12 h）組和TGF-β1+OB（25 μmol·L-1，24 h）組的P-Akt/Akt 顯著下降，Snail 蛋白的表達顯著減少（P＜0.05），且Snail 蛋白的表達隨OB 干預時間的增加而減少，且差異顯著（P＜0.05）（圖3：C，D）。與模型組相比，TGF-β1+ACEA 組中CB1R、α-SMA、FN、Snail 蛋白的表達和P-Akt/Akt 顯著增加，E-cadherin 蛋白的表達顯著減少（P＜0.05）；而與TGF-β1+ACEA 組相比，TGF-β1+OB 組中CB1R、α-SMA、FN、Snail蛋白的表達和P-Akt/Akt顯著減少，E-cadherin蛋白的表達顯著增加（P＜0.05）（圖4）。

圖4 OB對HK-2細胞CB1/Akt/Snail信號通路及EMT的影響（n=3）Fig. 4 Effects of OB on the CB1/Akt/Snail signal pathway and EMT-related proteins （n=3）

2.4 OB 對腎間質纖維化大鼠腎功能和腎臟病理的影響

Ade 誘導的大鼠腎間質纖維化模型建立25 d時，Ade 腎 病 組、Ade+OBL 組、Ade+OBH 組Scr、BUN 濃度較正常對照組均顯著升高（P＜0.05）。與Ade 腎 病組 相比，OB 干 預14 d 后，Ade+OBL 組、Ade+OBH 組Scr、BUN 濃度均不同程度降低，且差異顯著（P＜0.05）（圖5：A，B）。

圖5 OB對腎間質纖維化大鼠腎功能和腎臟病理的影響（n=8）Fig. 5 Effect of OB on renal function and renal pathology in rats with renal interstitial fibrosis（n=8）

Ade 腎病組的腎小管上皮細胞明顯脫落，部分管腔擴張，炎性細胞浸潤間質，膠原成分增加。Ade+OBL組、Ade+OBH 組腎臟病理損傷、膠原沉積較Ade 腎病組均有不同程度的改善，Ade+OBH 組改善程度明顯更優（圖5：C，D）。

2.5 OB 對大鼠腎組織CB1/Akt/Snail 信號通路和EMT的影響

與正常對照組相比，模型組（Ade 腎病組）中α-SMA、FN、Snail、CB1R 蛋白的表達明顯增加，P-Akt/Akt 明顯上升，E-cadherin 蛋白的表達顯著減少（P＜0.05）。與模型組相比，Ade+OBH 組α-SMA、Snail、CB1R 蛋白的表達顯著減少，P-Akt/Akt 顯著下降，而E-cadherin 蛋白的表達顯著增加（P＜0.05）；Ade+OBL 組僅CB1R 蛋白的表達顯著減少（P＜0.05），而Snail、FN、α-SMA、E-cadherin 蛋白的表達和P-Akt/Akt未見變化（圖6）。

圖6 OB對大鼠腎組織CB1R/Akt/Snail信號通路和EMT的影響（n=8）Fig. 6 Effects of OB on the CB1R/Akt/Snail signal pathway and EMT in rats with renal interstitial fibrosis（n=8）

3 討論

靶向藥物治療腎間質纖維化是纖維化研究的方向之一。CB1受體被臨床視為重要的抗纖靶點，其信號傳導能促進氧化應激和炎癥、導致細胞凋亡和纖維化（Baruttaet al.，2018）。特別是在腎小管上皮細胞、足細胞和間質肌成纖維細胞中，CB1的藥理學阻斷或抑制能降低腎纖維化的發生，具有保護腎臟的作用（Lecruet al.，2015；Daoet al.，2019）。

本課題組前期以CB1 為靶點，利用計算機虛擬篩選分子對接，從中藥單體數據庫中獲得了100 個中藥單體小分子，并選擇目前尚未用于抗纖研究的OB 進行實驗。本研究的體外實驗結果顯示，CB1 激動劑ACEA 對纖維化HK-2 細胞起著積極的促纖作用，ACEA 增加了纖維化HK-2 細胞CB1、Snail、α-SMA、FN 蛋白的表達和P-Akt/Akt，減少了E-cadherin 蛋白的表達（P＜0.05）；而OB 降低了纖維化HK-2 細胞CB1、Snail、α-SMA、FN 蛋白的表達和P-Akt/Akt，增加了E-cadherin 蛋白的表達（P＜0.05）。說明OB 可以通過抑制HK-2 細胞的CB1 蛋白表達，從而抑制Akt/Snail信號傳導、EMT，進而抑制TGF-β1 誘導的纖維化。Lin 等（2015）指出通過抑制心肌成纖維細胞的CB1 蛋白表達來減弱Akt信號，抑制心臟纖維化；Zhu等（2019）的研究證實，通過抑制人臍靜脈內皮細胞的Akt 信號和Snail 蛋白的表達能抑制內皮-間充質轉化和纖維化。這與本研究的體外實驗結論基本一致：通過抑制腎小管上皮細胞（HK-2）的CB1 蛋白表達可以抑制Akt 信號和Snail 蛋白的表達，從而抑制EMT，進而抑制纖維化。

本研究體內實驗結果顯示，高劑量和低劑量的OB 均能改善間質纖維化大鼠的腎功能和腎臟病理情況，并抑制其腎組織中的CB1 蛋白表達；且高劑量的OB 能下調纖維化大鼠腎組織中的Snail和α-SMA 蛋白表達，并上調E-cadherin 蛋白的表達，降低P-Akt/Akt。說明OB 能通過抑制大鼠腎組織中的CB1，抑制Akt/Snail信號傳導、抑制EMT，進而抑制大鼠腎間質纖維化。這與本研究的體外實驗結論基本一致：OB 能通過抑制腎臟的CB1 抑制Akt 信號和Snail 蛋白的表達，從而抑制EMT，進而抑制纖維化。但OB 抗腎間質纖維化是否還通過其他途徑發揮作用，尚需進一步研究闡明。

中藥單體OB 能通過抑制腎組織中CB1/Akt/Snail 信號傳導，從而抑制EMT，進而抑制大鼠腎間質纖維化。OB的抗腎纖維化能力及機制研究為靶向CB1的OB抗慢性腎病纖維化提供了科學依據。