紅芪多糖對糖尿病胃輕癱大鼠胃竇組織平滑肌細胞焦亡的影響

仲倩利，李榮科，萬生芳，張倩，魏昭暉，郭倩，馬欣欣，張磊，楊雅麗，張亞男

甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000

糖尿病胃輕癱（diabetic gastroparesis，DGP）是糖尿病常見的消化系統并發癥之一，以非梗阻因素所致的胃排空延遲為特點[1]，主要表現為早飽、惡心、嘔吐、腹脹、厭食等，嚴重降低患者生活質量。DGP發病機制復雜，有研究指出，細胞焦亡與糖尿病及其并發癥進展有關[2]，細胞焦亡引起的大量炎癥因子釋放是DGP重要病理環節。DGP屬中醫學“痞滿”“嘔吐”等范疇，其病機以脾虛為本，治當健脾益氣，用藥以補氣健脾類藥物為主[3]。紅芪是補氣中藥，其主要活性成分紅芪多糖有抗炎、抗氧化、免疫調節及延緩糖尿病并發癥等作用[4]。課題組前期研究表明，紅芪多糖能降低DGP大鼠血糖，調節血脂代謝，促進胃排空，增加胃激素含量，修復胃腸組織損傷，提高胃腸動力[5-7]。本實驗觀察紅芪多糖對DGP大鼠胃竇組織平滑肌細胞焦亡的影響，深入探討紅芪多糖提升胃動力、促進胃排空的分子機制，為開發治療DGP藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級 雄性Wistar 大鼠60 只，6 周齡，體質 量（180±20）g，北京斯貝福生物科技有限公司提供，動物許可證號SCXK（京）2019-0010。飼養于甘肅中醫藥大學，溫度22～25 ℃，相對濕度45%～50%。本實驗經甘肅中醫藥大學實驗動物中心動物倫理委員會審批（2021-804）。

1.2 藥物及制備

紅芪多糖，陜西省寶雞市方晟生物開發公司制備，純度72.4%，批號20200315。枸櫞酸莫沙必利分散片，成都康弘藥業集團股份有限公司提供，5 mg/片，批號190614。

1.3 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素（STZ，德國VETEC 公司，批號WXBD4971V），蘇木素-伊紅染液（江蘇艾迪生物，批號B1003），TUNEL 試劑盒（瑞士Roche，批號11684817910），RNA提取試劑盒（上海翌圣生物，批號19221ES50），NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）抗體（美國ImmunoWay公司，批號YT5328），胱天蛋白酶-1（Caspase-1）抗體（美國ImmunoWa 公司，批號YT5743），焦孔素D（GSDMD）抗體（武漢三鷹，批號20770-1-AP），白細胞介素（IL）-1β 抗體（美國ImmunoWay公司，批號YT5201），GAPDH一抗（美國Affinity公司，批號AF7021），辣根過氧化物酶標記二抗（美國Affinity 公司，批號S0001），Super ECL Plus超敏發光液（北京普利萊，批號P10100）。血糖儀（羅氏卓越金采，型號Accu-Chek Performa），高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific 公司，型號FRESCO 21），離心機（常州市金壇恒豐，型號XYJ80-2），包埋機（武漢俊杰，型號JB-P5），病理切片機（上海徠卡，型號RM2016），正置光學顯微鏡（日本尼康，型號Nikon Eclipse CI），倒置熒光顯微鏡（日本尼康，型號Nikon Eclipse Ti-SR），顯微鏡相機控制器（日本尼康，型號Nikon DS-U3），多功能酶標儀（瑞士Tecan公司，型號Infinite M200 Pro），實時定量PCR儀（美國Thermo公司，型號Varioskan Lux），搖床（海門市麒麟醫用儀器廠，型號TS-92），凝膠電泳儀、轉膜儀（美國Bio-Rad 公司，型號PowerPoc Basic），多功能分子成像系統（美國Azure Biosystems公司，型號c600）。

1.4 分組、造模及給藥

60只大鼠適應性喂養1周后，隨機選取10只作為空白組，剩余50只禁食不禁水24 h，一次性腹腔注射1%STZ溶液（溶于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，pH=4.5）50 mg/kg，空白組注射等體積檸檬酸緩沖液。72 h后尾靜脈采血檢測隨機血糖，≥16.7 mmol/L且維持1周以上為糖尿病造模成功[5]。DM大鼠予高脂高糖飼料不規則喂養（單日上午進食、雙日下午進食），連續喂養4周后檢測隨機血糖，≥16.7 mmol/L并伴有腹部脹大、體質量減輕等表現，隨機抽取空白組和造模大鼠各2只處死，檢測胃肌電活動，造模大鼠胃自主收縮頻率較空白組顯著降低提示DGP模型制備成功。將成模大鼠隨機分為模型組、莫沙必利組及紅芪多糖低、中、高劑量組，每組分別為11、8、9、9、8只。實驗第6周開始給藥，根據體表面積法及紅芪多糖純度計算等效劑量，莫沙必利組予枸櫞酸莫沙必利分散片3.5 mg/kg灌胃，紅芪多糖低、中、高劑量組分別予紅芪多糖50、100、200 mg/kg灌胃（灌胃時將所需用量枸櫞酸莫沙必利分散片和紅芪多糖分別溶于2 mL純凈水），灌胃體積均為2 mL，空白組和模型組予等體積純凈水灌胃，每日1次，連續8周。給藥期間空白組予普通飼料喂養，其余各組繼續予高脂高糖飼料喂養，每2周尾靜脈采血檢測隨機血糖并測量體質量。

1.5 指標檢測

1.5.1 胃排空率檢測

給藥結束后，大鼠禁食24 h、禁水2 h，予50 mg/dL酚紅溶液2 mL灌胃，20 min后10%水合氯醛腹腔注射（0.33 mL/100 g）麻醉，剖腹結扎賁門和幽門，取出整胃，沿胃大彎剪開，生理鹽水沖洗胃內容物，定容至20 mL，加入0.5 mol/L氫氧化鈉20 mL攪拌均勻，室溫靜置1 h，取5 mL上清液，加入20%三氯乙酸溶液0.5 mL去蛋白，3 500 r/min離心15 min，取上清液。另取酚紅溶液2 mL，依次加入生理鹽水18 mL、0.5 mol/L氫氧化鈉20 mL、三氯乙酸溶液4 mL，攪拌均勻，作為標準品。多功能酶標儀波長560 nm 處測定吸光度（A值），計算胃排空率。胃排空率（%）=（標準品A值-樣品A值）÷標準品A值×100%。

1.5.2 HE染色

取相同部位胃竇組織，放入固定液中固定，脫水，透明，石蠟包埋，切片（厚度4 μm），依次放入二甲苯Ⅰ20 min、二甲苯Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ10 min、無水乙醇Ⅱ10 min、95%乙醇5 min、90%乙醇5 min、80%乙醇5 min、70%乙醇5 min，蒸餾水洗。Harris蘇木素染6 min，自來水洗，1%鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗，伊紅染液染色3 min，切片依次放入95%乙醇Ⅰ5 min、95%乙醇Ⅱ5 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、二甲苯Ⅰ5 min、二甲苯Ⅱ5 min脫水透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，圖像采集分析。

1.5.3 TUNEL染色

石蠟切片脫蠟至水，加蛋白酶K工作液（用PBS以1∶9稀釋），37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次，加破膜工作液，常溫孵育20 min，PBS 洗滌5 min×3次，取TUNEL 試劑盒內試劑1（TdT）和試劑2（dUTP）按2∶29混合，覆蓋組織，切片放于濕盒內，37 ℃孵育2 h，PBS 洗滌5 min×3 次，加DAPI 染液，避光室溫孵育10 min，PBS洗滌5 min×3次，切片甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，每張切片隨機挑選3個200倍視野拍照，綠色熒光細胞核為DNA損傷陽性細胞，藍色細胞核為活細胞，計算細胞損傷率。細胞損傷率（%）=DNA損傷陽性細胞數÷活細胞數×100%。

1.5.4 RT-qPCR檢測

稱取大鼠胃竇組織100 mg于無酶EP管中，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，反轉錄成cDNA，將所得cDNA樣品分別配制RT-qPCR體系進行擴增。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性0.05 s，60 ℃退火34 s，共40個循環。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物由上海翌圣生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.5.5 Western blot檢測

取胃竇組織100 mg于EP管中，預冷生理鹽水清洗，剪碎，加入蛋白裂解液，勻漿機70 Hz、180 s研磨，置于冰上裂解，每15 min進行一次反復晃動，2 h后，低溫離心機4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，上樣，SDS-PAGE分離蛋白，將蛋白轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜6 min×4次，加入NLRP3、Caspase-1、IL-1β一抗（均為1∶500）、GSDMD 一抗（1∶2 000）、GAPDH一抗（1∶3 000），4 ℃孵育過夜，TBST洗膜6 min×4 次，滴加二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜6 min×4次，ECL發光液顯色，多功能分子成像系統成像。采用Image J 1.4.8軟件進行蛋白灰度分析，以目的蛋白與內參蛋白（GAPDH）灰度值比值計算蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0.1統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，進行正態性和方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較用t檢驗；不符合正態分布或方差不齊采用非參數秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況

造模時大鼠死亡3只，給藥過程中模型組和紅芪多糖低、中劑量組各死亡3、1、1只，最終空白組、模型組及紅芪多糖各劑量組均剩余8只大鼠?？瞻捉M大鼠活躍，毛色光澤，墊料干燥；模型組大鼠懶動，喜臥扎堆，毛色黯淡，墊料潮濕；隨著給藥時間增加，各給藥組大鼠一般狀況逐漸好轉，以紅芪多糖高劑量組和莫沙必利組較為明顯。

2.2 紅芪多糖對模型大鼠隨機血糖和體質量的影響

與空白組比較，給藥各時點模型組大鼠隨機血糖顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，給藥4周后紅芪多糖高劑量組和莫沙必利組大鼠隨機血糖顯著降低（P＜0.05），給藥8周后紅芪多糖各劑量組和莫沙必利組大鼠隨機血糖顯著降低（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠不同時點隨機血糖比較（±s，mmol/L）

表2 各組大鼠不同時點隨機血糖比較（±s，mmol/L）

注：與空白組同一時點比較，##P＜0.01；與模型組同一時點比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組給藥8周5.81±1.30 32.24±0.81##25.95±2.14**25.29±4.38**23.45±6.68**22.03±6.78**只數8 8 8 8 8 8給藥2周5.76±1.29 31.50±1.13##31.10±1.70 30.95±0.35 29.25±1.06 29.15±3.75給藥4周5.70±1.28 32.60±0.21##28.18±1.41 29.48±0.84 27.57±3.99*27.50±5.09*給藥6周5.75±1.28 32.30±0.14##28.18±1.41 28.03±3.10 25.75±6.63**25.50±4.69**

與空白組比較，給藥各時點模型組大鼠體質量顯著減輕（P＜0.01）；與模型組比較，給藥2周后紅芪多糖高劑量組和莫沙必利組大鼠體質量顯著增加（P＜0.01），給藥4周后紅芪多糖中、高劑量組和莫沙必利組大鼠體質量顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），給藥8周后紅芪多糖各劑量組和莫沙必利組大鼠體質量顯著增加（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠不同時點體質量比較（±s，g）

表3 各組大鼠不同時點體質量比較（±s，g）

注：與空白組同一時點比較，##P＜0.01；與模型組同一時點比較，*P＜0.05，**P＜0.01

給藥8周480.84±47.79 229.51± 8.20##283.78±30.83**316.25±32.94**340.13±43.60**374.69±45.64**組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組只數8 8 8 8 8 8給藥2周429.56±44.93 278.81±25.10##291.08±12.22 317.49± 9.42 329.68±20.37**364.30±35.67**給藥4周445.84±46.48 264.15±11.39##268.26±31.48 308.08±25.72*307.39±25.10*351.14±37.86**給藥6周463.23±47.28 246.99±16.35##263.29±31.48 310.71±26.73**327.65±30.23**366.41±39.87**

2.3 紅芪多糖對模型大鼠胃排空率的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃排空率顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，紅芪多糖各劑量組和莫沙必利組大鼠胃排空率顯著升高（P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠胃排空率比較（±s，%）

表4 各組大鼠胃排空率比較（±s，%）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

胃排空率77.72±3.01 30.46±5.47##44.51±4.33**52.29±4.82**65.06±1.78**73.67±2.81**組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組只數8 8 8 8 8 8

2.4 紅芪多糖對模型大鼠胃竇組織病理形態的影響

空白組大鼠胃竇組織腺體結構清晰，上皮細胞未見明顯變性脫落，無炎性細胞浸潤；模型組大鼠胃竇組織腺體結構破壞，細胞膜完整性喪失，大面積黏膜上皮細胞壞死脫落，有大量炎性細胞浸潤；各給藥組大鼠胃竇組織炎性細胞浸潤減少，以莫沙必利組和紅芪多糖高劑量組作用較顯著。見圖1。

圖1 各組大鼠胃竇組織形態（HE染色，×100）

2.5 紅芪多糖對模型大鼠胃竇組織平滑肌細胞DNA損傷的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織平滑肌細胞損傷率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，紅芪多糖中、高劑量組和莫沙必利組大鼠胃竇組織平滑肌細胞損傷率顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表5。

圖2 各組大鼠胃竇組織平滑肌細胞DNA損傷情況（TUNEL染色，×200）

表5 各組大鼠胃竇組織平滑肌細胞損傷率比較（±s，%）

表5 各組大鼠胃竇組織平滑肌細胞損傷率比較（±s，%）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

細胞損傷率1.94±0.02 18.87±4.96##9.76±9.28 7.27±1.97*3.69±1.47**3.42±0.42**組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組只數8 8 8 8 8 8

2.6 紅芪多糖對模型大鼠胃竇組織焦亡相關mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA 表達顯著降低（P＜0.01）。見表6。

表6 各組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA表達比較（±s）

表6 各組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01

組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組IL-1β 1.00±0.05 1.55±0.21##0.96±0.12**0.88±0.12**0.68±0.13**0.49±0.09**只數8 8 8 8 8 8 NLRP3 1.13±0.67 1.71±0.33##0.77±0.09**0.65±0.07**0.60±0.16**0.46±0.03**Caspase-1 1.00±0.10 1.48±0.33#0.88±0.01**0.57±0.03**0.45±0.02**0.20±0.01**GSDMD 1.00±0.08 1.47±0.21#0.80±0.15**0.52±0.03**0.27±0.05**0.21±0.05**

2.7 紅芪多糖對模型大鼠胃竇組織焦亡相關蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β 蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3、表7。

圖3 各組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白免疫印跡

表7 各組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達比較（±s）

表7 各組大鼠胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組模型組紅芪多糖低劑量組紅芪多糖中劑量組紅芪多糖高劑量組莫沙必利組IL-1β 0.29±0.11 0.51±0.16##0.23±0.08**0.21±0.08**0.17±0.06**0.14±0.04**只數8 8 8 8 8 8 NLRP3 0.17±0.03 0.32±0.05#0.13±0.03*0.12±0.03*0.09±0.02**0.08±0.02**Caspase-1 0.30±0.06 0.48±0.06#0.21±0.08**0.19±0.05**0.15±0.01**0.09±0.02**GSDMD 0.20±0.07 0.39±0.11#0.19±0.04*0.14±0.01**0.09±0.02**0.08±0.01**

3 討論

糖尿病是一種復雜的非感染性炎癥性疾病，也是臨床常見代謝性疾病，我國2 型糖尿病患病率達11.2%[8]，其發病率高、并發癥多、危害嚴重。糖尿病患者多伴有消化系統功能異常，其中最常見的是DGP，發病率占糖尿病的60%以上[9]。由于其發病較為隱匿，且早期多以消化道癥狀為主，因而極易被忽視。目前DGP發病機制尚未完全明確，多數學者認為DGP是在高血糖基礎上由自主神經病變、Cajal間質細胞病變、胃腸激素分泌異常、胃腸平滑肌炎癥、免疫系統及其他因素導致，胃平滑肌細胞損傷、胃腸肌運動功能減弱是其關鍵機制[10-11]。有研究發現，DGP患者胃腸組織存在廣泛的炎性細胞浸潤，炎癥因子及炎癥反應在DGP的發病過程中起著至關重要的作用[12-13]。

細胞焦亡是一種由Gasdermin蛋白介導的Caspase依賴的炎癥性程序性細胞死亡方式，具有凋亡和壞死的特點，包括細胞核萎縮、DNA斷裂和TUNEL染色陽性、細胞腫脹和破裂、炎癥反應[14-15]。NLRP3、Caspase-1和GSDMD是細胞焦亡的核心因子，NLRP3能識別高糖、高脂等內源性損傷相關分子模式，與凋亡相關斑點樣蛋白和Caspase-1前體組裝成多蛋白復合體即NLRP3炎性小體，進而使Caspase-1活化，促進炎癥因子IL-1β和IL-18加工和成熟，引發炎癥級聯反應，特異性切割GSDMD，產生具有細胞膜成孔活性的GSDMD-N片段，形成質膜孔，釋放炎癥因子和危險相關分子模式，引發細胞焦亡，激活下游炎癥反應，導致細胞內滲透壓增加，致使細胞腫脹裂解，進一步擴大免疫炎癥反應[16-17]。

研究發現，細胞焦亡與糖尿病及其并發癥的發生發展有關[18]。高脂喂養小鼠Caspase-1、NLRP3 和GSDMD水平明顯升高，抑制脂肪細胞NLRP3炎性小體激活可改善胰島素抵抗[19]；Caspase-1 通過參與由NLRP3炎性小體調節的炎癥反應影響糖尿病患者腎臟結構和功能[20]；GSDMD介導的細胞焦亡會加速胰島β細胞破壞，導致胰島素抵抗[21]。NLRP3炎性小體激活后釋放大量促炎因子IL-1β，導致胰島素分泌異常，最終引發糖尿病[22]?；诖?，可以認為NLRP3、Caspase-1、GSDMD和IL-1β與糖尿病及其并發癥密切相關。DGP是糖尿病的重要并發癥之一，胃腸平滑肌炎癥是DGP 發生的重要機制，細胞焦亡的發生伴隨大量炎癥因子釋放及持續的炎癥反應，因此推測糖尿病持續的高糖高脂狀態引發炎癥級聯反應，導致胃竇平滑肌細胞損傷，細胞焦亡，使胃動力減弱、胃排空減慢，進而引發DGP。

本實驗結果發現，模型大鼠胃竇組織出現大面積黏膜上皮細胞壞死脫落，有明顯炎性細胞浸潤，同時胃竇組織平滑肌細胞出現細胞膜完整性喪失、DNA損傷顯著增加，NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA和蛋白表達顯著升高，以上病理變化可能是導致大鼠血糖升高，體質量、胃排空率顯著降低的原因；經藥物干預后，各給藥組大鼠狀態明顯好轉，血糖顯著降低，體質量、胃排空率顯著升高，胃竇組織黏膜損傷程度減輕，胃竇組織平滑肌細胞DNA損傷減少，NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA 和蛋白表達顯著降低，提示胃平滑肌炎癥及損傷減輕，胃動力有所恢復。

綜上，紅芪多糖能改善DGP大鼠一般狀況，提高胃排空率，一定程度上減輕胃平滑肌炎癥損傷、恢復胃動力，其機制可能與下調胃竇組織NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β mRNA和蛋白表達，進而抑制細胞焦亡有關。關于紅芪多糖調控細胞焦亡的深層分子機制，課題組將從代謝組學角度進一步研究。