超聲-微波聯合提取紫薯花色苷及其穩定性研究

玉 瀾蔣雅茵，張 鵬

（1.廣西科技師范學院 食品與生化工程學院，廣西來賓 546199；2.廣西科技師范學院 功能性食品配料工程技術研究中心，廣西來賓 546199）

0 引言

紫薯（Purple Potato）是甘薯的一種特殊品種類型，皮肉呈紫紅至深紫，主要產于廣西、廣東、福建等亞熱帶地區［1］。近年來，隨著人們對新型營養保健食物資源開發熱點的追求，紫薯相關產品的研發應用也層出不窮［2］。紫薯含有大量的花色苷（Anthocyanin），相較葡萄、草莓、紫甘藍和紫蘇等其他果蔬中的花色苷，穩定性更強［3］，是花色苷色素的良好來源。

花色苷屬于多酚類化合物，由花青素與植物體內各種單糖通過糖苷鍵縮合形成［4］。不僅可用于食品的著色，還具有抗衰老、抗變異及抗腫瘤等許多對人體有益的營養保健作用［5］，在食品及醫療領域有極大的開發價值和十分廣闊的應用前景。但其結構中含有活潑的酚羥基，穩定性較差，易在強酸、強堿或高溫環境中喪失生物活性［6］。目前常用的花色苷提取方法中，超聲輔助提取法是利用超聲波輻射產生的機械效應和熱效應加速花色苷溶解［7］；微波輔助提取法是利用高頻率微波令細胞內的極性物質吸收大量微波能，利于有機溶劑進入細胞內溶解釋放花色苷［8］。這2種輔助提取方法具有不破壞花色苷、提取時間短、效率高和雜質少等優點。

本文將2種輔助提取方法聯合，以廣西巴馬紫薯為研究對象，以乙醇為提取溶劑，考察乙醇體積分數、超聲時間、超聲功率以及液料比對花色苷提取率的影響，采用響應面法優化提取工藝條件，并考察光照時間、溫度變化及pH值對紫薯花色苷提取液穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯（品種為巴馬紫薯，購自廣西巴馬瑤族自治縣）；無水檸檬酸、氯化鈉、氯化鉀抗壞血酸、結晶乙酸鈉、鹽酸、無水乙醇等均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-3C型酸度計（上海智光儀器儀表有限公司）；KQ-300DB型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XH-100B型微波催化合成儀（北京翔鵠科技發展有限公司）；H1850型臺式高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；UV-2700型紫外-可見分光光度計（島津企業管理（中國）有限公司）；HH-S6型數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

制備紫薯粉末：紫薯洗凈去皮切成0.5 cm薄片，用護色劑（0.6%氯化鈉、0.6%檸檬酸、0.6%抗壞血酸）浸泡10 min后，置于45 ℃烘箱內60 min，烘干表面水分［9］，真空干燥12 h后粉碎過80目篩，將紫薯粉末置于密封袋中低溫避光保存。

1.3.2 提取工藝流程

稱取2.0 g紫薯粉末，以乙醇-水溶液為提取試劑，按試驗方案設計的液料比進行混合后，設置一定的功率、時間條件，分別置于微波合成儀中進行微波輔助提取，再置于超聲波清洗儀中超聲振動提取后離心作用（4 000 r/min，10 min），即得花色苷提取液。

1.3.3 確定紫薯花色苷最大吸收波長

以去離子水為對照，使用紫外-可見分光光度計，在可見波長400～700 nm范圍內對稀釋的澄清花色苷提取液進行吸收光譜掃描［10］，根據獲得的吸收光譜圖，確定提取液中花色苷的最大吸收波長為532 nm。

1.3.4 測定花色苷的提取量

采用pH示差法測定紫薯花色苷的提取量［11］。取1 mL紫薯花色苷提取液于10 mL納氏比色管中，分別用KCl-HCl溶液（pH=1.0）和CH3COONa-HCl溶液（pH=4.5）定容至10 mL，使用分光光度計分別在波長532，700 nm處測定其吸光度A532nm和A700nm，代入式（1）和式（2），利用pH示差法計算花色苷的提取量（Y）［12］：

式中 Mw——矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾質量，449.2 g/mol；

DF——稀釋倍數；

V——提取液的總體積，mL；

ε——矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾消光系數，26 900 L/（mol·cm）；

L——光程，1 cm；

m——樣品質量，g。

1.3.5 單因素試驗

在固定乙醇體積分數50%，微波功率500 W，微波溫度40 ℃，微波時間1.5 min，超聲溫度40 ℃，超聲功率150 W，超聲時間30 min，液料比為20：1 mL/g的基礎上，進行單因素試驗，研究乙醇體積分數（40%，50%，60%，70%，80%）、超聲功率（120，150，180，210，240 W）、超聲時間（10，20，30，40，50 min）、微波功率（300，400，500，600，700 W）、微波時間（0.5，1，1.5，2，2.5 min）、液料比（15：1，20：1，25：1，30：1，35：1 mL/g）對紫薯花色苷提取量的影響，每個試驗重復3次。

1.3.6 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取乙醇體積分數（A）、超聲功率（B）、超聲時間（C）及液料比（D）為自變量，花色苷提取量（Y）為響應指標，利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件中Box-Behnken設計4因素3水平的響應面優化試驗，確定紫薯花色苷的最佳提取工藝參數。試驗因素與水平設計見表1。

表1 試驗設計因素水平表Tab.1 Test design factor level

1.3.7 穩定性試驗

（1）光照時間對花色苷穩定性的影響

分別移取10 mL提取液于6支試管，置于日光下，每隔1 h測定試管溶液中花色苷含量，考察光照時間對紫薯花色苷穩定性的影響。

（2）溫度對花色苷穩定性的影響

分別移取10 mL提取液于7支試管，放置于設置溫度為30，40，50，60，70，80，90 ℃的恒溫水浴鍋中，1 h后測定試管溶液中的花色苷含量，考察溫度變化對紫薯花色苷穩定性的影響。

（3）pH值對花色苷穩定性的影響

分別移取10 mL提取液于9支試管，調節各試管內溶液pH值為1，2，3，4，5，6，7，8，9，觀察提取液的顏色變化，考察pH值對紫薯花色苷穩定性的影響。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

如圖1所示，乙醇體積分數在40%～60%，花色苷提取量呈上升趨勢；在60%～80%，提取量緩慢降低。表明乙醇體積分數為60%時，紫薯樣品與乙醇-水溶液已充分反應，其中的花色苷充分溶出，提取量達到最大值，為0.820 8 mg/g。故將乙醇體積分數確定為60%。

圖1 乙醇體積分數、超聲功率和超聲時間對紫薯花色苷提取量的影響Fig.1 Effects of ethanol volume fraction,ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction amount of anthocyanin from purple potato

在超聲功率120～210 W，花色苷提取量保持上升趨勢。在超聲功率達210 W時，提取液中的花色苷含量達到最大值，為0.808 9 mg/g，此后的提取量急劇下降，原因可能是超聲功率過大會造成花色苷結構的變化，導致提取量減少。故將超聲功率確定為210 W。

花色苷提取量隨著超聲時間增加快速增大，超聲提取20 min時，提取液中的花色苷含量達到最大值，為0.840 1 mg/g；在20～50 min，花色苷的提取量持續下降。說明繼續增加超聲時間會使花色苷分子結構遭到破壞，導致其繼續分解，提取量減少。故將超聲時間確定為20 min。

微波功率、微波時間和液料比對紫薯花色苷提取量的影響如圖2所示。

圖2 液料比對紫薯花色苷提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction amount of anthocyanin from purple potato

微波功率在300～700 W，花色苷提取量呈先上升后下降趨勢。微波功率達500 W時，提取量最高，為0.753 1 mg/g。說明隨著微波功率升高，導致溶液體系溫度過高［13］，花色苷結構受到破壞，提取量下降。故將微波功率確定為500 W。

花色苷提取量隨著微波時間增加先增大，至1 min時，達到最大值，為0.710 7 mg/g；此后的1～2.5 min，花色苷提取量持續下降。說明隨著微波輻射時間延長，提取液中的花色苷發生降解，導致提取量降低。故將微波時間確定為1 min。

花色苷提取量在液料比增至20：1 mL/g時，提取完全，含量達到最大值，為0.739 7 mg/g，此后隨著液料比增大，花色苷提取量持續下降。說明乙醇溶劑增加會導致雜質成分的溶出，導致提取量下降。故將液料比確定為20：1 mL/g。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計結果

根據Box-Behnken響應面法優化設計的試驗方案，使用Design-Expert軟件進行回歸分析，得到二次多項式回歸方程：Y=1.140 5+0.140 2A+0.042 0B+0.114 2C+0.080 1D-0.047 7AB+0.036 4AC-0.075 3AD+0.01 1BC-0.001 5BD+0.074 6CD-0.1504A2-0.168 5B2-0.203 1C2-0.151 5 D2。

2.2.2 回歸模型的方差分析

方差分析與顯著性檢驗見表2。

表2 方差分析與顯著性檢驗Tab.2 Analysis of variance and significance test

模型P<0.000 1，表明回歸模型極顯著，失擬項P=0.294 9>0.05，表明模型失擬項不顯著；模型的相關系數R2=0.952 4，說明模型能夠解釋95.24%的變化；調RAdj2=0.904 9，表明模型與實測值擬合程度較好。綜上所述，可用模型分析預測紫薯花色苷的最優超聲-微波聯合提取工藝?；貧w方程一次項A，C，D及二次項A2，B2，C2，D2對花色苷提取量存在極顯著地影響，一次項B及交互項AD，CD影響顯著，其余因素不顯著?？疾斓?個因素對花色苷提取量的影響順序依次為乙醇體積分數（A）>超聲時間（C）>液料比（D）>超聲功率（B）。

2.2.3 各因素交互作用分析

進一步對影響紫薯花色苷提取量的4個因素進行交互作用分析，結合圖3各交互作用響應曲面和等高線圖可知，乙醇體積分數與液料比、超聲時間與液料比交互作用對花色苷提取量影響顯著（P<0.05）；乙醇體積分數與超聲功率、乙醇體積分數與超聲時間、超聲功率與超聲時間、超聲功率與液料比交互作用對紫薯花色苷的提取量影響不顯著（P>0.05），與方差分析結果一致。

圖3 各因素交互作用對花色苷提取量的影響Tab.3 Effect of interaction of various factors on the extraction amount of anthocyanin

2.2.4 確定最佳工藝條件和回歸模型驗證試驗

利用Design-Expert.V8.0.6.1軟件中Numerical分析預測出提取紫薯花色苷的最佳工藝參數：乙醇體積分數65.10%、超聲時間24.29 min、液料比21.44：1 mL/g、超聲功率212.32 W，花色苷提取量的預測值達到1.161 0 mg/g。根據實際試驗條件及方案的可行性，調整參數為乙醇體積分數65%、超聲時間24 min、液料比21：1 mL/g、超聲功率210 W，在此工藝條件下進行提取試驗，3次試驗結果分別為1.133 8，1.079 9，1.100 9 mg/g，平均值為1.104 9 mg/g（RSD=2.46%），與理論預測值相近，說明模型可信度較高。

2.3 穩定性試驗結果

如圖4所示，暴露在日光下1～4 h，試管溶液中的花色苷含量出現小幅度降低，后隨著光照時間延長，花色苷逐漸降解，含量持續降低?？煽闯龌ㄉ盏姆€定性隨光照時間增長而減弱，短時間內的光照對花色苷穩定性的影響程度不大。

圖4 光照時間、溫度和pH值對紫薯提取液中花色苷含量的影響Fig.4 Effects of light time,temperature and pH value on anthocyanin content in purple potato extract

試管溶液中花色苷含量隨溫度升高而降低，在30 ～40 ℃，溫度對花色苷穩定性影響程度不大；至60 ℃以后，高溫環境使得試管溶液中的花色苷快速分解，導致花色苷含量下降明顯。

在酸性條件（pH值為1.0～5.0）下，試管溶液呈紅色，花色苷含量隨pH值變化較??；在pH值為5.0～8.0，試管溶液呈粉色至紫色，試管溶液中的花色苷含量隨pH值增大而大幅度降低，穩定性較差；當pH值達到9.0時，試管溶液呈藍綠色，花色苷含量隨pH值的變化幅度較小。

3 結語

本文采用超聲-微波聯合提取法提取紫薯中的花色苷，以響應面法對提取工藝進行優化，獲得最優工藝參數為乙醇體積分數65%、超聲功率210 W、超聲時間24 min、液料比21：1 mL/g、微波時間1 min、微波功率500 W，在此工藝下可得最大紫薯花色苷提取量1.104 9 mg/g，高于單獨使用超聲輔助提取法或微波輔助提取法。穩定性研究結果表明，試管溶液中紫薯花色苷的含量隨著光照時間延長、溫度升高及pH值的增大均逐漸降低?；ㄉ赵跍囟雀哂?0 ℃后分解速度加快、穩定性較差，處酸性條件中穩定性較好、堿性條件則易分解，繼續延長光照時間也將導致花色苷悉數分解。即表明在較短時間內，光照對花色苷穩定性影響不大，溫度和pH值的變化對花色苷穩定性影響較大。