低共熔溶劑快速萃取-液質聯用法定量測定養殖水體中孔雀石綠殘留

李凱華,張楊,肖曼,徐媛原,林敏霞,林英揚,吳丹,魏芝芝,鐘仕花

(深圳市質量安全檢驗檢測研究院,深圳 518055)

低共熔溶劑(Deep eutectic solvents,DESs),是指由一定摩爾質量比的氫鍵受體和氫鍵供體組合熔溶形成的不同組分混合物,由Abbott等[1-2]于2003年首次報道。DESs的物理、化學性質與離子液體非常相似,因此也有人把其歸為一類新型離子液體或離子液體類似物,可廣泛應用于各個領域[3-5]。DESs正在成為一類新的可持續溶劑,通常被認為是可再生的、廉價的和綠色的“設計”溶劑,具有低揮發性、可生物降解、成本低、環境友好等優勢[6],減少了有機溶劑提取劑對實驗人員的健康影響,符合當前環保理念[7]。常見的可組成DESs氫鍵受體有季銨鹽(如氯化膽堿)、兩性離子(如甜菜堿)等,以氯化膽堿最常用;氫鍵供體有胺類、多元醇類等[8-10]。DESs的研究多集中在食品添加色素萃取檢測領域,劉慧強等[11]利用低共熔溶劑萃取液相色譜法檢測調味油中的酸性橙和堿性橙等食品中禁用的工業染料,考察了幾種不同DESs的提取效率,為食品中非法添加劑殘留檢測提供了新方法。周佳等[12]利用低共熔溶劑萃取高效液相色譜-串聯質譜法測定了肉制品和水產品中的3種非法添加劑,拓展了DESs的應用領域。蔡娜娜等[13]對低共熔溶劑的形成機理和應用進行了進一步研究,為開發利用低共熔溶劑提供新思路。

孔雀石綠(Malachite green,MG)是一種有毒的三苯甲烷類人工合成有機化合物,既是染料,也是殺菌劑,因其廉價及殺菌作用好,曾被廣泛用于水產養殖治療水霉病等。在生物體內,孔雀石綠被還原為穩定的隱色孔雀石綠(Leucomalachite green,LMG),其在生物體內蓄積、殘留時間長。經研究,孔雀石綠及代謝物隱色孔雀石綠具有致癌、致畸和致突變作用,已被中國在內的多個國家列入食品生產中禁用藥物[14-15]。

中國漁業養殖規模大,水產貿易值及人均消費量占食品消費比重持續增高[16],水產品質量安全顯得尤為重要。同時,種植、養殖等農業活動中大量使用的農藥、獸藥會通過陸源輸入進入水環境中,成為影響水產品質量安全的風險因子。目前,國內水產品中孔雀石綠檢測的標準方法有GB/T 19857—2005[17]、GB/T 20361—2006[18]、SC/T 3021—2004[19]、SC/T 9435—2019[20]等液相及液質檢測方法。養殖水體中的孔雀石綠檢測方法多為乙腈等有機溶劑提取,固相萃取柱富集凈化等前處理方式,SC/T 9435—2019《水產養殖環境(水體、底泥)中孔雀石綠的高效液相色譜法測定》利用乙腈和二氯甲烷混合提取、固相萃取柱富集凈化,液相色譜分離測定。趙東豪等[21]建立了水產養殖水體中49種獸藥的殘留量檢測方法,利用固相萃取法和冷凍干燥法測定,效果顯著,但耗時較長。張秀妍等[22]建立液相色譜串聯質譜法測定養殖水體中的孔雀石綠,水樣經二氯甲烷萃取濃縮,以1 mL濃度為50%的乙腈-乙酸銨溶液定容,內標法定量檢測,方法定量限為0.010 ng/mL,經驗證適用于養殖水體中孔雀石綠的測定。

本方法參考DESs萃取色素等非法添加劑的研究成果,研究了幾種不同低共熔溶劑的萃取效果,建立了養殖水體中孔雀石綠的快速高效萃取富集、液質聯用定量檢測方法,并為水產品、水產養殖環境(水質、底泥)中農獸藥殘留檢測方法研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用養殖用水來源于水產暫養池養殖用水。

四丁基溴化銨(色譜級,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);正辛醇(分析純,天津大茂化學試劑廠);二乙二醇(色譜純,MACKUN麥克林公司);三乙醇胺(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);正丁醇(分析純,天津大茂化學試劑廠);乙腈(色譜純,德國默克股份兩合公司);乙酸銨(色譜級,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);甲酸(色譜純97%,阿法埃莎(中國)化學有限公司);超純水。

孔雀石綠(純度91%)、隱色孔雀石綠(純度99.99%)、D5孔雀石綠(純度97.6%)、D6隱色孔雀石綠(純度96.5%),均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設備

1290 InfinityⅡ、TripleQuad5500液相色譜-串聯四級桿質譜儀(配ESI離子源,安捷倫、愛博才思公司);電導率儀(梅特勒托利多科技(中國)有限公司);Milli-Q Reference純水處理儀(法國Millipore公司);BSA2202S-CW型電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司);AS 30600BDT超聲波清洗儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司);旋渦振蕩器(美國Scientific Industries公司);0.22 μm有機濾膜(津騰,紫色膜)。

1.3 試劑制備

1.3.1 DESs制備

DESs的制備參考丁勇等[21]研究,選取四丁基溴化銨作為DESs氫鍵受體,二乙二醇、正辛醇、三乙醇胺和正丁醇4種多元醇或胺作為氫鍵供體進行對比實驗。按照一定摩爾比,分別稱取一定量的氫鍵供體和氫鍵受體于平底燒瓶,在60 ℃水浴鍋中加熱溶解,直到混合物完全變成澄清、透明液體,室溫冷卻備用。

1.3.2 乙酸銨溶液配制

準確稱取乙酸銨38.50 g,超純水溶解并定容至1 000 mL,配制成濃度為0.50 mol/L的乙酸銨溶液,4 ℃冷藏保存。流動相乙酸銨溶液配制,準確稱取乙酸銨0.385 g,超純水溶解并定容至999.50 mL,配制成濃度為5 mmol/L的乙酸銨溶液,加0.50 mL甲酸混勻。

1.3.3 標準溶液配制

準確稱取適量的孔雀石綠、隱色孔雀石綠、D5孔雀石綠和D6隱色孔雀石綠,分別用乙腈溶解配制成濃度為1 000 μg/mL的母液。逐級稀釋,乙腈定容,配制成孔雀石綠和隱色孔雀石綠混合外標標準工作溶液100 μg/L和10 μg/L;D5孔雀石綠和D6隱色孔雀石綠混合內標標準工作溶液1 000 μg/L和100 μg/L,-18 ℃條件下保存。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱：BEH C18(3.0 mm×50 mm,1.7 μm);柱溫：40 ℃;進樣量：2 μL;流速：0.50 mL/min;流動相A：乙腈;流動相B：鹽溶液(5 mmol/L乙酸銨+0.05%甲酸溶液)。

1.4.2 質譜條件

離子化模式：大氣壓電噴霧離子源(ESI),正離子模式;掃描方式：多反應監測(Multiple reaction monitoring,MRM);離子化電壓：5 500 V(正離子模式),離子源溫度：550 ℃,噴霧氣(GS1)、輔助氣(GS2)、氣簾氣(CUR)、碰撞氣(CAD)均為高純氮氣,使用前調節氣體流量使質譜靈敏度達到檢測要求。待測物母離子、定量定性離子、去簇電壓和碰撞電壓見表1。

表1 MRM掃描模式的參數Tab.1 Parameters of MRM

1.5 樣品處理

養殖水經0.45 μm濾膜過濾備用。取10 mL過濾后的養殖水,加入適量混合內標標準溶液和乙酸銨溶液,旋渦混勻。準確移取1 mL水樣至離心管內,加入低共熔溶劑,加蓋旋渦混勻1～2 min,靜置萃取5 min,待分層后,取全部上層萃取液至進樣瓶中,乙腈定容至1 mL,過0.22 μm有機濾膜,上機待測。

1.6 標準工作曲線繪制

準確移取100 μg/L的孔雀石綠和隱色孔雀石綠混合外標工作溶液,用乙腈乙酸銨溶液(1.3.2流動相乙酸銨溶液,v/v=7∶3)稀釋成濃度為5、10、20、50和100 μg/L的孔雀石綠和隱色孔雀石綠混合標準工作溶液;同樣準確移取100 μg/L的D5孔雀石綠和D6隱色孔雀石綠混合內標工作溶液20 μL,配制成內標濃度均為2.00 μg/L的標準工作曲線。

1.7 添加實驗

向已知10 mL空白養殖水中分別添加5、20和50 μL濃度為1 000 μg/L的孔雀石綠外標混合工作液,得到含量為0.5、2.0、5.0 μg/L的孔雀石綠和隱色孔雀石綠加標樣品,按2.5實驗方法進行處理測定,并計算方法線性范圍、檢出限、精密度和回收率。

1.8 數據處理

采用ESI電噴霧離子源,正離子掃描模式,分別對孔雀石綠和隱色孔雀石綠監測其母離子和2個子離子,母離子和子離子組成監測離子對,以MRM多反應監測對待測物進行定性,內標法進行定量分析。建立數據處理方法時,先檢測一個中濃度目標物,待所有離子出峰完成后,在愛博才思(AB)工作站中,按照相應離子出峰時間、半峰寬等參數,選擇使用曲線(不過零點)、對應的內標物來進行定量數據分析。

2 結果與分析

2.1 低共熔溶劑種類選擇

參照DESs組分及配比研究,本次試驗選擇四丁基溴化銨作為DESs氫鍵受體,二乙二醇、正辛醇、三乙醇胺和正丁醇4種多元醇作為氫鍵供體,按照摩爾比1∶2進行熔溶對比試驗。發現四丁基溴化銨和二乙二醇、三乙醇胺和正丁醇混合加熱溶解后液體均澄清,但在試驗中,分別加入上述DESs 400 μL于1 mL養殖水樣品中,混勻靜置,未分層。四丁基溴化銨和正辛醇進行混合加熱溶解,液體澄清。在試驗中,加入該DESs 400 μL于1 mL養殖水樣品,混勻靜置,呈油狀液滴浮于水面,分層明顯。

2.2 低共熔溶劑配比考察

以四丁基溴化銨作為DESs氫鍵受體,正辛醇作為氫鍵供體,按照摩爾比1∶2、1∶3、1∶4和1∶5,進行熔溶考察試驗,發現不同配比混合加熱后,均能形成澄清透明均一溶液,但溶液隨著氫鍵供體正辛醇增加,黏度變小。試驗統一在3組平行樣品中添加400 μL DESs的情況下,考察不同摩爾比對萃取效果的影響,發現按照摩爾比1∶4混合配制的DESs孔雀石綠和隱色孔雀石綠實驗離子強度最高,摩爾比1∶3混合配制的DESs回收率穩定(圖1),最終選取摩爾比為1∶3的DESs作為試驗萃取溶劑。

圖1 不同摩爾比DESs對離子強度和樣品回收率的影響(樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠添加濃度2.00 μg/L,n=3)Fig.1 Effects of DESs on ion strength and sample recovery with different molar ratios(Malachite green and Leucomalachite green were added at concentrations of 2.00 μg/L,n=3)

2.3 低共熔溶劑用量考察

添加摩爾比1∶3的DESs 100、200、300、400、500和 600 μL,發現添加100 μL DESs,未能形成明顯上層清液,添加200 μL DESs,萃取分層后,得到上清液約100 μL;當添加400 μL DESs,萃取分層后,得到上清液約200 μL,質譜離子強度最高,孔雀石綠和隱色孔雀石綠實驗回收率均穩定。隨著添加量增加,萃取分層越明顯,但離子響應強度有減弱現象(圖2),最終選擇添加400 μL DESs作為本試驗的最佳用量。

圖2 DESs添加量對離子響應和樣品回收率的影響(樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠添加濃度2.00 μg/L,n=3)Fig.2 Effect of DESs additive level on ion response and sample recovery rate (malachite green and leucomalachite green were added at concentrations of 2.00 μg/L,n=3)

2.4 低共熔溶劑電導率測定

室溫25 ℃條件下,分別對摩爾比1∶2、1∶3、1∶4和1∶5的DESs溶液進行電導率測定,分別測得DESs溶液電導率為244.7、209.5、140.3和90.6 μS/cm。

2.5 乙酸銨溶液添加實驗

乙酸銨是農獸藥殘留常用輔助離子化試劑。利用乙酸銨溶液離子化特性進行對照試驗,一組試驗在6個平行養殖水樣品中添加乙酸銨和不添加乙酸銨溶液進行對照,另一組分別向3個平行養殖水樣品中添加50、100、150、200和250 μL的乙酸銨溶液,在統一添加摩爾比1∶3的DESs萃取劑400 μL條件下,考察添加適當濃度乙酸銨溶液對孔雀石綠和隱色孔雀石綠離子強度和添加回收率的影響。在進行6個平行養殖水樣品中添加乙酸銨和不添加乙酸銨溶液進行對照試驗中,發現添加乙酸銨樣品溶液中檢測孔雀石綠平均離子強度高于未添加乙酸銨溶液,而隱色孔雀石綠離子強度相當。未添加乙酸銨樣品溶液中檢測孔雀石綠平均回收率<60%,而隱色孔雀石綠回收率>120%,而添加乙酸銨樣品溶液中孔雀石綠和隱色孔雀石綠回收率均在正常范圍(表2);在3個平行養殖水樣品中添加50、100、150、200和250 μL的乙酸銨溶液實驗中,發現添加濃度為0.5 mol/L的乙酸銨溶液200 μL條件下孔雀石綠和隱色孔雀石綠離子強度處于中等水平,但回收率最穩定(圖3)。綜上,選擇添加0.5 mol/L的乙酸銨溶液200 μL作為本試驗的最優添加量。

圖3 乙酸銨溶液添加量對離子強度和回收率的影響(樣品中孔雀石綠和隱色孔雀石綠添加濃度2.00 μg/L,n=3)Fig.3 Effect of ammonium acetate additive level on ion response strength and recovery rate(Malachite green and Leucomalachite green were added at concentrations of 2.00 μg/L,n=3)

表2 乙酸銨對回收率和離子強度影響Tab.2 Effect of ammonium acetate on recovery rate and ion response strength n=6

2.6 甲酸添加試驗

在養殖水體樣品中添加一定劑量的甲酸,對水體進行酸化處理。經檢測,與未添加甲酸養殖水樣品檢測孔雀石綠和隱色孔雀石綠對比,對目標物提取及離子峰形等未產生明顯作用,因此該養殖水體前處理方法無需添加甲酸。

2.7 標準曲線和離子圖譜

用流動相作為標準曲線定容液。標準曲線回歸方程和相關系數見表3;加標濃度2.00 μg/L樣品的孔雀石綠離子流色譜圖見圖4;加標濃度2.00 μg/L樣品的隱色孔雀石綠離子流色譜圖見圖5。

圖4 孔雀石綠2.00 μg/L色譜基線及離子出峰時間Fig.4 Chromatographic baseline and ion peak exit time of malachite green 2.00 μg/L

圖5 隱色孔雀石綠2.00 μg/L色譜基線及離子出峰時間Fig.5 Chromatographic baseline and ion peak exit time of leucomalachite green 2.00 μg/L

表3 標準曲線回歸方程、相關系數表和檢出限Tab.3 Standard curve regression equation,correlation coefficient table and detection limit

2.8 方法檢出限、回收率和精密度實驗

2.8.1 方法檢出限

以空白養殖水為基質,最低添加濃度進行實驗,依據GB/T 27417—2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》[23]確定檢出限的方法,采用信噪比法計算檢出限,根據3倍信噪比確定該方法的檢出限見表3,孔雀石綠和隱色孔雀石綠的方法檢出限分別為0.006 3和0.003 0 μg/L,說明該方法靈敏度較高。

2.8.2 回收率和精密度

向已知未檢出養殖水中分別添加5、20和50 μL濃度為1 000 μg/L的孔雀石綠混合外標工作液,得到含量為0.5、2.0、5.0 μg/L的孔雀石綠和隱色孔雀石綠加標樣品,按1.5實驗方法進行處理測定,平行測定6次,實驗結果測得孔雀石綠的回收率分別為91.9%、110.4%和109.7%,相對標準偏差(Relative standard deviation,RSD)分別為8.3%、5.4%和3.6%。隱色孔雀石綠的回收率分別為76.4%、110.8%和115.8%,RSD分別為7.0%、4.4%和3.0%(表4)。

表4 回收率和相對標準偏差Tab.4 Recovery rate and relative standard deviation n=6

3 討論

對于DESs的形成機理,普遍認為是氫鍵的作用,也有認為是離子鍵、范德華力[24]共同作用形成。四丁基溴化銨是一種有機鹽,分子式為C16H36BrN,純品為白色晶體或粉末,其熔點為117 ℃,氫鍵受體數量為1。正辛醇是一種有機化合物和飽和脂肪醇,分子式為C8H18O,常溫下是無色透明狀液體,其熔點為-16.7 ℃,氫鍵供體數量為1,氫鍵受體數量為1。DESs的電導率隨著氫鍵供體正辛醇含量的增加而減小,隨著四丁基溴化銨含量的增加而增加。

利用四丁基溴化銨作為DESs氫鍵受體,正辛醇作為氫鍵供體制備的DESs,對富集萃取孔雀石綠、隱色孔雀石綠具有較好的選擇性,孔雀石綠作為三苯甲烷類工業色素染料,研究表明DESs對色素染料具有較好的富集萃取作用[25]。DESs的熔點、黏度、電導性和溶解性隨氫鍵供體和受體選擇及摩爾比率變化而變化,并對萃取產生影響。因此,需要選擇適當的DESs對目標物進行富集萃取。

本次利用DESs萃取富集養殖水體中孔雀石綠和隱色孔雀石綠試驗,樣本量為10 mL,取1 mL樣本進行快速萃取富集,乙腈定容混勻溶解。為防止養殖水體中藻類等雜質影響色譜柱和質譜系統,導致系統污染、基質效應,最后定容液須經過0.22 μm有機濾膜過濾,進行有效除雜,保護色譜柱和質譜系統。

乙酸銨溶液常被用于液相質譜流動相中,與甲酸、乙酸等配制形成低離子強度的緩沖溶液,有利于分析不同pH值的化合物,有改善峰形、提高柱效和保護色譜柱等作用[26]。本次養殖水體中直接加入一定摩爾濃度的乙酸銨溶液,經實驗比對,對改善目標物離子峰形及穩定回收率發揮重要作用。

定量限、檢測限比較,以信噪比S/N≥3確定檢出限,S/N≥10確定定量限。本試驗測得孔雀石綠和隱色孔雀石綠的方法檢出限分別為0.006 3和0.003 0 μg/L。綜合對比張秀妍等[22]建立液相色譜串聯質譜法測定養殖水體中的孔雀石綠,定量限0.010 ng/mL(檢出限0.005 ng/mL)。丁勇等[27]液相色譜-串聯質譜法同時測定養殖水體中孔雀石綠和結晶紫含量,定量限2.0 ng/L。本試驗測得孔雀石綠檢出限與其他QuEChERS、固相萃取等方法檢出限相當。

目前關于養殖水中的孔雀石綠檢測方法研究較多,相關研究及標準[17-22]采用乙腈、二氯甲烷等有機溶劑提取、固相萃取柱富集、氮吹濃縮、定容,濾膜過濾等凈化方式測定養殖水中孔雀石綠等方法,效果顯著,缺點是試劑耗量大,耗時較長。DESs在農獸藥領域應用研究尚不多見,利用DESs快速萃取富集目標物,建立養殖水中孔雀石綠獸藥殘留的檢測方法,無需過柱、氮吹濃縮,不僅環保,而且節約時間、試劑和耗材,節省了實驗室資源,并為利用低共熔溶劑快速高效萃取養殖環境及水產品中多種農獸藥殘留、液質定量測定提供更廣闊的研究思路。

4 結論

水產品獸藥殘留檢測中,禁用獸藥孔雀石綠常有檢出,說明在養殖或運輸環節中,依然存在違規添加孔雀石綠的風險。本試驗方法在10 mL過濾水樣中,加入適量內標物質和0.5 mol/L的乙酸銨溶液200 μL,混勻取1 mL水樣于微量離心管中,加入400 μL以四丁基溴化銨作為氫鍵受體,正辛醇作為氫鍵供體,按照摩爾比1∶3混合制備的 DESs,渦旋混勻靜置提取上層萃取液,乙腈定容至1 mL,過0.22 μm有機濾膜,使用液質聯用儀進行定量測定,其優點是萃取及檢測試劑消耗少、耗時短、靈敏度高、準確性好。通過驗證,該方法適用于開展養殖水體中孔雀石綠的快速定量檢測,并為下一步探索利用低共熔溶劑萃取養殖環境及水產品中多種農獸藥殘留檢測方法研究提供參考方向。