基于線粒體tRNAleu~COII和COI的貴州東方蜜蜂群體遺傳分析

周文才 李應 姚丹 萬煒 詹洪平 黎華君 賀興江 冉曜琦 于瀛龍 韋小平

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.023

摘要：【目的】明確貴州省東方蜜蜂群體的遺傳結構和遺傳多樣性，掌握其遺傳現狀，為貴州省東方蜜蜂的遺傳資源評價及保護利用提供參考依據?！痉椒ā炕诰€粒體tRNAleu～COII和COI片段對貴州省內19個采樣點的1282群東方蜜蜂進行遺傳分析，計算單倍型多樣性（Hd）、平均核苷酸差異數（K）和核苷酸多樣性（π）等遺傳多樣性指數，采用中性檢驗（Tajima?s D和Fu?s Fs）評估群體擴張情況，通過計算遺傳分化系數（Fst）、構建系統發育進化樹和分子方差分析評估其遺傳分化，并開展環境因子相關分析以明確遺傳分化的作用因子?！窘Y果】貴州東方蜜蜂在線粒體tRNAleu～COII片段上的Hd介于0.5421～0.9167，π介于0.00174～0.00527，K介于0.611～1.854，其中臺江、雷山、麻江、羅甸、紫云、晴隆和威寧等7個采樣點發生過群體擴張；在線粒體COI片段上的Hd介于0.5710～0.9109，π介于0.00109～0.00261，K介于0.874～2.084，其中松桃、江口、印江、臺江、石阡、雷山、羅甸、紫云、黔西、晴隆和威寧等11個采樣點發生過群體擴張。貴州東、西部東方蜜蜂群體間存在中度遺傳分化（在tRNAleu～COII片段上的Fst=0.04±0.02，在COI片段上的Fst=0.07±0.04），貴州西部東方蜜蜂群體內也存在中度遺傳分化（在tRNAleu～COII片段上的Fst=0.04±0.02，在COI片段上的Fst=0.07±0.03）。相關分析結果顯示，貴州西部東方蜜蜂組群的遺傳分化程度與海拔呈弱相關，但與溫度、濕度等環境因子呈顯著正相關?！窘Y論】貴州省東方蜜蜂在線粒體tRNAleu～COII和COI片段上的遺傳多樣性處于較高水平，主要歸功于蜂群數量大和飼養方式較原始；貴州東方蜜蜂整體上呈現中度遺傳分化，且西部東方蜜蜂組群內部的遺傳分化程度較東部東方蜜蜂組群更高，主要與溫度和濕度等環境因子密切相關，是其為適應所處環境而進化產生，而非海拔因素造成。

關鍵詞：東方蜜蜂；tRNAleu～COII片段；COI片段；遺傳多樣性；遺傳分化；環境因子

中圖分類號：S891.8? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）06-1819-10

Population genetic analysis of Apis cerana in Guizhou based on mitochondrial tRNAleu-COII and COI

ZHOU Wen-cai， LI Ying， YAO Dan， WAN Wei， ZHAN Hong-ping， LI Hua-jun，

HE Xing-jiang， RAN Yao-qi， YU Ying-long*， WEI Xiao-ping*

（Institute of Integrated Agriculture Development，Guizhou Academy of Agricultural Sciences，

Guiyang，Guizhou? 550006，China）

Abstract：【Objective】The purpose of the study was to clarify the population genetic structure and genetic diversity of Apis cerana in Guizhou， to understand its genetic status， and to provide a reference basis for the evaluation， conservation and utilization of Apis cerana genetic resources in Guizhou. 【Method】Genetic analysis was conducted on 1282 populations of A. cerana from 19 sampling sites in Guizhou based on mitochondrial tRNAleu-COII and COI fragments. Genetic diversity indexes such as haplotype diversity （Hd）， the average nucleotide difference （K） and nucleotide diversity （π） were calculated. Tajima’s D and Fu’s Fs neutral tests were carried out to evaluate population expansion. Genetic differentiation was assessed by calculating the genetic differentiation coefficient （Fst）， constructing phylogenetic evolutionary trees and molecular variance analysis， and environmental factor correlation analysis was carried out to clarify the role of factors in genetic differentiation. 【Result】The Hd of A. cerana in Guizhou on the mitochondrial tRNAleu-COII fragment ranged from 0.5421 to 0.9167， π ranged from 0.00174 to 0.00527， and K ranged from 0.611 to 1.854， with colony expansions occurring in seven sampling sites， including Taijiang， Leishan， Majiang， Luodian， Ziyun， Qinglong， and Weining. On the mitochondrial COI fragment， Hd ranged from 0.5710 to 0.9109， π ranged from 0.00109 to 0.00261， and K ranged from 0.874 to 2.084， with population expansion occurring at 11 sampling sites， including Songtao， Jiangkou， Yinjiang， Taijiang， Shiqian， Leishan， Luodian， Ziyun， Qianxi， Qinglong， and Weining. There existed moderate genetic differentiation （on tRNAleu-COII fragment， Fst=0.04±0.02， on COI fragment Fst=0.07±0.04） between A. cerana populations in the eastern and western of Guizhou， and moderate genetic differentiation （on tRNAleu-COII fragment， Fst=0.04±0.02， on COI fragment， Fst=0.07±0.03） within A. cerana populations in the western part of Guizhou. The results of correlation analysis showed that genetic differentiation of A. cerana colonies in western Guizhou was weakly correlated with altitude， but significantly positively correlated with environmental factors such as temperature and humidity. 【Conclusion】The genetic diversity of A. cerana in Guizhou is at a high level in mitochondrial tRNAleu-COII and COI fragments， which is mainly attributed to the huge population size and primitive rearing methods. Guizhou A. cerana as a whole show moderate genetic differentiation， and the degree of genetic differentiation within the western A. cerana populations is higher than that of the eastern A. cerana， which is mainly closely related to the environmental factors， such as temperature and humidity， and arises from their evolution to adapt to the environment they live in rather than due to altitudinal factors.

Key words： Apis cerana； tRNAleu-COII fragment； COI fragment； genetic diversity； genetic differentiation； environmental factor

Foundation items： Guizhou Science and Technology Plan Project （QKHJC〔2019〕1453）；Construction Project of China Agriculture Research System （CARS-44-SYZ-22）；Guizhou Academy of Agricultural Sciences Project （QNKYQNKJJJ〔2020〕08，QNKYZZZY〔2022〕16）

0 引言

【研究意義】東方蜜蜂（Apis cerana）是我國本土蜂種，廣泛分布在除內蒙古和新疆外的我國其他地區，具有善于利用零星蜜粉源、耐低溫、抗螨等優良特性，在維持生物多樣性、維護生態系統平衡及糧食安全等方面發揮著重要作用（楊冠煌，2009）。貴州地處云貴高原東段，屬亞熱帶濕潤季風氣候，自東向西海拔逐漸升高，省內有東方蜜蜂51萬群，占全國總量的10%，是我國東方蜜蜂的主產區之一（韋小平等，2020）。開展貴州省本土東方蜜蜂群體遺傳分析，既是掌握蜂種資源的基礎性工作，也是蜂種資源保護與利用的前提?！厩叭搜芯窟M展】《中國畜禽遺傳資源志 蜜蜂志》將貴州省東方蜜蜂劃分為云貴高原中蜂和華中中蜂，其中，云貴高原中蜂分布于貴州省西部，華中中蜂分布在貴州省東部（國家畜禽遺傳資源委員會，2011）。至今，國內已有諸多學者基于形態、微衛星遺傳分子標記等開展了貴州東方蜜蜂群體遺傳分析，但得出的相關研究結果存在明顯差異。徐祖蔭（1986，2009）利用7個形態標記均值將貴州東方蜜蜂劃分為東部的山地生態型和西部的云貴高原生態型，以織金—冊亨、赫章—盤縣為界限；楊冠煌（2001）基于12個形態標記均值將東方蜜蜂劃分為華中生態型和云貴高原生態型；駱群等（2015）利用32個形態標記進行多元化統計分析，但未發現貴州省東方蜜蜂發生種群分化；于瀛龍等（2017）利用31個微衛星位點對貴州省東方蜜蜂進行分析，也未發現貴州省東方蜜蜂發生遺傳分化。此外，有學者通過線粒體tRNAleu～COII、COI及COII等片段分別開展了我國西藏、廣西、重慶、浙江、云南等地的東方蜜蜂遺傳多樣性研究（姬聰慧等，2017；劉意秋等，2018；曹聯飛等，2021；周姝婧等，2021），證實山脈、高原等自然隔離條件，以及人為干擾造成的基因交流等是塑造東方蜜蜂群體遺傳結構的主要因素，東方蜜蜂不同地理群體間遺傳分化明顯，且蘊藏著豐富的遺傳多樣性，其研究結論對東方蜜蜂遺傳資源保護與合理開發利用具有基礎性指導意義，但針對于貴州省本土東方蜜蜂群體的研究僅趙金玉等（2022）對79只貴州省東方蜜蜂進行線粒體COI～COII片段分析?！颈狙芯壳腥朦c】線粒體tRNAleu～COII和COI片段是目前廣泛應用于蜜蜂遺傳多樣性研究的有效手段，但鮮見應用于貴州省東方蜜蜂的系統研究?！緮M解決的關鍵問題】基于2個線粒體片段tRNAleu～COII和COI對貴州全省范圍內的東方蜜蜂開展大樣本量群體遺傳分析，以期明確貴州省東方蜜蜂群體的遺傳結構和遺傳多樣性，掌握其遺傳現狀，為貴州省東方蜜蜂的遺傳資源評價及保護利用提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 樣本采集

東方蜜蜂樣本采自貴州省19個主要縣（市），共1282群（表1），樣本量介于10～176群/采樣點。東方蜜蜂樣本均采自健康蜂群，為減少引種、育王等對代表性的影響，蜂群以半野生的飼養蜂群為主。采集后的樣本以無水乙醇處理后-20 ℃保存備用。

1. 2 試驗方法

每個蜂群取1只工蜂，利用UNIQ-10柱式試劑盒、SanTaq PCR Mix擴增試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］從工蜂胸部提取基因組。為提高結果可靠性，本研究擴增2個經典的線粒體片段tRNAleu～COII（1～352 bp）和COI（1～799 bp），擴增條件參照Garnery等（1992）、Zhao等（2014）的研究方法。PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司分別進行單向、雙向測序，測序結果經人工檢查，若存在嚴重雙峰現象則需重新測序。

1. 3 統計分析

利用ClustalX進行測序序列比對，并將序列數據上傳至NCBI以確定其單倍型（Larkin et al.，2007）；通過DNAsp 5.0計算單倍型多樣性（Hd）、平均核苷酸差異數（K）和核苷酸多樣性（π）（Librado and Rozas，2009），以及Tajima?s D（Tajima，1989）和Fu?s Fs（Fu，1997）；使用Arlequin 3.11計算不同采樣點間的遺傳分化系數（Fst），并進行分子方差分析（Excoffier and Lischer，2010；張桂寧等，2022）；利用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）基于Kimura雙參數（Kimura 2-parameter，K2P）構建系統發育進化樹（Kumar et al.，2016），外群選用Apis mellifera（GenBank登錄號KX908209）的對應片段。采用GenAlex 6.5進行遺傳分化與海拔等環境因子的相關分析（Peakall and Smouse，2012），其中，海拔數據來源于實地測量，其余主要環境因子數據來源于中國氣象信息網站，包括：月平均氣壓、月平均氣溫、月平均最高氣溫、月平均最低氣溫、每月最高氣溫≥30 ℃日數、每月最高氣溫≥35 ℃日數、每月最低氣溫≤2 ℃日數、每月最低氣溫≤0 ℃日數、月平均相對濕度及月平均降水量。

2 結果與分析

2. 1 貴州東方蜜蜂遺傳多樣性與歷史動態

在貴州東方蜜蜂線粒體tRNAleu～COII片段上共發現98種單倍型（圖1），其中28種為新發現單倍型，對應的GenBank登錄號分別為MT607430～MT607438、MT607519～MT607520、MZ970560～MZ970561、OL333585～ OL333588、OL333590～OL333598及OL989889～OL989890。各采樣點的單倍型種類介于3～27種，Hd介于0.5421～0.9167，π介于0.00174～0.00527，K介于0.611～1.854，其中臺江、雷山、麻江、羅甸、紫云、晴隆和威寧等7 個采樣點發生過群體擴張，中性檢驗（Tajima?s D，Fu?s Fs）呈顯著性負值（表2）。

在貴州東方蜜蜂線粒體COI片段上共發現143 種單倍型（圖2），其中122種為新發現單倍型，對應的GenBank登錄號分別為MT607439～MT607518、OK001729～OK001739及OL308023～OL308053。各采樣點的單倍型種類介于5～36種，Hd介于0.5710～0.9109，π介于0.00109～0.00261，K介于0.874～2.084，其中松桃、江口、印江、臺江、石阡、雷山、羅甸、紫云、黔西、晴隆和威寧等11個采樣點發生過群體擴張，中性檢驗（Tajima?s D，Fu?s Fs）呈顯著性負值（表3）。

2. 2 貴州東方蜜蜂遺傳分化情況

貴州東方蜜蜂整體上呈現出中度遺傳分化（表4）。在線粒體tRNAleu～COII片段上的Fst介于 -0.01～0.15，平均為0.05±0.03；在線粒體COI片段上的Fst介于-0.01～0.18，平均為0.06±0.04。貴州東部（松桃、江口、沿河、印江、臺江、石阡、雷山等7個采樣點）東方蜜蜂群體與貴州西部（紫云、黔西、大方、晴隆、赫章、盤州、威寧等7個采樣點）東方蜜蜂群體間存在中度遺傳分化，在線粒體tRNAleu～COII片段上的Fst為0～0.09，平均為0.04±0.02；在線粒體COI片段上的Fst為0～0.18，平均為0.07±0.04。此外，貴州東部的松桃、江口、沿河、印江、臺江、石阡、雷山等7個采樣點東方蜜蜂在線粒體tRNAleu～COII片段上的Fst為0～0.09，平均為0.03±0.02；在線粒體COI片段上的Fst為0～0.13，平均為0.03±0.04。貴州西部的紫云、黔西、大方、晴隆、赫章、盤州、威寧等7 個采樣點東方蜜蜂在線粒體tRNAleu～COII片段上的Fst為0.01～0.07，平均為0.04±0.02；在線粒體COI片段上的Fst為0.03～0.15，平均為0.07±0.03。其他采樣點東方蜜蜂在線粒體tRNAleu～COII片段上的Fst介于0.05～0.15，平均為0.10±0.04；在線粒體COI片段上的Fst介于-0.01～0.09，平均為0.05±0.03。

分子方差分析時將貴州東方蜜蜂視為同一組群，基于線粒體tRNAleu～COII片段的分析結果顯示，群體間遺傳變異占總變異的4.76%，群體內遺傳變異占總變異的95.24%（表5）；基于線粒體COI片段的分析結果顯示，群體間遺傳變異占總變異的5.18%，群體內遺傳變異占總變異的94.82%（表6）?？梢?，貴州東方蜜蜂不同群體間存在遺傳分化。

按照地理區域，將貴州東方蜜蜂設為貴州東部（松桃、江口、沿河、印江、臺江、石阡、雷山等7個采樣點）和貴州西部（紫云、黔西、大方、晴隆、赫章、盤州、威寧等7個采樣點）2個組群進行分析，基于線粒體tRNAleu～COII片段的分析結果顯示，組群間遺傳變異占總變異的0.25%，組群內群體間遺傳變異占總變異的3.84%，群體內遺傳變異占總變異的95.91%（表7）；基于線粒體COI片段的分析結果顯示，組群間遺傳變異占總變異的1.45%，組群內群體間遺傳變異占總變異的4.51%，群體內遺傳變異占總變異的94.04%（表8）?？梢?，貴州東方蜜蜂遺傳分化還存在于貴州東西部之間。

2. 3 貴州東方蜜蜂遺傳分化與環境因子的相關性

對存在中度遺傳分化的貴州西部7個采樣點東方蜜蜂進行Mantel檢驗分析，結果顯示：線粒體COI片段的遺傳分化程度與月平均氣壓（R2=0.1390，P=0.04）、月平均最高氣溫（R2=0.2515，P=0.01）、每月最低氣溫≤0 ℃日數（R2=0.1413，P=0.03）及月平均相對濕度（R2=0.1146，P=0.04）呈顯著正相關（圖3）。線粒體tRNAleu～COII片段的遺傳分化程度與月平均降水量（R2=0.1622，P=0.03）呈顯著正相關（圖4）。線粒體tRNAleu～COII和COI片段的遺傳分化程度與海拔均呈弱相關性（tRNAleu～COII-R2=0.0191，P=0.10；COI-R2=0.0819，P=0.03）。

2. 4 貴州東方蜜蜂線粒體tRNAleu～COII和COI單倍型的系統發育進化分析

基于線粒體tRNAleu～COII和COI片段各單倍型構建的系統發育進化樹（圖5和圖6）均顯示，貴州東方蜜蜂各單倍型聚類緊密，單倍型種類間的親緣關系較近，從單倍型種類角度上并未體現出明顯的地理發生關系。

3 討論

我國東方蜜蜂遺傳多樣性分析結果顯示，東方蜜蜂線粒體tRNAleu～COII的Hd介于0.171～0.911（周姝婧等，2012，2021），線粒體COI片段的Hd介于0.067～0.871（Zhao et al.，2014；劉意秋等，2018）。對比發現，貴州東方蜜蜂在線粒體tRNAleu～COII和COI片段上表現出較高的遺傳多樣性水平，究其原因可能是：（1）貴州省森林資源豐富，東方蜜蜂蜂群數量龐大。貴州省現存的東方蜜蜂蜂群數量約占全國的10%（韋小平等，2020），龐大的蜂群數量為其遺傳多樣性的形成奠定了基礎。2020年貴州省森林覆蓋率為61.51%，野生蜜源植物有243 種（韋小平等，2020），為蜂群的生存繁衍提供了物質基礎。本研究的中性檢驗（Tajima?s D，Fu?s Fs）結果也顯示貴州東方蜜蜂蜂群體發生過擴張，說明自然環境適宜蜜蜂群體數量增長。（2）貴州東方蜜蜂養殖仍保留有土法飼養，蜂群遺傳結構受人為干擾的影響較小，尤其在自然保護區（江口和石阡）、西部山區（威寧）、南部石漠化地區（羅甸）等區域，土法飼養蜂群比例更高。土法飼養方式下蜂群操作不便，蜂農全年開箱操作保持在1～2次，雖然養蜂生產效率低，但減少了對蜂群的干擾，有效避免了蜜蜂種群遺傳結構受人為干擾，在自然保護區更是嚴格限制外來蜂群的進入，使得東方蜜蜂遺傳多樣性極少受到人為因素的影響。

貴州東方蜜蜂整體上呈現中度遺傳分化，且西部東方蜜蜂組群內部的遺傳分化程度較東部東方蜜蜂組群更高。相關分析發現，貴州西部東方蜜蜂組群的遺傳分化程度與海拔呈弱相關，但與溫度、濕度等環境因子呈顯著正相關，推測貴州西部東方蜜蜂的遺傳分化是其為適應所處環境而進化產生，而非海拔因素造成。溫度、濕度等環境因子直接影響蜜蜂出巢采集及婚飛等巢外活動，同時影響蜜源植物的分布。前人研究發現，濕度明顯影響蜂王的正常交配，隨著降雨量的增加，與蜂王交配的雄蜂數量呈下降趨勢（Neves et al.，2011；Polatto et al.，2014）；溫度與西方蜜蜂不同亞種的分布范圍密切相關，西方蜜蜂中卡尼鄂拉亞種和馬其頓亞種的分布范圍以年均溫9 ℃為分界線（Coroian et al.，2014）。本研究中，致使貴州西部東方蜜蜂呈中度遺傳分化的主要環境因子可能是溫度和濕度。

本研究結果顯示，貴州東西部東方蜜蜂組群的遺傳分化以石阡—雷山、黔西—紫云為界限，在前人研究中貴州東方蜜蜂的遺傳分化則以織金—冊亨、赫章—盤縣為界限（徐祖蔭，1986；國家畜禽遺傳資源委員會，2011）。究其原因可能是：（1）貴州呈自東向西逐漸升高的地勢，無明顯的地理隔離因素，蜜蜂遺傳分化現象與所處棲息地的小環境相關，很難清晰界定遺傳分化的界限。（2）東方蜜蜂種群分布處于動態變化。蜜蜂種群的大小及分布等與溫度和濕度等自然環境、蜜粉源等食物來源、人為干擾等因素密切相關，因此種群的分布界限也處于動態變化過程中。

4 結論

貴州省東方蜜蜂在線粒體tRNAleu～COII和COI片段上的遺傳多樣性處于較高水平，主要歸功于蜂群數量大和飼養方式較原始；貴州東方蜜蜂整體上呈現中度遺傳分化，且西部東方蜜蜂組群內部的遺傳分化程度較東部東方蜜蜂組群更高，主要與溫度和濕度等環境因子密切相關，是其為適應所處環境而進化產生，而非海拔因素造成。

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（責任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2022-07-12

基金項目：貴州省科技計劃項目（黔科合基礎〔2019〕1453號）；國家現代農業產業技術體系建設專項（CARS-44-SYZ-22）；貴州省農業科學院科技項目（黔農科院青年科技基金〔2020〕08號，黔農科院種質資源〔2022〕16號）

通訊作者：于瀛龍（1989-），http：//orcid.org/0000-0002-2187-1687，博士，主要從事蜜蜂生物學研究工作，E-mail：yuyinglong2012@163.com；韋小平（1977-），http：//orcid.org/0000-0002-4999-0952，博士，研究員，主要從事蜜蜂生物學與生態學研究工作，E-mail：xiaopinggzaas@126.com

第一作者：周文才（1992-），http：//orcid.org/0000-0002-5424-3142，主要從事蜜蜂生物學研究工作，E-mail：2629779134@qq.com