菜籽粕硫苷的乙醇提取工藝優化及營養成分研究

周 潔,閆麗華,王 沛,楊潤強,謝 翀

南京農業大學 食品科技學院,江蘇 南京 210095

油菜為十字花科、蕓薹屬植物,是我國四大油料作物之一,可分為芥菜油菜、白菜型油菜和甘藍型油菜三大品種[1]。油菜籽加工成菜籽油后可產生50%～55%的菜籽粕,其蛋白質含量較高(約35%)且氨基酸組成合理均衡,消化率高[2]。然而,菜籽粕中含有較多的抗營養成分,包括硫代葡萄糖苷、植酸和單寧[3]等,限制了其在飼料和食品中的應用,但硫代葡萄糖苷因獨特的生理活性受到廣泛關注[4]。

硫代葡萄糖苷簡稱硫苷,是十字花科類植物中存在的一類重要的次生代謝產物,其在黑芥子酶的催化下可被轉化為異硫氰酸酯、惡唑烷硫酮和腈類等多種產物,目前在油菜籽中發現的硫苷種類就高達120多種[5],具有多種生理功能,但過量食用也會產生不良影響[2]。由于硫苷的酶解產物異硫氰酸酯具有抗菌[6]、抗氧化[7]、抗癌[8]等多種生理功能,研究硫苷的綠色高效提取工藝可為菜籽粕的高值化利用提供參考。目前,硫苷的提取主要采用浸提法[9]、超聲波萃取法[10]等,通常采用水[11-12]、甲醇[13-14]、氯仿[15]等作為溶劑,但這些方法因操作煩瑣、耗時較長等原因,在硫苷提取中的應用有限。王芳等[16]采用78%乙醇溶液從菜籽粕中提取硫苷,最終硫苷提取量為18.72 mg/g;龍芳[17]使用超聲輔助提取的方法,以70%甲醇為提取劑從西蘭花莖中提取硫苷,硫苷提取量達到0.732 mg/mL;F?rster等[18]以70%甲醇為提取劑,硫苷提取量達到118 μmol/g。

菜籽粕中硫苷含量較為豐富,選擇安全試劑并找到高效簡便的硫苷提取方法十分有必要。雖然甲醇對硫苷的提取效果較好,且相關提取方法較為完善,但考慮到甲醇具有毒性,選用綠色溶劑更具有實際意義和應用價值。根據文獻[16]報道,乙醇對硫苷也有較好的提取效果,故本研究以乙醇為提取劑。在硫苷的諸多檢測方法中,氣相色譜法、高效液相色譜法等耗時較長、工作量較大,相較而言氯化鈀比色法[19]更加快速準確且成本低、靈敏度高,適用于大量樣品的測定分析,故本研究采用氯化鈀法進行硫苷含量的測定。作者以乙醇為提取劑,考察提取時間、料液比、pH值、提取溫度等對硫苷提取量的影響,選擇具有顯著影響的因素進行響應面試驗,并探究提取前后菜籽粕中營養物質的變化,從而為菜籽粕的高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試材與試劑

菜籽餅粕由南京隆盛植物油脂有限公司提供,所采用的制油工藝為壓榨法。將菜籽餅粕粉碎后過100目篩,于-20 ℃儲存備用。

烯丙基硫苷(標準品)：法國Extrasynthese公司;乙醇(分析純)、羧甲基纖維素鈉：廣東光華科技股份有限公司;氯化鈀：美國J.T.Baker公司。

1.2 儀器與設備

FSD-100A電動磨粉機：臺州市新恩精密糧儀有限公司;TDL-5-A離心機：上海安亭科學儀器廠;WH-3微型旋渦混合儀：上海瀘西分析儀器廠;HH-6數顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司;JA2003電子天平：上海精密科學儀器有限公司;MUL 9000(B)-H-30超純水系統：昆山總馨機械有限公司;KQ-250DB數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司;DHG-9030A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司;UV-2802紫外-可見分光光度計：尤尼柯上海儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硫苷提取方法

參考Alexandre等[20]的方法并稍加修改。0.2 g菜籽餅粕中加入2 mL一定pH值的70%乙醇溶液,70 ℃水浴15 min進行滅酶處理。滅酶后于一定溫度下水浴一定時間提取硫苷,其間每隔5 min取出渦旋10 s。6 000 r/min離心10 min后吸取上清液至5 mL容量瓶中,超純水定容至5 mL后轉移到10 mL離心管中,8 000 r/min離心10 min后取上清液測定硫苷提取量。為避免溶劑沸騰汽化,采用密閉的離心管為提取容器,并在離心管內加入少量沸石以防止在加熱提取的過程中出現沸騰現象。提取完成后提取液先于水中降至常溫再取出進行后續試驗。

1.3.2 硫苷提取優化試驗

單因素試驗：以硫苷提取量作為考察指標,提取時間選擇5、10、20、30、40、50 min,提取溫度選擇40、50、60、70、80、90 ℃,pH值選擇3、4、5、6、7。

響應面試驗：在單因素試驗的基礎上以硫苷提取量為響應值進行響應面優化試驗,采用Design-Expert對試驗數據進行線性回歸和方差分析,得出最佳提取條件。

1.3.3 硫苷初提取物的醇沉處理

硫苷初提取物的醇沉操作參考Hui等[21]的方法并稍加修改。稱取一定量的硫苷初提取物于燒杯中,按料液比1∶50 g/mL加入90%的乙醇溶液,攪拌2 h后靜置過夜。4 ℃下8 000 r/min離心20 min,上清液即為醇沉后的硫苷溶液,合并上清液,旋蒸除去大部分乙醇后預凍于-80 ℃冰箱內,凍干后即為醇沉后的硫苷提取樣品。

1.4 測定指標

1.4.1 硫苷提取量測定

硫苷標準曲線繪制：準確稱取5 mg烯丙基硫苷(Sinigrin,C10H16KNO9S2)標準品于5 mL離心管中,加入2.2 mL超純水配制成5.72 μmol/mL的烯丙基硫苷標準溶液。取7支10 mL離心管,依次加入配制好的烯丙基硫苷標準溶液0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL,并用超純水補足至0.8 mL,再依次加入2 mL 0.1%羧甲基纖維素鈉溶液和1 mL氯化鈀溶液,于24 ℃水浴2 h后以第1支離心管內溶液作為參比溶液,于540 nm處測定其他溶液的吸光度,以硫苷濃度作為橫坐標,以吸光度作為縱坐標繪制標準曲線。

硫苷提取量測定：加入分散劑羧甲基纖維素鈉溶液,可使硫苷與氯化鈀反應生成有色硫苷鈀溶膠清液,硫苷含量越高,溶液顏色越深,從而通過比色法對硫苷進行定量[22]。參考賀霞等[22]的方法并稍加修改,取1.3.1中制備好的硫苷提取液1.5 mL于10 mL離心管中,并用超純水補足至2 mL,再依次加入2 mL 0.1%羧甲基纖維素鈉溶液和1 mL氯化鈀,24 ℃水浴反應2 h。用分光光度計在波長540 nm的條件下,以羧甲基纖維素鈉-氯化鈀空白溶液作為參比溶液,測定各硫苷提取液的吸光度,再根據烯丙基硫苷標準曲線計算樣品中的硫苷提取量。

硫苷提取量(mg/g)=C×V×397/m,

式中：C為由烯丙基硫苷標準曲線計算得到的相應硫苷濃度,μmol/mL;m為稱取的菜籽粕粉末的質量,g;V為制得硫苷提取液的總體積,mL。

1.4.2 粗蛋白、脂肪及總糖含量測定

粗蛋白含量的測定參照GB/T 6432—2018;脂肪含量的測定參照GB 5009.6—2016;總糖含量的測定參照GB 5009.8—2016。

1.5 數據統計與分析

試驗設3次重復,結果換算成硫苷提取量(mg/g),以平均值±標準差表示,數據采用Design Expert 8.1.6(Version 8.1.6 Stat-Ease Inc.,Minneapolis,MN,USA)軟件進行處理,利用SPSS 19.0進行顯著性分析,采用Duncan′s進行均值間的多重比較,設定顯著性水平為P<0.05,極顯著水平為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間

由圖1可知,在提取劑為70%乙醇、料液比為1∶10、提取溫度為60 ℃、pH 7的條件下,隨著提取時間的延長,硫苷提取量不斷增加,由5 min時的19.16 mg/g逐步增加至30 min的23.12 mg/g,此時提取液中硫苷含量達到峰值,此后隨著提取時間的繼續延長,硫苷提取量出現小幅下降,下降幅度約0.5 mg/g?？赡苁怯捎谔崛∵^程屬于溶液內部成分的擴散反應過程,因此溶液內部溶質成分的分解及擴散需要一定的時間[23],故當提取時間較短時,菜籽粕中的硫苷還未能與提取劑乙醇充分接觸,硫苷不能及時溶出,故導致硫苷提取量較低;而提取時間過長,菜籽粕中的硫苷已基本溶出,乙醇提取劑與硫苷之間達到動態平衡,繼續增加提取時間,反而會導致菜籽粕中其余雜質溶出,從而使提取液中硫苷純度下降,故確定最佳提取時間為30 min。研究表明,過長的時間可能造成硫苷的降解或雜質溶出,導致最終提取量下降。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2、圖3同。圖1 提取時間對硫苷提取量的影響Fig.1 Effects of extraction times on the glucosinolates yield

2.1.2 提取溫度

由圖2可知,在提取劑為70%乙醇、料液比為1∶10、提取時間為10 min、pH 7的條件下,隨著提取溫度的不斷升高,硫苷提取量也相應提高,50～70 ℃時硫苷提取量升高并不顯著,僅由20.32 mg/g增至20.89 mg/g,增幅僅為0.57 mg/g。而當提取溫度升高至80 ℃時,硫苷提取量顯著增加,由20.89 mg/g增至24.46 mg/g,增幅較大,為3.6 mg/g。而后隨著溫度的繼續升高,硫苷提取量逐漸趨于穩定。這可能是由于提取過程屬于溶液內部成分的擴散反應過程,溫度升高可使擴散反應加劇,促使提取劑乙醇與菜籽粕中的硫苷不斷接觸,加快硫苷的溶出速率,從而使提取量上升[18]。但考慮到提取溫度過高可能會使得提取液中的部分硫苷發生降解而導致提取量下降,故確定最佳提取溫度為80 ℃。

圖2 提取溫度對硫苷提取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the glucosinolates yield

2.1.3 提取pH 值

由圖3可知,在提取劑為70%乙醇、料液比為1∶10、提取時間為10 min、提取溫度為60 ℃的條件下,當pH值在3～7的范圍內變化時,硫苷提取量沒有發生明顯的變化,最大提取量是pH 3時的21.2 mg/g,最小提取量是pH 4時的20.31 mg/g,僅差0.9 mg/g,可見pH值對菜籽粕中硫苷提取量的影響不明顯,因此在后續響應面試驗設計優化中不再考慮pH值。

圖3 提取pH值對硫苷提取量的影響Fig.3 Effect of extraction pH on the glucosinolates yield

雖然pH值對硫苷提取量的影響不明顯,但硫苷本身對pH值是比較敏感的,隨著pH值的降低,硫苷的提取量也會不斷提升,相較而言中性環境下大部分硫苷具有較好的穩定性[24]。同時考慮到氯化鈀法測定的是總硫苷含量,pH值的顯著影響或許只針對某種特定品種的硫苷,而對整體硫苷提取量的影響并不十分顯著[25]。因此綜合考慮,選擇pH 7進行硫苷的提取和儲存。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 試驗設計與結果

以硫苷提取量為響應值,采用Design-expert 8.05設計兩因素三水平的響應面試驗,如表1所示。

表1 響應面試驗設計與結果Table 1 Response surface experimental design and results

2.2.2 回歸方程與方差分析

對試驗數據進行多元回歸擬合,得到擬合方程：Y=25.6+0.86A+6.99B-0.23AB-1.47A2+2.4B2-1.38A2B-1.11AB2,方差分析見表2。

表2 回歸模型的方差分析Table 2 Analysis of variance of regression model

由表2可知,該模型的P為0.000 9,說明回歸方程較為顯著;R2=0.997 0,說明該方程的擬合度較好;失擬項P>0.05,不顯著,說明模型合適;變異系數為0.67%<15%,說明預計結果比較準確可信。對回歸方程中各數據進一步分析可知,單因素對硫苷提取量的影響程度為提取溫度(B)>提取時間(A),影響極為顯著的有B、A2、B2(P<0.01),較為顯著的有A、A2B、AB2(P<0.05)。

2.2.3 因子交互作用分析

提取溫度和提取時間交互作用影響硫苷提取量的曲面和等高線見圖4,當提取時間一定時,隨著提取溫度的增加,硫苷提取量呈現逐步上升的趨勢;當提取溫度一定時,隨著提取時間的增加,硫苷提取量呈現先增大后減小的趨勢,且響應面坡度比較陡峭,說明提取溫度和提取時間的交互作用比較顯著。

圖4 提取溫度和提取時間交互作用影響硫苷提取量的響應曲面和等高線Fig.4 Response surface and contour plots for the effect of variables on the extraction volume of glucosinolates versus extraction time and extraction temperature

2.2.4 模型優化與驗證

通過軟件分析響應曲面模型得出最佳提取條件：提取時間28.87 min,提取溫度90 ℃,在此條件下預測硫苷提取量為35.01 mg/g,綜合考慮工業化及實際操作等因素后修正最佳提取條件：提取時間28 min、提取溫度90 ℃,進行3次平行驗證試驗,硫苷提取量為34.32 mg/g,與理論值的相對誤差為2.0%,證明試驗結果與模型擬合較好。

2.3 菜籽粕及硫苷提取物主要成分分析

為充分了解菜籽粕主要營養成分的變化,對菜籽粕提取前后以及醇沉前后的提取物進行了主要成分分析。

2.3.1 菜籽粕提取前后主要營養成分分析

菜籽粕提取前后的主要成分含量如表3所示,菜籽粕中硫苷含量與總糖含量發生明顯變化,其中,硫苷含量由提取前的3.77%下降至提取后的0.37%,下降幅度達90%,相比之下總糖含量下降幅度稍小,約為70%。而提取前后菜籽粕中的粗蛋白與脂肪含量則出現一定程度的上升,粗蛋白含量由提取前的32.41%上升至提取后的42.76%,上升幅度約為30%;脂肪含量則由提取前的3.52%上升至提取后的4.93%,上升幅度約為40%。

表3 提取前后菜籽粕的主要成分Table 3 Main components of rapeseed meal before and after extraction %

通過菜籽粕提取前后主要成分的對比可知,90%的硫苷已被提取出來,可見提取方法效率較高。有研究表明由于前處理方式的不同,菜籽粕蛋白質的溶解度在35%～88%之間變動[26]。蛋白質較難溶于有機溶劑,采用70%乙醇作為提取劑,雖一部分蛋白質會溶于水中,但較大部分蛋白質仍殘留于菜籽粕中,硫苷提取物中的蛋白質含量僅為13.12%。經過提取處理后的菜籽粕中硫苷含量不到0.4%,但是蛋白質含量達42%左右,因而有潛力被開發成一種高蛋白原料應用到飼料或食品中。

2.3.2 硫苷提取物醇沉前后主要成分分析

硫苷提取物醇沉前后的主要成分含量如表4所示,硫苷初提取物中粗蛋白含量僅為13.12%,與原菜籽粕的(32.41%)相比較低,但硫苷初提取物中總糖含量明顯較高,達到33.56%。同時,提取物中硫苷所占比例仍較低,僅為7.67%,由于3,5-二硝基水楊酸比色法僅能測定樣品中的還原糖,因此剩余組分猜測為大部分粗纖維及一小部分水分。

表4 硫苷提取物主要成分分析Table 4 Analysis of the main components of glucosinolates extraction %

與硫苷初提取物相比,通過乙醇的醇沉作用,初提取物中的總糖含量大幅度降低,由33.56%降至13.01%。同時,硫苷含量也得到了明顯提升,從初提取物中的7.67%升高至醇沉后的17.79%,增幅約130%。此外,脂肪含量也出現一定程度的上升,由初提取物中的8.10%升高至醇沉后的13.54%,增幅約60%。

試驗表明菜籽粕中大部分的糖會被提取液所溶解,菜籽粕中超過70%的糖被提取出來,硫苷提取物中的總糖含量較高,達到33.56%,從而導致硫苷提取物中硫苷含量仍較低,約為7.67%。為了進一步提高最終樣品內的硫苷含量,采用醇沉法去除硫苷提取物中的一部分糖類,有研究表明醇含量在50%～60%時可除去淀粉,醇含量在75%時可除去蛋白質,醇含量達80%時可以除去蛋白質、多糖、無機鹽[27]。因此,本研究嘗試采用90%乙醇對硫苷提取凍干物進行醇沉處理,以進一步除去初提取物中的蛋白質與糖類。由表4可知,雖然醇沉處理對蛋白質的去除效果不是很顯著,但醇沉后樣品中的總糖含量發生明顯下降,降幅達60%,同時硫苷含量大幅上升,升幅達130%,同時醇沉后的硫苷提取物中各主要成分的比例較為均勻,較有利于后續的試驗。

3 結論

單因素試驗結果顯示提取溫度與提取時間對硫苷提取量有明顯影響,響應面試驗結果則顯示提取溫度相較于提取時間對硫苷提取量的影響更大,而硫苷提取量隨提取時間的增加呈現先逐漸上升后略微下降的趨勢。最佳條件為提取時間28 min、提取溫度90 ℃,硫苷提取量達到34.32 mg/g,可將菜籽粕中90%的硫苷提取出來。本研究確定的菜籽粕硫苷提取方法具有綠色、高效等優點,所得硫苷可進一步通過醇沉法進行純化后用于開發相關生物制劑,且提取后的菜籽粕硫苷含量大幅度下降,而蛋白質含量仍在42%以上,可用作食品或飼料原料,為菜籽粕的高值化利用提供參考。今后可深入探究如何通過酶解等方式將純化所得的硫苷進行定向轉化,生產具有抗菌、抑癌等特殊生物活性的成分,從而進一步提高菜籽粕的附加值。