2018—2022年鯽造血器官壞死病病原檢測能力驗證結果分析

王娜,余衛忠,張旻,景宏麗,王彩霞 ,馮春燕,李清,吳紹強*

(1.中國檢驗檢疫科學研究院 北京 100176;2.全國水產技術推廣總站 北京 100125)

鯽造血器官壞死病(Crucian carp haematopoietic necrosis,CHN)是由鯉皰疹病毒2型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2),也稱為金魚造血器官壞死病毒(Goldfish haematopoietic necrosis virus,GFHNV),引起的鯽(Carassiusauratus)、金魚等魚類死亡的一種病毒性傳染病,在全球多個國家和地區均有流行,給金魚、鯽養殖產業造成了嚴重的經濟損失[1-2],自2009年以來,在中國江蘇省部分地區養殖的異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)中檢測到CyHV-2病毒,隨后該病毒在國內鯽主要養殖區域暴發流行[3-4]。CyHV-2屬于皰疹病毒目(Herpesvirales)、異樣皰疹病毒科(Alloherpesviridae)、鯉科皰疹病毒屬(Cyprinivirus),是具有囊膜的雙鏈DNA病毒[5]。由于幼魚和成魚均可感染,發病急、死亡率高,農業農村部于2022年在《一、二、三類動物疫病病種名錄》中將其列為二類水生動物疫病[6]。

目前,針對CyHV-2感染尚無有效的防治藥物。因此,加強監測成為控制和預防鯽造血器官壞死病的重要手段。雖然已有很多CyHV-2的檢測方法[3],但在實際應用中主要還是基于分子的檢測技術,血清學診斷并沒有得到廣泛的應用。目前國內權威的CyHV-2檢測方法是GB/T 36194—2018《金魚造血器官壞死病毒檢測方法》[7]中推薦的方法,分別使用特異性引物PCR擴增CyHV-2 DNA聚合酶(pol)基因片段(362 bp)和解旋酶(hel)基因片段(366 bp),當檢測樣品能同時擴增出2段基因且測序結果正確時,才可判定樣品中CyHV-2核酸陽性。

針對某種疾病或病原的能力驗證結果,是衡量相關實驗室檢測能力的重要指標[8],也是評價全系統對該疫病防控能力的重要參數[9-10]。為加強水生動物防疫系統實驗室鯽造血器官壞死病病原檢測能力,提高疫病監測的準確性,2018—2022年,全國水產技術推廣總站分別組織5次水生動物防疫系統實驗室“鯽造血器官壞死病病原檢測能力驗證”項目,并委托中國檢驗檢疫科學研究院承擔相關測試評價工作。通過此次考核和比對,能力測試的結果可以客觀反映參加實驗室的鯽造血器官壞死病病原檢測能力,同時幫助和促進參加實驗室發現管理和技術問題,并加以糾正,提高檢測能力水平,保證各實驗室檢測結果的準確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 能力驗證樣品的制備

經檢測未感染CyHV-2的健康草魚(CtenopharyngodonIdella)采自北京,取脾臟、腎臟和肝臟組織研磨均勻,按照質量體積比1∶10(m/v),用1×PBS緩沖液懸浮待用。

病毒樣顆粒溶液CyHV-2-pol包含GB/T 36194-2018《金魚造血器官壞死病毒檢測方法》[7]中的pol基因片段(GenBank No：AFJ20509),長度為1 536 bp;病毒樣顆粒溶液CyHV-2-hel包含標準中的hel基因片段(GenBank No：AFJ20501),長度1 707 bp。2種病毒樣顆粒溶液由中國檢驗檢疫科學研究院動物檢驗與檢疫研究所制備保存。

按照組織勻漿液：CyHV-2-pol溶液：CyHV-2-hel溶液=3∶1∶1(v/v/v)的體積比,將各溶液混勻?；旌弦鹤鳛殛栃詸z測樣品,每管800 μL分裝,-80 ℃保存。單獨的草魚組織勻漿液作為陰性檢測樣品,同樣分裝保存。

1.1.2 能力驗證樣品的均勻性和穩定性

1.1.2.1 均勻性

為保證所有參加實驗室檢測的樣品成分一致,所有樣品(包括陽性樣品和陰性樣品)各一次性準備250管,每管樣品800 μL分裝。按照CNAS-GL003：2018《能力驗證樣品均勻性和穩定性評價指南》[11]測試均勻性。陰性樣品和陽性樣品各隨機抽取11份進行檢測。使用GB/T 36194-2018《金魚造血器官壞死病毒檢測方法》[7]中推薦的PCR方法擴增目的基因,并委托上海生工生物進行測序。若全部樣品的PCR擴增產物與目的基因大小一致,則樣品均一性良好。若PCR擴增產物與目的基因大小不符,或有DNA污染,或目的基因條帶不明顯甚至無DNA條帶,則樣品不能使用,需重新制備和檢驗。

1.1.2.2 穩定性

為保證各參加實驗室收到的樣品性質未發生改變,分別設置3組陽性樣品和陰性樣品,每組5份,模擬保存溫度和運輸溫度放置于-20、4和37 ℃下測試樣品的穩定性。分別在第0 d、第2 d、第5 d、第9 d和第14 d,將3種溫度保存的樣品各取1份,于-80 ℃保存。依據標準進行PCR擴增和測序,檢測在不同保存條件下樣品的穩定性。

1.1.3 樣品的包裝及發放

1.1.3.1 樣品的包裝

樣品為盲樣,擬給每個參加實驗室發放4份檢測樣品,其中至少包含1份陽性樣品或1份陰性樣品。陰性樣品(N)、陽性樣品(P)可有10種不同的組合方式,隨機決定參加者采用哪一種組合,由發樣單位記錄并保密,從而保證能力驗證項目的測試效果,防止實驗室間互相比對結果。給參加實驗室一個隨機代碼,再隨機決定發送哪種組合的樣品。4個檢測樣品標簽為實驗室的代碼和樣品編號(例如：代碼為C10的參加實驗室,樣品標簽為C10-1、C10-2、C10-3、C10-4)。

2.1.3.2樣品的發放

樣品避光保存于1.5 mL管中,管壁上防水標簽包含測試樣品名稱、編號及實驗室代碼,樣品管放置于包裝盒內。包裝盒上防水標簽包含項目名稱、測試樣品名稱、數量、編號、保存溫度、發送單位及接收單位名稱(圖1)。根據樣品穩定性檢測結果,將包裝盒放置于充滿干冰和冰袋的厚泡沫塑料盒內,密封后放置于硬殼紙箱中,再次密封后通過特快專遞發放至各參加實驗室。同時在樣品的寄送包裝中附有樣品接收確認單、能力測試作業指導書和能力測試結果報告單等紙質材料。

圖1 送檢樣品包裝Fig.1 The packaging of testing samples

圖2 CyHV-2陽性樣品均一性A：目的基因362 bp;B：目的基因366 bpM：DL2000 DNA Marker;1～22：11份陽性樣品DNA,每個樣品2次重復;N：空白對照(ddH2O);P：陽性對照。Fig.2 Homogeneity of CyHV-2 positive samplesA：Target gene 362 bp;B：Target gene 366 bpM：DL2000 DNA Marker;1-22：DNA in 11 positive sample,each sample with two replicates;N：Blank control (ddH2O);P：Positive control.

1.2 方法

1.2.1 推薦的檢測方法

使用GB/T 36194-2018《金魚造血器官壞死病毒檢測方法》[7]中推薦的PCR方法進行檢測。先提取樣品總DNA,再使用PCR方法檢測病毒的DNA。根據擴增得到的片段大小及測定序列比對結果來判斷。樣品DNA的抽提試劑和PCR反應試劑可根據參加實驗室情況自行選擇,或采用商品化試劑盒進行試驗。

1.2.2 檢測樣品結果判定方法

本項目為定性檢測類項目,檢測結果僅用陽性和陰性表示,沒有定量標準。

根據標準,同時滿足以下2條即可判定為GFHNV陽性[7]。一是利用CyHV引物PCR檢測結果為陽性,且通過分析測序結果確定是GFHNV。二是利用CyHV-2引物PCR檢測結果為陽性,且測序結果正確。

1.2.3 能力驗證結果判定原則

參加實驗室的定性檢測結果必須與發放樣品預設結果完全一致,方可判定為結果“滿意”,并且檢測流程和檢測結果判定方法必須符合GB/T 36194—2018《金魚造血器官壞死病毒檢測方法》[7]的規定。

1.2.4 驗證結論

如果參加單位報送結果為“滿意”,則表明該實驗室已具備鯽造血器官壞死病病原的檢測能力;如果報送結果為“不滿意”,則需分析原因,進行相應的整改。

2 結果與分析

2.1 樣品的均勻性與穩定性

2.1.1 均勻性檢測結果

隨機選取11份陽性樣品和陰性樣品進行檢測。結果顯示,陽性樣品均可擴增出362 bp條帶和366 bp條帶,PCR產物測序序列與參考序列同源性達100%,陰性樣品均與預期結果一致。說明陽性樣品和陰性樣品均一性良好,滿足能力驗證要求。

2.1.2 穩定性檢測結果

樣品保存于-20、4和37 ℃ 14 d后,檢測結果仍全部為陽性,序列比對結果顯示與參考序列的同源性都達到100%,表明樣品穩定性良好。在37 ℃保存第14 d時PCR擴增條帶會變淺?？紤]到使用特快專遞,一般2～5 d可運抵參加能力驗證的實驗室,因此本項目制備的能力驗證樣品經長途運輸后仍滿足參加實驗的檢測需求。按照GB/T 36194—2018《金魚造血器官壞死病毒檢測方法》[7],CyHV-2的PCR檢測為定性檢測,不需要定量,因此樣品的均勻性和穩定性檢測結果也只統計了定性結果,未統計定量和誤差分析。

2.2 參加實驗室情況

2018—2022年“鯽造血器官壞死病病原檢測能力驗證”項目分別有67、71、74、106和93家實驗室參加,包括推廣(疫控)機構實驗室、科研機構實驗室、高校實驗室、海關系統實驗室、企業實驗室和其他單位實驗室(表1)。其中農業農村部各級水產技術推廣站,以及某些研究CyHV-2的高校、科研院所和企業,主要負責檢測監測國內CyHV-2的流行情況;海關系統各級技術中心和實驗室,負責出入境水生動物的CyHV-2檢測。地域分布上,各參加實驗室分布于全國各省市,沿海省市和長江流域水產養殖業比較發達地區占比較高。

表1 參加能力驗證活動的實驗室Tab.1 The laboratories particpated in proficiency testing 個

2.3 參加實驗室檢測結果統計及評價結果

2018年,有67家單位參加能力驗證測試,其中58家單位測試結果滿意,占86.57%;9家單位測試結果不滿意,占13.43%。2019年,有71家單位參加能力驗證測試,其中59家單位測試結果滿意,占83.10%;12家單位測試結果不滿意,占16.90%。2020年,有74家單位參加能力驗證測試,其中64家單位測試結果滿意,占86.50%;10家單位測試結果不滿意,占13.50%。2021年,有106家單位參加能力驗證測試,其中93家單位測試結果滿意,占87.74%;13家單位測試結果不滿意,占12.26%。2022年,有92家單位參加能力驗證測試,其中79家單位測試結果滿意,占85.86%;13家單位測試結果不滿意,占14.14%(表2)?？v觀5次能力驗證項目,2021年參測實驗室數量最多(圖3),滿意率除2019年稍低外,其余4年均超過85.00%(圖4)。

表2 2018—2022年能力驗證滿意結果對比表Tab.2 The proficiency testing satisfaction results of laboratories in 2018—2022

圖3 2018—2022年參測實驗室數量Fig.3 The number of laboratories tested in proficiency testing in 2018—2022

圖4 2018—2022年參測實驗室滿意率Fig.4 The satisfaction rate of laboratories tested in proficiency testing in 2018—2022

3 討論

近年來,隨著鯽養殖規模的逐漸擴大,鯽造血器官壞死病已成為嚴重威脅中國鯽和金魚養殖業健康發展的主要疾病之一。因此,加強鯽造血器官壞死病的監測和防控是當前的首要工作。開展鯽造血器官壞死病病原檢測能力驗證工作,提升該病的檢測能力,為鯽造血器官壞死病的監測預警提供了有力支撐。本能力驗證具有持續時間久、參加實驗室數量多、地域分布廣泛等特點。2018—2022年,共有411家(次)實驗室參加,測試結果滿意率依次為86.57%、83.10%、86.50%、87.74%和85.86%。表明大部分實驗室具備了鯽造血器官壞死病病原檢測能力和質量管理水平[12],可以承擔該病原的檢測和監測工作,為有關部門提供技術支持工作。

病原檢測的能力驗證樣品,一般采用活病原、病原總核酸或核酸片段來制備[13]。由于用活病毒做能力測試有病原泄漏和擴散的風險,中國也明令禁止隨意轉運。為盡量模擬實際情況,本項目將健康草魚(Ctenopharyngodonidella)組織勻漿液與包含病毒DNA的病毒樣顆粒溶液混合,作為檢測能力驗證樣品。病毒樣顆粒溶液中包含CyHV-2的pol和hel目的基因片段,因此可以使用PCR方法進行檢測;同時病毒樣顆粒具有病毒結構特點,除滿足安全穩定的條件外,無生物安全風險。因實際檢測工作中是提取感染組織的DNA進行檢測,該項目不僅可以驗證各參加實驗室的PCR檢測能力,還可以驗證其從組織中提取核酸的能力。

本單位承擔的“鯽造血器官壞死病病原檢測”能力測試項目均按照組織核酸提取、PCR、測序的技術方法判定結果,每個實驗室4份測試樣品。結果報告單中要求每個參測實驗室注明所使用的儀器設備、參考物質的種類及來源、采標情況、核酸制備方法、檢測結果及測試中出現的問題等,同時需附完整實驗記錄。上述信息的提供用以考察和評定參測實驗室的檢測能力和水平。在檢測過程中重點關注以下問題。

3.1 標準的正確運用

依據所采用標準中的結果判定條件,PCR陽性條帶,需經測序及序列比對,若比對結果確認為CyHV-2,才能判定為樣品陽性。有的參加單位PCR僅檢測一個基因或PCR檢測結果正確,未對所擴增條帶進行測序或者僅對其中一個基因或一個樣品檢測結果進行測序或序列比對后判定樣品核酸陰性或陽性,不符合標準中的結果判定條件。建議參加單位嚴格按照檢測標準中規定的流程和結果判定條件進行檢測。核酸制備方法在標準中規定的是常規方法,目前商品化試劑盒應用比較普遍,便捷且提取質量較好,建議檢測實驗室在選擇使用商品化核酸提取試劑盒時應設立常規方法對比監控核酸提取質量,防止假陰性的錯誤判定。5次能力驗證中不滿意結果存在7個假陰性結果。

3.2 體系質量控制

此次能力測試活動中結果不滿意實驗室存在陰性測試樣品出現陽性的結果。假陽性結果的出現,主要由以下幾方面因素造成：一是硬件環境方面,部分檢測實驗室空間布局和區域劃分存在缺陷,為防止從PCR反應間污染的擴散,最好將PCR實驗室分區或者分成多個房間,嚴格從潔凈區(前區)到污染區(后區)的單向流程[14];二是軟件操作方面,操作過程不規范、人員技術等方面存在不足,防污染意識淡薄,因此極容易出現假陽性結果的情況;三是測試過程中部分參測單位在結果報告單的模糊分析,暴露了對CyHV-2檢測流程不夠熟悉等問題。建議承擔檢測任務的實驗室加強該方面培訓,將檢測誤差風險降到最低。此次測試結果不滿意的實驗室中,57次不滿意結果中有13次是假陽性和假陰性導致,占22.80%。導致假陽性的主要原因是在試驗過程中未嚴格按照操作規程進行,忽視細節,導致樣品污染。為避免產生假陽性,應在以下檢測步驟中特別注意：DNA提取過程中避免交叉污染,尤其注意更換移液器吸頭和避免手指沾染樣品液體;PCR反應體系加樣時,注意更換移液器吸頭,按照空白對照、陰性對照、待檢樣品、陽性對照的順序加樣;電泳點樣時,避免樣品量過多溢出點樣孔,或手抖使樣品流入其他點樣孔[15]。

3.3 參考物質的規范

參考物質作為整個檢測質量體系運行情況的監控與指示起到非常重要的作用,其使用和保存均應有規范的記錄并應統一或者定期對其有效性進行監控[11,16]。有的單位PCR檢測未設置陽性對照,有的單位結果報告中電泳圖未作標記。不滿意結果中有10次是因上述原因導致的。

3.4 樣品接收時間

因能力測試項目參加單位較多,能力測試樣品分批次使用快遞發出,據統計,接收樣品時間期限從2 d到5 d不等,樣品的性質未受到氣溫等外界因素的影響。穩定性試驗結果顯示37 ℃放置9 d時仍能擴增出目的條帶。

3.5 實驗室間檢測能力的差異

實驗室檢測能力,除了測試預期結果滿意外,其他的細節,比如實驗記錄、溝通交流、問題處理等方面也可以全面反映出一個實驗室的綜合能力。通過此次能力測試活動,在參測實驗室中確實存在能力參差不齊的情況。

能力測試項目開展過程中,隨樣品寄送了測試項目的“作業指導書”,對參測單位的代碼、樣品的保存方式、狀態、采用標準、結果提交時間等信息做了詳盡的說明。但部分實驗室對作業指導書重視度不夠,并未認真閱讀和理解,從而影響檢測結果的判定。某些單位未按照作業指導書要求提交完整的實驗記錄,建議參加單位認真閱讀“作業指導書”,嚴格按照指導書的要求撰寫結果報告單和實驗記錄。

4 結語

2018—2022年先后開展的5次鯽造血器官壞死病病原檢測能力驗證項目,檢測樣品為CyHV-2-pol、CyHV-2-hel病毒樣顆粒溶液與草魚組織勻漿液制備的盲樣,檢測標準為GB/T 36194—2018《金魚造血器官壞死病毒檢測方法》。經統計,2018年有67家單位參加能力驗證測試,滿意率86.57%;2019年有71家單位參加能力驗證測試,滿意率83.10%;2020年有74家單位參加能力驗證測試,滿意率86.50%;2021年有106家單位參加能力驗證測試,滿意率87.74%;2022年有92家單位參加能力驗證測試,滿意率85.86%。除2019年滿意率稍低外,其余4年均超過85.00%。通過這5次能力驗證活動,客觀反映了國內實驗室CyHV-2核酸檢測技術水平較高,因技術問題導致檢測結果錯誤的占不滿意結果的22.80%,今后還需在實驗室管理和試驗操作細節上嚴格控制[17]。因此,通過此項能力驗證,表明大部分實驗室具備了鯽造血器官壞死病病原檢測能力和質量管理水平,可以承擔該病原的檢測和監測工作,同時各參加實驗室有必要將實驗室管理和技術人員能力測試考察工作長期化,以期不斷提升和維持各實驗室的檢測能力水平,為中國水生動物疫病監測和防控提供技術支持。