響應面法優化甘蔗番木瓜復合果醋發酵工藝

余森艷，李 潔，何 文，盧珍蘭，李志紅，王 強

（1.廣西民族師范學院 化學與生物工程學院，廣西崇左 532200；2.廣西民族師范學院 甘蔗產業鏈協同創新中心，廣西崇左 532200）

0 引言

甘蔗屬多年生高大實心草本，在我國福建、海南、廣東、廣西和云南等南方熱帶及亞熱帶地區廣泛種植［1］。甘蔗富含鐵、鈣、磷和鋅等人體必需微量元素以及多酚、黃酮等成分，具有補充能量、補血和抗氧化等功效［2］。作為廣西重要的經濟農作物，甘蔗是我國糖業的重要組成部分，但其產業鏈比較單一，若將甘蔗直接用于食品深加工領域將大有可為。番木瓜又稱木瓜，是十字花目番木瓜科水果，廣泛分布于世界熱帶及亞熱帶地區，素有“嶺南佳果”之美稱［3］，營養豐富，食療價值較高，具有抗氧化、護肝降脂等保健功效［4］，具有較高的開發價值［5］。

果醋以水果為主要原料，利用現代生物技術釀制而成，是集營養、保健和食療等功能為一體的新型飲品。甘蔗富含糖分，是釀造果酒與果醋的良好原料。近幾年關于甘蔗醋的研究略有所見［6-7］，但將甘蔗與番木瓜復合釀造果醋的研究鮮有報道。本文充分利用廣西特有的甘蔗和番木瓜資源，通過酒精發酵與醋酸發酵2步發酵工藝釀制復合果醋，既可獲得果香怡人、酸味適宜的果醋產品，還可延伸甘蔗與番木瓜加工產業鏈，提升經濟附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗和番木瓜：崇左農貿市場；果酒酵母：安琪酵母（崇左）有限公司；果醋菌：煙臺帝伯士自釀有限公司；蜂蜜：上海冠生園蜂制品有限公司；75%食用酒精：河南漢永酒精有限公司；0.05 mol/L氫氧化鈉標準滴定溶液：飛凈生物科技有限公司。

JYZ-E3C型榨汁機（九陽股份有限公司）；LRH-400A型生化培養箱（廣東泰宏君科學儀器股份有限公司）；YP5002型電子天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；PAL-1型手持糖度計（深圳市卓越儀器儀表有限公司）；酒精計（浙江力辰儀器科技有限公司）；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；BD-320HEM型冰箱（青島海爾特種電冰柜有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 工藝流程

復合果醋的工藝流程如圖1所示。

圖1 復合果醋的工藝流程Fig.1 Process flow of compound fruit vinegar

1.2.2 操作要點

（1）甘蔗汁的制備：挑選成熟適度、無霉變的新鮮市售甘蔗為原料，經去皮、切塊、榨汁、過濾，100 ℃滅菌5 min后冷卻，獲得甘蔗汁備用。

（2）番木瓜汁的制備：選擇八九成熟的新鮮番木瓜，去皮、去籽、切塊，熱燙90 s，以鈍化木瓜蛋白酶活性，再按番木瓜與水質量比1：1榨汁、過濾，100 ℃殺菌3 min后冷卻，獲得番木瓜汁備用。

（3）調配、調糖：將制備好的甘蔗汁、番木瓜汁按照一定體積比混合，再用蜂蜜調整初始糖度至適宜范圍。

（4）殺菌、冷卻：將調糖后的甘蔗番木瓜復合汁在100 ℃滅菌5 min，冷卻備用。

（5）酒精發酵：通過前期試驗確定甘蔗番木瓜復合果酒發酵的條件為甘蔗汁與番木瓜汁的體積配比1：1，酵母添加量0.6%、發酵溫度32 ℃、初始糖度16%、發酵時間7 d，在此條件下發酵所得的甘蔗番木瓜復合果酒具有較好的風味，酒香濃郁怡人，醇厚爽口。

（6）調整酒精度：利用酒精計測定酒精度，將復合果酒用無菌水及食用酒精調整到醋酸發酵所需要的酒精度。

（7）醋酸發酵：在調整好酒精度的甘蔗番木瓜復合果酒中加入果醋菌，敞口靜置進行醋酸發酵，每天攪拌2～3次，以增加溶氧水平。

（8）殺菌：將發酵結束的甘蔗番木瓜復合果醋過濾后，在95～100 ℃條件下殺菌約10 min，然后迅速冷卻至常溫。

1.3 醋酸發酵單因素試驗設計

以果醋菌添加量、發酵溫度、發酵時間及初始酒精度4個因素進行醋酸發酵單因素試驗，設計各因素水平：果醋菌添加量1%，2%，3%，4%，5%；發酵溫度30，32，34，36，38 ℃；發酵時間7，9，11，13，15 d；初始酒精度6%，7%，8%，9%，10%。當研究其中1個因素時，其余3個因素取各水平中間值，以總酸為指標，研究此4個因素對醋酸發酵的影響。

1.4 醋酸發酵工藝優化響應面試驗

在醋酸發酵單因素試驗的基礎上，以總酸［Y，以乙酸計，g/（100 mL）］為響應值，以果醋菌添加量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）和初始酒精度（D）4個因素為自變量，設計4因素3水平的響應面分析方法，對復合果醋的發酵工藝條件進行優化。

1.5 數據處理與分析

利用Origin 2019軟件完成單因素試驗作圖；運用Design-Expert 8.0.6軟件完成響應面試驗作圖及數據處理分析。

1.6 理化成分測定

酒精度：使用酒精計測定。

糖度：使用手持糖度計測定。

總酸：參照GB 12456-2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》，采用酸堿滴定法測定（以乙酸計）。

2 結果與分析

2.1 醋酸發酵最佳工藝條件的確定

2.1.1 果醋菌添加量與發酵溫度的確定

由圖2可知，隨著果醋菌添加量增加，總酸含量先升后降，當果醋菌添加量為3%時，總酸含量達到最大。果醋菌添加量過少，不利于發酵產酸；果醋菌添加量過多，菌的生長會消耗發酵液中的營養物質，同時還會造成溶氧降低，導致最終生成的總酸含量下降［8］。

圖2 果醋菌添加量與發酵溫度對醋酸發酵的影響Fig.2 Effects of addition amount of fruit vinegar bacteria and temperature on acetic acid fermentation

隨著發酵溫度升高，總酸含量先升后降。當發酵溫度為34 ℃時，總酸含量達到最大。這可能是因為適宜的溫度有利于果醋菌生長繁殖和產酸。當發酵溫度偏低或偏高時，果醋菌的酶活性被抑制，導致產酸能力下降。

因此，選擇果醋菌添加量進行響應面試驗的3個水平為2%，3%，4%；選擇發酵溫度進行響應面試驗的3個水平為32，34，36 ℃。

2.1.2 發酵時間與初始酒精度的確定

由圖3可知，總酸含量隨著發酵時間增加而呈上升趨勢。當發酵時間為11 d時，總酸含量達到最大；繼續延長發酵時間，總酸含量呈緩慢下降趨勢。這可能是因為發酵時間過長，一部分醋酸被分解，還有部分醋酸揮發損失，導致最終總酸含量出現不升反而略降的現象。若發酵時間過短，發酵不完全，總酸含量也不高。

圖3 發酵時間與初始酒精度對醋酸發酵的影響Fig.3 Effects of fermentation time and initial alcohol content on acetic acid fermentation

隨著初始酒精度的增加，總酸含量先上升后下降。當初始酒精度為8%時，總酸含量達到最大值。酒精度的高低會影響總酸的產量，酒精度太低，果醋菌能利用的底物少，則產酸量也變少；而酒精度過高，果醋菌受到一定的抑制而導致發酵產酸能力降低。

因此，選擇發酵時間進行響應面試驗的3個水平為9，11，13 d；選擇初始酒精度進行響應面試驗的3個水平為7%，8%，9%。

2.2 醋酸發酵工藝響應面法優化試驗結果

根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理［9］，在醋酸發酵單因素試驗基礎上，進行4因素3水平的響應面試驗設計，如表1所示；回歸分析結果如表2所示。

表1 醋酸發酵響應面試驗因素水平設計Tab.1 Horizontal design of response surface test factors for acetic acid fermentation

表2 回歸分析與結果Tab.2 Regression analysis and results

根據試驗結果，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行回歸分析，得到回歸方程式：Y=5.19+0.37A+0.34B+0.09C-0.13D+0.19AB+0.45AC-0.29AD+0.18BC+0.13BD+0.34CD-0.73A2-0.45B2-0.17C2-0.29D2。

由表2可知，模型的P<0.000 1<0.01，表明模型方程極顯著，說明試驗方法可行可靠；失擬項P=0.103 8>0.05，失擬項不顯著，說明模型的擬合度較好，方程能夠很好地反映果醋菌添加量、發酵溫度、發酵時間、初始酒精度和總酸之間的準確關系，可以利用回歸方程式得出甘蔗番木瓜復合發酵果醋的最佳工藝條件；回歸分析結果顯示R2=0.961 0，R2adj=0.922 0，2者相差<0.2，說明預測值與真實值相關性很高。一次項A，B對總酸有極顯著影響，D對總酸有顯著影響；交互項AC，AD，CD對總酸有極顯著影響，AB，BC對總酸有顯著影響；二次項A2，B2，D2對總酸有極顯著影響，C2對總酸有顯著影響；其他各因素對總酸的影響不顯著（P>0.05）。

2.3 甘蔗番木瓜復合發酵果醋工藝優化響應面圖

從Design-Expert 8.0.6響應面分析軟件中得到兩兩因素間的三維響應曲面圖如圖4。曲面圖可直接反應各因素交互作用對果醋總酸的影響，曲面的坡度越陡，說明該因素對果醋發酵過程的影響越大［10］。

圖4 各因素交互作用對總酸影響的曲面圖Fig.4 Curved surface of influence of interaction of various factors on total acid

總酸含量隨著4個因素的增加先上升后下降。其中，果醋菌添加量和發酵時間、果醋菌添加量和初始酒精度、發酵時間和初始酒精度交互形成的曲面坡度陡峭，說明其交互作用強，對總酸的影響極顯著；果醋菌添加量和發酵溫度、發酵溫度和發酵時間交互形成的曲面坡度較大，說明其交互作用較強［11-12］，對總酸的影響顯著。

2.4 驗證試驗

根據響應面分析試驗，結合回歸方程分析得出優化的甘蔗番木瓜復合果醋最佳發酵工藝條件：果醋菌添加量3%、發酵溫度35.487 ℃、發酵時間13 d、初始酒精度8.213%，在該預測條件下，果醋的總酸為5.59 g/（100 mL）。為了驗證試驗，并使結果更準確，根據實際情況對響應面試驗得出的最佳工藝條件進行調整：果醋菌添加量3%、發酵溫度36 ℃、發酵時間13 d、初始酒精度8%，在此發酵工藝條件下重復甘蔗番木瓜復合果醋發酵3次，得出果醋的平均總酸為5.60 g/（100 mL），該值與預測值接近，2者之間的相對誤差只有0.2%，說明模型能很好地反應果醋發酵的實際情況。因此使用該方法分析甘蔗番木瓜復合發酵果醋得到的數據可靠。

3 結語

以甘蔗和番木瓜為原料，依次進行酒精發酵、醋酸發酵，通過單因素試驗和響應面分析試驗，對甘蔗番木瓜復合果醋在醋酸發酵過程中的主要工藝參數進行優化，得出復合果醋的最佳發酵工藝條件：果醋菌添加量3%、發酵溫度36 ℃、發酵時間13 d、初始酒精度8%，在該條件下，果醋的總酸含量達到5.60 g/（100 mL），產品呈棕黃色，滋味酸爽，果香適宜，風味獨特。甘蔗番木瓜復合果醋的研發既可拓寬甘蔗與番木瓜加工產業鏈，提升農產品經濟附加值，還可豐富果醋品種，為果醋產業發展提供參考。