ICP-MS法測定砷脂攝入對小鼠砷蓄積及礦物元素水平的影響

陳佳佳,鐘映雄,汪卓,李瑞,賈學靜,陳建平,劉曉菲,宋兵兵,鐘賽意,2,3*

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東 湛江 524088;2.廣東海洋大學深圳研究院,廣東 深圳 518108;3.大連工業大學 海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心,遼寧 大連 116034)

砷,是一種非金屬元素,在自然界中廣泛存在,被國際癌癥研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)確定為致癌物。砷中毒會對皮膚、神經、免疫和生殖系統造成損傷[1]。砷可分為無機砷和有機砷,砷脂是存在于微生物、植物、魚類組織中的一類中性脂質類似物[2],屬于有機砷。不同海洋生物中砷化合物的形態豐度各不相同,如紫菜中檢測出了無機三價砷、無機五價砷、砷甜菜堿、砷膽堿和砷糖5種砷形態,其中砷糖含量最高,占總砷含量的66.9%[3]。砷脂在海洋生物中含量較高,藻類、真菌和貝類的砷脂含量占總砷含量的4.2%～46.0%[4-5];魚類中的砷脂含量約占總砷含量的35%[6],某些魚類的肝臟部位[7]以及魚油[8-9]中的砷脂含量更高,前者占總砷含量的62.3%,后者占總砷含量的70%及以上。因此,飲食途徑是人們砷脂暴露的主要來源。

砷的毒性與砷形態及其在體內的生物轉化行為息息相關,對海產品的質量安全有重要影響[10]。一般來說,無機砷毒性大于有機砷,通常認為砷脂毒性極低,或者直接認為其無毒[11-13],中國食品安全評價以總砷含量或無機砷含量為指標,對砷脂不予關注。但近年來隨著技術發展,砷脂已被證明在人體內蓄積,對人體具有細胞毒性,某些砷脂在μmoL級別甚至可以穿越血腦屏障造成神經毒性[14-16],會對人體健康造成潛在危害,人們對砷脂可能含有的毒性感興趣。肝臟和腎臟是砷化合物在體內代謝、蓄積和慢性毒作用的主要靶器官,因而其組織結構和功能極易受到損傷[17-18]。通常,生物體內的礦物元素處于一種平衡狀態,這些元素在生長發育、新陳代謝、免疫調節和其他生理活動中發揮著不可替代的作用[19-24]。研究表明,氧化應激是砷肝毒性的關鍵致病機制[25-27]。體內礦物元素失衡可能會誘發氧化應激并導致肝病[28-30]。

常見的元素分析方法有原子吸收法[31]和原子熒光法[32]等,原子吸收法是利用被測元素原子蒸氣中的基態原子對該元素的共振線的吸收來進行測定的。原子熒光法的原理是基態原子吸收合適的特定頻率的輻射而被激發到高能態,在激發過程中以光輻射的形式發射出特征波長的熒光。這些方法局限性在于單元素檢測,易受到光譜干擾和檢測效率低。電感耦合等離子體質譜(Iductively coupled-plasma mass spectrometry,ICP-MS)是一種多元素同步分析方法[33],靈敏度高,能夠跟蹤多元素同位素信號變化等[34],且檢出限低,對于結構復雜、生物細胞中痕量的砷化合物來說是最可靠的形態分析方法[35-36]。因此,本研究利用ICP-MS多元素同時在線檢測和靈敏度高的優點來對小鼠組織中的礦物元素進行檢測,為初步判斷海產品中砷脂的攝入對小鼠的肝腎組織造成的影響提供技術手段,為后續砷脂的毒理學相關內容提供實驗基礎,也為海產品風險評估提供有效實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6J小鼠(6周齡,SPF級),斯貝福(北京)生物技術有限公司;硝酸(優級純),30%過氧化氫(優級純),國藥集團化學試劑有限公司;調諧液、內標液,美國Agilent公司;多元素混合標準溶液,國家標準物質研究中心;無水硫酸鈉(分析純)、二氯甲烷(分析純)、乙酸乙酯(分析純)、甲醇(分析純)、乙醇(分析純),廣東光華科技股份有限公司;濃鹽酸(分析純)、乙醚(分析純)、硅膠(分析純),國藥集團化學試劑有限公司;1-溴十五烷(>98%)、1-溴十六烷(97%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;1-溴十八烷(≥97%)、二甲基胂酸(≥98%)、亞硫酸氫鈉[≥58.5%(SO2)]、碘化鉀(99%)、氫氧化鈉(分析純),氘代甲醇、氘代氯仿,美國Sigma-Aldrich公司。3種砷脂(AsHC 332、AsHC 346和AsHC 374,數字為砷脂相對分子質量)的合成參考Taleshi等[37]文獻,主要通過以下三步法合成砷脂,1)以二甲基胂酸與亞硫酸氫鈉、鹽酸和碘化鉀為原料,發生還原反應和取代反應得到碘化二甲胂;2)碘化二甲胂與氫氧化鈉在一定條件下發生取代反應得到雙(二甲基胂)氧化物;3)雙(二甲基胂)氧化物在一定條件下先發生氧化分解,再與溴代烷烴發生取代反應加入碳鏈,從而合成對應砷脂,再經過硅膠柱分離純化,并利用核磁共振、高分辨率質譜和電感耦合等離子體質譜對其鑒定。砷脂分子量大小取決于溴代烷烴的側鏈長度。通過上述三步化學法合成AsHC 332、AsHC 346和AsHC 374三種砷脂,結構式如圖1所示。合成的砷脂先用無水乙醇溶解至中間濃度,再用生理鹽水稀釋至乙醇濃度為1%,已有文獻表明1%無水乙醇不會對小鼠引發任何毒性作用[38]。

圖1 AsHC 332、AsHC 346和AsHC 374 3種砷脂結構式Fig.1 Molecular structure of AsHC 332、AsHC 346 and AsHC 374 synthesized in this work

1.2 儀器與設備

Agilent 7500cx型ICP-MS,美國安捷倫公司;Multiwave PRO 41HVT56型微波消解儀,奧地利安東帕公司;Avance NEO 400MHz核磁共振儀,美國Agilent公司;qtof6550型高分辨率質譜,德國Bruker公司;DF-101S加深款集熱式磁力攪拌器,上海力辰邦西儀器科技有限公司;EYELA N-1300系列旋轉蒸發儀,日本EYELA公司;MGS-2200H氮吹儀,杭州瑞誠儀器有限公司;DZF-6050 真空干燥箱,上海一恒科學有限公司;AUW120型電子天平,日本島津公司;超純水設備,日本Panasonic公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 試驗動物的分組與操作

40只6周齡SPF級雄性C57BL/6小鼠,由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供實驗動物質量合格證[許可證號：SCXK(京)2019-0010],在室溫(25±1)℃,相對濕度(55±5)%,12 h晝夜交替的環境下自由給水進食,對水瓶、籠子、墊料等喂養所需材料進行高壓蒸汽滅菌,并隔天更換。小鼠經適應性喂養1周后被隨機分成溶劑對照組和3個實驗組,每組10只。溶劑對照組灌胃1%乙醇的生理鹽水,實驗組分別灌胃AsHC 332、AsHC 346和AsHC 374,灌胃劑量均為3 mg/kg,每次灌胃體積10 μL/g,灌胃4周,每周記錄小鼠的體重。灌胃結束,乙醚麻醉,取小鼠內臟,用生理鹽水清洗并稱重記錄,根據公式(1)計算得臟器系數。整個實驗過程符合實驗倫理學要求,盡可能減少動物的使用量,減少動物的應激、痛苦和傷害。

臟器系數(%)=mx/m28×100%

式(1)

其中,mx為心、肝、脾、肺、腎等臟器的質量,m28為灌胃28 d后小鼠的體重。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取小鼠臟器0.2～0.3 g(精確至0.000 1 g)于微波消解罐中,加入6 mL濃硝酸和0.5 mL 30%過氧化氫溶液。將消解罐放入微波消解儀中,按照表1進行消解。消解完畢,趕酸,冷卻定容至50 mL,準備ICP-MS上機測砷(As)含量。對肝臟和腎臟這兩個代謝的主要靶器官測鉀(K)、鈉(Na)、鈣(Ca)、鎂(Mg)、鋅(Zn)、鐵(Fe)、銅(Cu)、錳(Mn)、鈷(Co)、鉻(Cr)、鎳(Ni)和硒(Se)12種礦物元素的含量。

表1 微波消解程序Tab.1 The parameter information of microwave digestion

1.3.3 ICP-MS分析

ICP-MS開機后,使用調諧液在線優化各項參數,使分辨率和靈敏度等各項儀器狀態達到最佳,最佳工作參數為：射頻功率1 550 W、發射功率1 W、霧化室溫度2 ℃、等離子體氣流量15 L/min和載氣流量1 L/min。元素含量測定過程中加入內標元素校正儀器響應信號的變化。將多元素一系列標準溶液按低到高濃度依次上機,測定相應濃度的信號值。以標準溶液質量濃度為橫坐標、信號強度為縱坐標繪制標準曲線,根據標準曲線采用外標法定量。實驗過程中,設計平行樣、加標回收率及精密度試驗以確保檢測數據的準確性。

1.4 數據統計與分析

2 結果與分析

2.1 3種砷脂對小鼠體重及臟器系數的影響

由表2可知,灌胃前砷脂處理組和溶劑對照組的小鼠體重并無顯著性差異。與灌胃前小鼠體重相比,灌胃28 d后小鼠體重顯著增加(P<0.05),但砷脂處理組與溶劑對照組的小鼠體重并無顯著性差異(P>0.05)。此外,從小鼠心、肝、脾、肺和腎的臟器系數來看,砷脂處理組和溶劑對照組內臟的臟器系數并無顯著性差異(P>0.05)。由此可得,短期砷脂暴露并不會對小鼠的正常生長發育造成影響。

表2 3種砷脂對小鼠體重及臟器系數的影響Tab.2 Effects of three arsenolipids on body weight and organ coefficients in mice

2.2 3種砷脂在小鼠臟器中的砷蓄積情況

由圖2可知,與溶劑對照組相比,3種砷脂的攝入均會在小鼠的心、肝、脾、肺和腎臟中造成明顯的砷蓄積,但蓄積趨勢并不一致。3種砷脂AsHC 332中在腎臟和肝臟的砷蓄積作用強于AsHC 346和AsHC 374,而對心、肺和脾來說,3種砷脂中AsHC 374的砷蓄積作用強于AsHC 332和AsHC 346。這可能與AsHC 332、AsHC 346和AsHC 374的結構不同、分子量不同,毒作用的靶器官不同有關。

圖2 3種砷脂在小鼠心、肝、脾、肺和腎臟中的砷蓄積情況注：AsHC 332組、AsHC 346組和AsHC 374組與溶劑對照組進行比較;其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。Fig.2 Arsenic accumulation in the heart,liver,spleen,lung and kidney of mice treated by three arsenolipidsNote：Group AsHC 332,Group AsHC 346,and Group AsHC 374 were compared with solvent control Group,where *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,and ****P<0.000 1.

2.3 3種砷脂對小鼠整體的砷蓄積情況

由圖3可知,3種砷脂攝入后會對小鼠整體造成砷蓄積。以AsHC 332和AsHC 346為例,二者的攝入腎臟中的砷蓄積作用是最強的,其次是肝臟,這是因為肝臟和腎臟是砷化合物在體內代謝、蓄積和慢性毒作用的主要靶器官,因而其組織結構和功能極易受到損傷[17-18]。有趣的是,對AsHC 374來說,砷蓄積作用最強的臟器是心臟、其次是肝臟和腎臟,因為心臟也是脂質代謝的場所[39],這可能與AsHC 374在心臟發生的代謝相關。

圖3 3種砷脂對小鼠整體的砷蓄積情況注：(a)為AsHC 332,(b)為AsHC 346,(c)為AsHC 374;心、肝、脾、肺與腎進行比較,其中*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1。Fig.3 Overall arsenic accumulation in mice treated by three arseniolipidsNotes：(a) for AsHC 332,(b) for AsHC 346,and (c) for AsHC 374;heart,liver,spleen,and lungs were compared with kidneys,where *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 and ****P<0.000 1.

2.4 3種砷脂對小鼠肝臟中12種礦物元素水平的影響

由表3可知,3種砷脂的攝入導致小鼠肝臟中12種礦物元素水平發生變化。與溶劑對照組相比,AsHC 332使Na、Mg和Cr元素顯著上升,K、Co、Ni和Se元素顯著降低;AsHC 346使Na元素顯著上升,K、Zn、Fe、Ni和Se元素顯著降低;AsHC 374使Na和Ca元素顯著上升,Cu、Zn、Fe、Co、Ni、Mn和Se元素顯著降低?？傊?砷脂攝入會引起肝臟內12種礦物元素水平發生顯著變化,特別是Se、Co、Cu、Zn等與抗氧化酶相關元素的代謝紊亂[30],這可能與砷脂的肝臟毒性有關。

表3 3種砷脂對小鼠肝臟12種礦物元素含量的影響Tab.3 Effects of three arsenolipids on the content of 12 mineral elements in the liver of mice

2.5 3種砷脂對小鼠腎臟中12種礦物元素水平的影響

由表4可知,3種砷脂的攝入導致小鼠腎臟中12種礦物元素水平發生變化。與溶劑對照組相比,AsHC 332使Na、Fe、Mn、Se和Cr元素顯著上升,Ni元素顯著降低;AsHC 346使Na元素顯著上升,Fe和Ni元素顯著降低;AsHC 374使Na元素顯著上升,Ca和Ni元素顯著降低?？傊?砷脂攝入會引起腎臟內7種礦物元素水平發生顯著變化,包括Se、Fe、Mn等與抗氧化酶相關元素的代謝紊亂[30],這可能與砷脂的腎臟毒性有關。

表4 3種砷脂對小鼠腎臟12種礦物元素含量的影響Tab.4 Effects of three arsenolipids on the content of 12 mineral elements in the kidney of mice

3 結論

海產品中富含各種形態的砷,砷的毒性又與其形態息息相關。隨著科技的發展,研究者們對有機砷的認識越來越深入,發現砷脂并非無毒,有些砷脂可以穿越血腦屏障在腦組織中蓄積,影響神經系統從而對人類健康造成潛在危害,甚至有些砷脂的毒性比無機砷更強,因而人們對砷脂可能具有的毒性感興趣。本研究利用ICP-MS檢測方法同步檢測小鼠臟器中As、K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Co、Ni、Mn、Se和Cr元素含量,初步判斷砷脂攝入對小鼠肝腎組織的可能影響。研究結果表明,短期砷脂暴露不會影響小鼠的正常生長發育,但會在小鼠內臟中引起砷蓄積,不同砷脂的砷蓄積作用不同,但總的來說,腎臟的砷蓄積作用最強,肝臟次之。此外,砷脂的攝入會引起肝臟內K、Na、Ca、Mg、Cu、Zn、Fe、Co、Ni、Mn、Se和Cr這12種礦物元素水平和腎臟內Na、Ca、Fe、Ni、Mn、Se和Cr這7種礦物元素水平發生顯著變化,尤其是造成Cu、Zn、Se、Fe、Mn等與抗氧化酶合成相關的元素代謝紊亂,說明其具有一定的肝臟毒性和腎臟毒性,但具體毒性大小和毒作用機制有待深入研究?？傊?本研究可為后續深入研究砷脂的肝臟和腎臟毒作用機制提供實驗基礎,為海產品中砷的風險評估提供數據支撐。