仔豬病毒性腹瀉病原檢測與分析

●苑 彬

（河北省廊坊市安次區農業農村局 河北 廊坊 065000）

經國內外相關研究表明，引起不同日齡仔豬腹瀉因素很多，如病原因素（病毒、細菌和寄生蟲），養殖場環境因素（溫度、濕度、采光），飼養管理技術因素（飲水、飼料）及外界環境應激（斷奶、轉群、換料）等。仔豬病毒性腹瀉可引起仔豬的生長性能下降、免疫力降低、腹瀉、腸道感染等一系列的臨床癥狀，嚴重時可導致其死亡，給我國生豬養殖業造成嚴重的經濟損失[1-2]。臨床中常見的引起仔豬病毒性腹瀉的病原有PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種，可引起仔豬病毒性腹瀉以厭食、嘔吐、水樣腹瀉及嚴重脫水，傳染性強、死亡率較高，采用實驗室診斷方法可進行鑒別診斷，如病理學觀察、免疫學診斷及分子生物學診斷[3-5]。病毒性腹瀉對仔豬的危害較大，因此，采用實驗室診斷方法（RT-PCR）對仔豬病毒性腹瀉病毒的區別診斷具有重要意義。

2020～2022年在河北廊坊安次區仔豬規?；B殖場及散養戶采集患腹瀉病仔豬糞便、腸內容物及內臟病料組織總計1508份，進行PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病毒性腹瀉病原檢測，并開展4種病毒性腹瀉病流行病學調查，對該地區仔豬4種病毒性腹瀉病綜合防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病料來源

2020～2022年采集河北廊坊安次區規?；B殖場及散養戶患腹瀉病仔豬糞便、腸內容物及其他內臟病料組織1508份，其中2020年采集病料樣品461份、2021年采集病料樣品494份，2022年采集病料樣品553份（表1）。

表1 樣品采集統計結果

1.2 試驗方法

1.2.1 病料的處理與核酸的提取 將采集的病料加入等量、無菌的PBS進行研磨，高速離心（12 000 r/min，10 min），取上清分裝，-80℃反復凍融3次。參照組織RNA提取試劑盒，提取病料組織中病毒RNA，反轉錄為cDNA，-80℃保存備用。

1.2.2 引物設計與RT-PCR檢測 參照文獻[6]報道的PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原鑒定引物（表2），在生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以本文“1·2”節中反轉錄的cDNA為模板，進行PCR擴增。PCR產物經1·0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測判定其結果，并分析其感染率。

表2 引物序列

2 結果與分析

2.1 仔豬4種病毒性病原的檢測結果

對2020～2022年采集河北廊坊安次區區仔豬規?；B殖場及散養戶中患腹瀉仔豬糞便、腸內容物及其他內臟病料組織總計1508份樣品進行處理，并提取組織RNA，反轉錄成cDNA，用RT-PCR方法檢測PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原，結果見圖1。用RT-PCR方法對采集的樣品可擴增出PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原目的基因條帶（231 bp，342 bp，309 bp，1100 bp），與預期大小一致。

圖1 仔豬樣品中的PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV PCR檢測結果

2.2 仔豬4種病毒性病原的陽性率檢測結果

2020～2022年采集的1508份樣品，包括2020年采集病料樣品461份、2021年采集組織樣品494份，2022年采集組織樣品553份，對采集的樣品采用RT-PCR方法檢測PEDV、TGEV、PorV、PDCoV 4種病原，分析4種病原陽性率，統計感染情況。由表3可知，2020～2022年共計采集1508份樣品，檢測的PEDV、TGEV、PorV和PDCoV陽性率分別為11·00%，7·03%，2·98%，2·59%，其中PEDV和TGEV陽性率較高，且呈現逐年上升的趨勢。

表3 不同種類豬感染病原的檢測結果

3 討論與結論

仔豬病毒性腹瀉病是養豬業中常見疾病之一，臨床中常見的病毒性病原主要包括PEDV、TGEV、PorV和PDCoV，仔豬的感染率和死亡率均較高，且在臨床中癥狀相似，不易區分[6]。有研究表明，RT-PCR是檢測仔豬病毒性腹瀉病最有效的檢測方法，該方法便于操作、靈敏度高、假陽性率低，并且適用于規?；B殖場的檢測。本試驗研究表明，用RT-PCR方法對采集的樣品可擴增出PEDV（231 bp）、TGEV（342 bp）、PorV（309 bp）、PDCoV（1100 bp），與預期大小一致；經分析，采集1508份樣品中PEDV、TGEV、PorV和PDCoV陽性率分別為11·00%、7·03%、2·98%和2·59%，其中PEDV和TGEV陽性率較高，且呈現逐年上升的趨勢。說明該地區規?；B殖場及散養戶中PEDV和TGEV流行嚴重，應引起注意，定期進行檢測和對仔豬進行PEDV和TGEV疫苗接種，進行有效的綜合防控。