一株川金絲猴皮膚感染真菌的分離及鑒定

●李俊嫻 鄧長林 程家球 李梅榮

（南京市紅山森林動物園 江蘇 南京 210028）

紅酵母（Rhodotorula）是擔子菌亞門銹菌綱擔孢目隱球菌科紅酵母亞科紅酵母屬真菌，是一類產色素酵母菌[1]。研究認為，紅酵母在空氣、土壤和江河湖泊等水體中普遍存在，也可以存在于動物、植物以及人體上[2]。過去曾普遍認為紅酵母屬于無致病性的腐生菌和污染菌[3]，罕見導致人類感染。近年來，隨著免疫低下人數逐漸增多，不斷增加的侵襲性真菌感染案例引起研究人員的關注。繼毛孢子菌屬（Trichosporonspp·）、念珠菌屬（Candidaspp·）、隱球菌屬（Cryptococcusspp·）之后，紅酵母菌屬（Rhodotorulaspp·）成為引發侵襲性酵母菌感染的第四大類病原體，總體分離率4·2%（n=8821）[4]。經人醫臨床統計分析發現，血流感染、眼感染、心內膜炎、中樞神經系統感染、腹膜透析相關性腹膜炎、關節假體感染、皮膚感染等均為紅酵母菌的感染類型，其中最常見的類型是導管相關性真菌血癥[5-7]。紅酵母屬共包含8個種，膠紅酵母是人醫臨床中最常見的致病種[1，7]。江蘇某動物園一只川金絲猴皮膚見化膿性皮損。經分子生物學診斷為膠紅酵母感染。此為國內首次發現川金絲猴皮膚感染膠紅酵母。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑 Taq Plus MasterMix、D2000 DNA Marker、GeneGreen核酸染料均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 引物合成 真菌ITS擴增通用引物ITS1和ITS4由上海生工生物有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 病料采集和分離培養 用75%乙醇對患病川金絲猴皮損處消毒后，在相對無菌環境下采集皮損處樣本，用無菌接種針蘸取皮損處病料，接種于沙堡液體培養基中，于30℃恒溫搖床中連續培養48 h。取培養液于沙堡瓊脂培養基上連續傳代培養，獲得純化菌株。

1.2.2 總DNA提取 取經高壓滅菌的0·2% SDS溶液400 μL于滅菌離心管中，取單菌落溶于溶液中，封閉離心管后渦旋振蕩15 s，后沸水浴4 min，擦干離心管外壁后以12 000 r/min離心1 min，取上清液300 μL（病原菌總基因組DNA），凍存備用。

1.2.3 引物合成與PCR擴增 采用真菌rDNA內轉錄間隔區（ITS）序列通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）進行真菌ITS區擴增。

PCR反應體系：Taq Plus MasterMix 10 μL，引物各2 μL，病原菌總基因組DNA 2 μL，加ddH2O補足20 μL。PCR反應條件：98℃預變性3 min；98℃變 性10 s，59℃退火1·5 min，72℃延伸1·5 min，共30個循環；72℃延伸10 min，將PCR產物于4℃保存備用。取5 μL PCR產物于1%瓊脂糖凝膠上電泳30 min后，通過凝膠成像儀進行檢測。

1.2.4 PCR產物序列測定及系統發育樹建立將PCR擴增產物寄送至上海生工生物工程技術服務有限公司測序部進行克隆測序分析，獲得片段序列后，在Gen Bank（http：//www·ncbi·nlm·nih·gov/blast）中進行分析BLAST比對，找出與其相似性最高的菌株。得到序列后用軟件MEGA7·0進行分析，制作成系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 菌落形態與菌體形態

將分離株接種于沙堡瓊脂培養基上，在30℃培養溫度下生長速度一般，呈圓形酵母樣菌落，菌落呈黏質狀，菌落產生橘紅色色素，光鏡下見圓形或卵圓形酵母細胞，可見出芽生殖，未見假菌絲。

2.2 PCR擴增結果

取純培養菌落提取總基因組DNA為PCR模板，并利用ITS1/ITS4引物對分離株的ITS區序列進行擴增。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，見一條長度介于500～750 bp之間的單一條帶，與真菌ITS序列堿基大小范圍相符，PCR對照組未見條帶。電泳圖如圖1所示。

圖1 分離株ITS序列擴增結果

2.3 分子生物學鑒定

將分離株的ITS1-ITS4 PCR擴增產物送交上海生工生物工程技術服務有限公司進行克隆測序，獲得片段序列，如圖2所示。檢測結果顯示，分離株ITS區片段堿基大小為616 bp。將測序結果在 GenBank 數據庫中進行 BLAST 比對，發現與其他已報道的膠紅酵母菌ITS序列相比，該分離株與MT465994·1同源性高達99%。根據同源性分析結果，選擇同源性較高的34株不同參考菌株的序列為基礎，建立進化樹，結果見圖3。根據BLAST比對結果和進化樹中親緣性分析得知，本研究中分離株為膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。

圖2 分離株ITS序列

圖3 分離株 rDNA ITS 序列系統發育樹

3 討論

紅酵母菌屬是在自然界分布廣泛的一類真菌，已在生物工程等領域有廣泛的研究和應用，近些年被研究確認為條件致病菌，屬罕見酵母菌[8]。膠紅酵母感染在國內野生動物臨床上尚未見報道。分離菌在本次川金絲猴感染上臨床表現為感染處大面積脫毛，脫毛處皮膚覆蓋有結痂，結痂較厚且呈微黃色，移除結痂后可見皮膚潮紅，患處與正常皮膚有較為明顯的分界線。未結痂患處可見大量點狀膿皰顆粒，膿皰顆粒易受外力破壞破潰。感染導致患處附近淋巴結腫大。病猴表現明顯抓撓患處的行為。臨床獸醫師選用寵物用氟康唑，按每0·1 mL/kg·bw皮下注射，每周注射1次，同時選用頭孢曲松鈉0· 5 g、阿米卡星1 mL肌肉注射，每日1次，連續治療20日后，臨床癥狀逐漸減退，患處皮膚痊愈，病猴抓撓患處行為逐漸消失。愈后3個月2次對患處皮膚進行復查，未見復發。紅酵母菌細胞壁因缺乏1，3-β-D-葡聚糖合成酶，對棘白菌素類抗真菌藥物有天然耐藥作用[9]，故建議臨床治療中應注意甄別致病菌類型，根據致病菌種類選擇合理藥物治療。人醫臨床上有研究表明，唑類藥物特別是氟康唑對紅酵母菌的最小抑菌濃度普遍≥64 mg/L[10]，棘白菌素類和/或氟康唑藥物治療下曾見紅酵母暴發感染[11]。但在本例中使用寵物用氟康唑和其他抗生素及時治療后能快速控制感染，可能與本次膠紅酵母感染川金絲猴屬皮膚感染型，危害性不大，相對深部感染更易治愈有關。朱敏等[12]曾報道1例女性患者因右乳房腫塊穿刺活檢術后致膠紅酵母菌感染，出現真菌血癥，未使用抗真菌藥物也自行痊愈。在本次感染案例中，發現該川金絲猴患病后，飼養人員便快速將患病猴隔離，更換條件更好的籠舍進行飼養，加強護理，這些操作可能讓動物自身抗病力有所提升而出現自愈。

經實地觀察發現，患病川金絲猴被長期飼養在地勢較低的籠舍中，存在通風不良的情況，室內籠舍相對陰暗潮濕。飼養員人員日常飼養管理內容局限于衛生清掃和飼喂，這些因素可能是形成此病的主要誘因。川金絲猴是典型性樹棲動物，常年棲息在海拔1400～3300 m的常綠落葉闊葉林、針落葉混交林或針葉林中[13]。在我國南方地區圈養條件下雖不能完全復制野外環境條件，但應在籠舍設計時充分考慮籠舍朝向和結構等因素，設計建設通風和采光良好的籠舍，必要時需考慮利用儀器設備控制籠舍內濕度，以減少環境條件性致病菌。在飼養管理中注意環境衛生的清理和籠舍的消毒，可有效提升飼養環境質量。在日常操作中應注意運用綜合性行為管理技術，加強動物與飼養員之間的信任關系，減少圈養條件下的應激反應，提高動物自身免疫力。這些措施都有助于減少動物被條件性致病菌感染的概率。

4 結論

膠紅酵母雖屬罕見酵母菌，但作為條件性致病菌的一種，可引起如川金絲猴這類野生動物皮膚感染，結合病原菌分離鑒定的實驗室診斷手段可幫助確診并合理選用治療藥物。在圈養環境中，野生動物可能因硬件或軟件條件不足處于長期慢性應激壓力下而出現條件性致病菌感染，故圈養野生動物應為動物提供通風、采光、溫度、濕度均能良好控制的籠舍，與其自然棲息地條件相似，以科學尊重自然史的方式確定飼養管理程序，最大限度提高動物福利，減少條件性致病菌感染的發病率。