lncRNA SNHG1靶向miR-145-5p/PDCD4軸對缺氧/復氧誘導的心肌細胞凋亡的影響

李紅英，張會軍，王軍，穆秀娥，李紅方

（河北醫科大學第一醫院心臟外科，石家莊 050031）

急性心肌梗死 （acute myocardial infarction，AMI）是一種常見的心血管疾病，死亡率高，及時、有效的再灌注是減少AMI后心肌損傷的重要治療選擇［1］。研究［2］報道，心肌細胞凋亡、氧化應激參與了AMI的發病機制。心肌缺氧/復氧 （hypoxia/reoxygenation，H/R） 損傷與心血管外科手術高度相關［3］，預防H/R誘導的心肌細胞凋亡可能為AMI提供新的治療策略。越來越多的研究表明，長鏈非編碼RNA （long noncoding RNA，lncRNA） 在包括AMI在內的心血管疾病的生理和病理過程中發揮重要作用。核內小RNA宿主基因1 （small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1） 作為一種lncRNA，已有研究［4］顯示，下調SNHG1可以抑制心肌缺血/再灌注損傷小鼠的心肌細胞凋亡。但其具體分子機制尚不完全明確。研究［5］顯示，過表達miR-145通過靶向下調程序性細胞死亡因子4 （programmed cell death 4，PDCD4） 抑制H/R誘導心肌細胞凋亡。生物信息學分析顯示，SNHG1與miR-145-5p存在靶向關系。而SNHG1能否通過調控miR-145-5p/PDCD4軸影響H/R誘導的心肌細胞凋亡尚不明確。因此，本研究主要探討了SNHG1對H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響及其作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：大鼠心肌細胞H9c2購自浙江美森細胞科技有限公司。

1.1.2 主要試劑：SNHG1小干擾RNA （si-SNHG1） 及其陰性對照 （si-NC）、miR-145-5p模擬物 （miR-145-5p mimic） 及其陰性對照 （mimic NC）、miR-145-5p抑制物 （miR-145-5p inhibitor） 及其陰性對照 （inhibitor NC），均購自賽默飛世爾科技 （中國） 有限公司；CCK-8試劑盒，購自上海繼和生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒，購自無錫云萃生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶 （superoxide dismutase，SOD）、丙二醛 （malondialdehyde，MDA） 試劑盒，購自上海廣銳生物科技有限公司；兔源一抗PDCD4、caspase 3、Bcl-2、Bax、GAPDH及過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗，均購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、H/R細胞模型的構建及實驗分組：將H9c2細胞在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，培養條件為37 ℃和5% CO2。

H/R細胞模型的構建［6］：將H9c2細胞在缺氧培養箱 （37 ℃、94% N2、1% O2、5% CO2） 中培養24 h，再在復氧培養箱 （37 ℃、95%空氣、5% CO2） 中復氧1 h。

將H9c2細胞分為H/R組、si-NC組、si-SNHG1組、mimic NC組、miR-145-5p mimic組、si-SNHG1+inhibitor NC組、si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組。上述各組細胞進行相應的轉染處理48 h后，再進行缺氧24 h、復氧1 h。si-NC組、si-SNHG1組、mimic NC組、miR-145-5p mimic 組H9c2細胞分別轉染si-NC、si-SNHG1、mimic NC、miR-145-5p mimic，si-SNHG1+inhibitor NC組H9c2細胞同時轉染si-SNHG1和inhibitor NC，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細胞同時轉染si-SNHG1和miR-145-5p inhibitor。同時取正常培養的H9c2細胞作為對照組 （NC組）。上述處理結束后，收集各組細胞用于后續實驗。

1.2.2 實時定量PCR （real-time quantitative PCR，qRTPCR） 檢測細胞中SNHG1、miR-145-5p表達：使用TRIzol試劑提取H9c2細胞中的總RNA，將總RNA逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行定量PCR。GAPDH、U6分別作為SNHG1、miR-145-5p內參。采用2-ΔΔCt法計算SNHG1、miR-145-5p相對表達量。引物序列：GAPDH，正向5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’，反向 5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；SNHG1，正向5’-AACTTCCCATAACTCCACTTC-3’，反向5’-ACAACCAACACAGCAACAC-3’；miR-145-5p，正向5’-TCGGCAGGGTCCAGTTTTCCCA-3’，反向5’-CTCAAC TGGTGTCGTGGA-3’；U6，正向5’-CTCGCT TCGGCAGCACA-3’，反向5’-AACGCTTCACGAATTT GCGT-3’。

1.2.3 CCK-8檢測細胞增殖：將各組H9c2細胞以1×104/孔的密度接種到96孔板中，培養48 h后，將10 μL CCK-8 試劑添加到96孔板的每個孔中，將96孔板在37 ℃下孵育1.5 h，使用酶標儀在450 nm處讀取光密度值 （optical density，OD）。

1.2.4 流式細胞術檢測H9c2細胞凋亡：將各組H9c2細胞用預冷的PBS洗滌2次，重懸于1×結合緩沖液中，然后在室溫下依次與 5 μL Annexin V-FITC、5 μL碘化丙啶在黑暗條件下孵育5 min。使用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 試劑盒檢測H9c2細胞中SOD活性、MDA含量：按照試劑盒說明書檢測H9c2細胞中SOD活性、MDA含量。

1.2.6 Western blotting檢測H9c2細胞中PDCD4、Bcl-2、caspase 3、Bax蛋白表達：RIPA裂解緩沖液裂解H9c2細胞并提取蛋白質，蛋白質經定量、電泳、轉膜、封閉后，將膜與一抗PDCD4 （1 ∶2 000）、Bcl-2 （1 ∶2 000）、caspase 3 （1 ∶2 000）、Bax （1 ∶1 000）、GAPDH（1 ∶2 000） 在4 ℃下孵育過夜。隨后，將膜與辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗 （1 ∶1 000） 在室溫下孵育 1 h，再次用TBST緩沖液洗滌膜3次，加入ECL試劑，觀察蛋白質條帶，使用ImageJ 分析蛋白灰度值。1.2.7 雙熒光素酶報告基因實驗：分別構建SNHG1野生型質粒 （SNHG1-WT） 和突變型質粒 （SNHG1-MUT），將SNHG1-WT和SNHG1-MUT分別與mimic NC或miR-145-5pmimic共轉染于H9c2細胞，48 h后觀察熒光素酶活性變化。

分別構建PDCD4野生型質粒 （PDCD4-WT） 和突變型質粒 （PDCD4-MUT），將PDCD4-WT和PDCD4-MUT分別與mimic NC或miR-145-5pmimic共轉染于H9c2細胞，48 h后觀察熒光素酶活性變化。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件處理數據。計量資料以x-±s表示，多組數據的比較采用單因素方差分析，進一步2組數據的比較采用SNK-q檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組H9c2細胞中SNHG1、miR-145-5p、PDCD4蛋白表達比較

與NC組比較，H/R組H9c2細胞中SNHG1、PDCD4蛋白表達升高，miR-145-5p表達降低 （P< 0.05）。與H/R組、si-NC組比較，si-SNHG1組H9c2細胞中SNHG1、PDCD4蛋白表達降低，miR-145-5p表達升高 （P<0.05）。與H/R組、mimic NC 組比較，miR-145-5p mimic組H9c2細胞中SNHG1表達變化的差異無統計學意義 （P> 0.05），miR-145-5p表達升高，PDCD4蛋白表達降低 （P< 0.05）。與si-SNHG1組、si-SNHG1+inhibitor NC組比較，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細胞中SNHG1表達變化的差異無統計學意義 （P> 0.05），miR-145-5p表達降低，PDCD4蛋白表達升高 （P<0.05）。見圖1、表1。

表1 各組細胞中SNHG1、miR-145-5p、PDCD4蛋白表達比較 （n = 6）Tab.1 Cellular expressions of SNHG1，miR-145-5p，and PDCD4 protein by study group （n = 6）

圖1 Western blotting檢測各組細胞中PDCD4蛋白的表達Fig.1 PDCD4 protein expression detected by Western blotting in each study group

2.2 各組H9c2細胞增殖能力比較

NC組、H/R組、si-NC組、si-SNHG1組、mimic NC組、miR-145-5p mimic組、si-SNHG1+inhibitor NC組、si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細胞OD450值分別為0.87±0.07、0.31±0.02、0.29±0.01、0.69±0.05、0.30±0.03、0.72±0.06、0.70±0.06、0.38±0.03。與NC組比較，H/R組H9c2細胞OD450值降低 （P< 0.05）；與H/R組、si-NC組比較，si-SNHG1組H9c2細胞OD450值升高 （P< 0.05）；與H/R組、mimic NC組比較，miR-145-5p mimic組H9c2細胞OD450值升高 （P< 0.05）；與si-SNHG1組、si-SNHG1+inhibitor NC組比較，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細胞OD450值降低 （P<0.05）。

2.3 各組H9c2細胞凋亡能力比較

NC組、H/R組、si-NC組、si-SNHG1組、mimic NC組、miR-145-5p mimic組、si-SNHG1+inhibitor NC組、si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細胞凋亡率分別為 （3.79±0.14） %、 （18.86±1.15） %、 （18.72±1.12） %、（6.78±0.34） %、 （18.80±1.07） %、 （5.49±0.26） %、（6.69±0.29） %、 （13.34±1.17） %。與NC組比較，H/R組H9c2細胞凋亡率升高 （P< 0.05）；與H/R組、si-NC組比較，si-SNHG1組H9c2細胞凋亡率降低 （P< 0.05）；與H/R組、mimic NC組比較，miR-145-5p mimic組H9c2細胞凋亡率降低 （P< 0.05）；與si-SNHG1組、si-SNHG1+inhibitor NC組比較，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細胞凋亡率升高 （P< 0.05）。見圖2。

圖2 流式細胞術檢測H9c2細胞凋亡Fig.2 H9c2 cell apoptosis detected by flow cytometry

2.4 各組H9c2細胞中SOD活性、MDA含量比較

與NC組比較，H/R組H9c2細胞中SOD活性降低，MDA含量升高 （P< 0.05）；與H/R組、si-NC組比較，si-SNHG1組H9c2細胞中SOD活性升高，MDA含量降低 （P< 0.05）；與H/R組、mimic NC 組比較，miR-145-5p mimic 組H9c2細胞中SOD活性升高，MDA含量降低（P< 0.05）；與si-SNHG1組、si-SNHG1+inhibitor NC組比較，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細胞中SOD活性降低，MDA含量升高 （P< 0.05）。見表2。

表2 各組H9c2細胞中SOD活性、MDA含量比較 （n = 6）Tab.2 SOD activity and MDA content of H9c2 cells by study group （n = 6）

2.5 各組H9c2細胞中Bax、Bcl-2、caspase 3蛋白表達比較

與NC組比較，H/R組H9c2細胞中Bax、caspase 3蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低 （P< 0.05）；與H/R組、si-NC組比較，si-SNHG1組H9c2細胞中Bax、caspase 3蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高 （P<0.05）；與H/R組、mimic NC 組比較，miR-145-5p mimic組H9c2細胞中Bax、caspase 3蛋白表達降低，Bcl-2蛋白表達升高 （P< 0.05）；與si-SNHG1組、si-SNHG1+inhibitor NC組比較，si-SNHG1+miR-145-5p inhibitor組H9c2細胞中Bax、caspase 3蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低 （P< 0.05）。見圖3、表3。

表3 各組H9c2細胞中Bax、Bcl-2、caspase 3蛋白表達比較 （n = 6）Tab.3 Bax，Bcl-2，and caspase 3 protein expression of H9c2 cells by study group （n = 6）

2.6 SNHG1靶向調控miR-145-5p /PDCD4軸

在Starbase （http：//starbase.sysu.edu.cn/）、Target Scan （https：//www.targetscan.org/vert_72/） 網站分別預測lncRNA SNHG1與miR-145-5p、miR-145-5p與PDCD4的結合位點，見圖4。與mimic NC和 SNHG1-WT共轉染組比較，miR-145-5p mimic和 SNHG1-WT共轉染組的熒光素酶活性降低 （分別為1.05±0.12和0.23±0.01，P< 0.05）；與mimic NC和SNHG1-MUT共轉染組比較，miR-145-5p mimic和 SNHG1-MUT共轉染組熒光素酶活性無顯著變化 （分別為1.03±0.11和1.02±0.10，P> 0.05）；與mimic NC和PDCD4-WT共轉染組比較，miR-145-5p mimic和PDCD4-WT共轉染組的熒光素酶活性降低 （分別為1.03±0.10和0.29±0.02，P< 0.05）；與mimic NC和PDCD4-MUT共轉染組比較，miR-145-5p mimic和PDCD4-MUT共轉染組熒光素酶活性無顯著變化 （分別為0.97±0.08和1.01±0.09，P> 0.05）。

圖4 Starbase、TargetScan網站分別預測lncRNA SNHG1與miR-145-5p、miR-145-5p與PDCD4的結合位點Fig.4 Binding sites of lncRNA SNHG1 and miR-145-5p as well as of miR-145-5p and PDCD4 predicted at Starbase and TargetScan websites

3 討論

AMI是冠狀動脈急性閉塞引起的心肌損傷，嚴重威脅人類生命健康。盡管 AMI 的診斷和治療在過去幾十年中有所進展，但全世界其發病率和死亡率仍在上升［7］。因此，早期發現和干預對于減少心肌損傷和改善患者預后是必要的。

SNHG1是一種新發現的lncRNA，研究［8］報道，沉默SNHG1可抑制膿毒癥小鼠心肌損傷；敲低SNHG1可抑制脂多糖誘導的PC12細胞凋亡［9］。以上研究表明，SNHG1在調控細胞凋亡和心肌損傷方面具有重要作用。SOD和MDA是氧化應激的標志物；Bax、Bcl-2、caspase 3是常用于評估細胞凋亡的蛋白，Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bax、caspase 3是促凋亡效應蛋白。本研究顯示，SNHG1在H/R誘導的H9c2細胞中高表達，沉默SNHG1可抑制H/R誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激，提示SNHG1可能是治療AMI的潛在有效靶點。

lncRNA可通過海綿化微RNA （microRNA，miRNA）發揮作用。本研究通過生物信息學分析和雙熒光素酶報告基因實驗，證實SNHG1與miR-145-5p 存在靶向關系。miR-145-5p作為一種miRNA，已有研究報道，下調miR-145-5p可加重心肌梗死小鼠心肌損傷［10］，過表達miR-145-5p可減輕心肌缺血/再灌注損傷中的細胞凋亡［11］。以上研究表明，miR-145-5p在AMI進展中發揮重要調控作用。本研究結果與上述研究結果一致，本研究顯示，miR-145-5p在H/R誘導的H9c2細胞中低表達，過表達miR-145-5p可抑制H/R誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激。此外，本研究還發現沉默SNHG1可上調H/R誘導的H9c2細胞中miR-145-5p表達，推測沉默SNHG1可能通過上調miR-145-5p抑制H/R誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激。為了驗證這一推測，本研究在沉默SNHG1的基礎上應用miR-145-5p inhibitor干預H/R誘導的H9c2細胞，結果顯示，miR-145-5p inhibitor減弱了沉默SNHG1對H/R誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激的影響。本研究證實了這一推測，即沉默SNHG1可能通過上調miR-145-5p抑制H/R誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激。

miRNA是一類非編碼RNA，通過與其靶基因mRNA的3’非翻譯區結合，在轉錄后水平負調控基因表達。本研究證實了PDCD4為miR-145-5p的靶基因。PDCD4基因定位于染色體10q24上［12］。研究顯示，沉默PDCD4能夠減弱H/R誘導的心肌細胞凋亡和氧化應激損傷［13］，抑制PDCD4可抑制阿霉素誘導的大鼠心肌細胞凋亡［14］。以上研究表明，PDCD4在調控心肌細胞凋亡和氧化應激方面發揮重要作用。本研究顯示，PDCD4蛋白在H/R誘導的H9c2細胞中高表達，沉默SNHG1后，H/R誘導的H9c2細胞中miR-145-5p表達升高，而PDCD4蛋白表達降低，雙熒光素酶報告基因實驗證實了SNHG1與miR-145-5p、miR-145-5p與PDCD4存在靶向關系。證實了沉默SNHG1可能通過調控miR-145-5p/PDCD4軸，抑制H/R誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激。

綜上所述，沉默SNHG1可能通過上調miR-145-5p來抑制PDCD4表達，進而抑制H/R誘導的H9c2細胞凋亡和氧化應激。本研究尚存在不足之處，僅進行了體外實驗，未進行體內實驗探究SNHG1對H/R誘導的H9c2細胞凋亡的影響，后期將進行進一步體內研究。