荔枝鋁激活蘋果酸轉運蛋白基因家族的鑒定及表達分析

錢義容，王 弋，全振炫，鄭雪文，李偉才，董 晨

（1.中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所/農業農村部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東 湛江 524091；2.云南農業大學熱帶作物學院，云南 普洱 665099）

【研究意義】鋁激活蘋果酸轉運蛋白（Alactivated malate transporter，ALMT）是植物中重要的一類膜蛋白，在植物有機酸的跨膜轉運中起著重要作用，如參與蘋果酸積累和轉運、重金屬脅迫、礦質營養、滲透勢和pH值調節、果實品質形成、氣孔運動、種子發育等過程［1-4］?！厩叭搜芯窟M展】在植物的生長過程中，酸性土壤中的鋁離子（Al3+）會對植物根部造成毒害，ALMT 作為陰離子通道能夠釋放蘋果酸鹽有機陰離子并以此為螯合劑，與Al3+形成穩定無毒的復合物，從而降低其毒性［5］。最早Sasaki 等［6］在耐鋁小麥（ET8）根尖中分離得到鋁誘導表達的一個ALMT1基因（TaALMT1），是植物中克隆獲得的第一個鋁激活蘋果酸轉運基因。ALMT 蛋白大多定位于細胞質膜、液泡膜等細胞器上，N 端和C 端均位于膜的外側，其N 端通常包含5～7 個跨膜結構域，參與Al3+結合的蘋果酸運輸，C 端有一個跨膜輸水區來維持運輸功能所必需［7-8］?；贏LMT 的重要性，擬南芥AtALMT1和小麥TaALMT1基因的鑒定引起人們對該家族的研究興趣，目前，已知在擬南芥基因組中有14 個ALMTs 蛋白，其相關功能基因的表達也有一些報道［9］。AtALMT1參與AL3+的耐受，主要在擬南芥根中表達，其表達水平受過氧化氫、pH 值、植物激素的影響［10］；AtALMT4主要在葉肉和保衛細胞中表達［11］；AtALMT6主要在保衛細胞中表達，其表達水平受蘋果酸、液泡pH 值和胞質鈣離子的影響［11-12］。據報道，多種植物ALMT家族基因的生物學功能也相應被鑒定，如橡膠樹（Heveabrasiliensis）中鑒定出17 個ALMTs基因［13］；普通煙草（Nicotianatabacum）中鑒定出30 個ALMTs基因，該基因受AL3+的誘導影響，大多數在莖中表達較高而在根部表達相對較低［14］；蘋果（Malusdomestica）基因組中鑒定出25 個ALMTs 成員，其中MaALMT1影響果實酸度、主要在果實中表達［15］；大豆中鑒定出34 個ALMTs基因，GmALMT5在低磷環境下顯著表達［8］；中國白梨中鑒定出27 個ALMTs基因，其中Pbr020270.1 作為候選基因可能在梨果實蘋果酸的積累中發揮重要作用［16］。綜上，ALMT基因家族成員在不同植物中均起著重要作用。荔枝（Litchichinensis）是無患子科荔枝屬常綠喬木，產于亞熱帶地區，喜高溫高濕氣候，在歷史上有“百果之王”等美稱。但荔枝產業中仍存在一些問題，如大小年、缺乏特早熟優質荔枝、早熟荔枝偏酸等?！颈狙芯壳腥朦c】ALMT 蛋白與植物生長發育和逆境響應有密切關系，荔枝果實酸度的研究目前集中在生理水平，分子水平的研究較少，ALMT 參與果實酸度調節，但在荔枝中ALMT基因家族的全基因組鑒定尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究基于全基因組水平對荔枝ALMT基因家族成員進行鑒定與分析，為ALMT基因家族在荔枝果實有機酸生物學功能研究方面提供初步依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為‘妃子笑’荔枝，種植于中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所荔枝種植園（21°10′02″N、110°16′34″E，海拔21.32 m），試驗基地地勢平坦、水源充足、灌溉條件優良，土壤為紅壤、肥力中等，土肥水管理一致。采集‘妃子笑’不同組織樣品，取秋梢新抽發的嫩梢葉片，老熟梢的成熟老葉，盛花期的雄花、雌花和根（新生長的須根），果實成熟期的果皮、果柄，用液氮速凍后于-80 ℃保存，用于后續RNA 提取。

1.2 荔枝LcALMT 家族成員鑒定及其蛋白理化性質、亞細胞定位分析

荔枝品種‘妃子笑’（LitchichinensisSonn.cv.Feizixiao）的基因組來源于荔枝基因組數據庫（http://www.sapindaceae.com/），META SEARCH工具搜索Al-activated malate transporter（鋁激活蘋果酸轉運蛋白），搜索注釋為Al-activated malate transporter 的基因，進一步通過NCBI Conserved Domains Search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）驗證搜索到的蛋白序列是否含有保守ALMT 結構域，得到含有完整保守結構域的蛋白，并將其命名為LcALMT，最終從荔枝全基因組中確定有16個LcALMTs。運 用ExPASy（https:web.expasy.org/protparam/）預測家族成員對應蛋白質的長度（aa）、分子量（kD）、等電點（pI）、不穩定系數和親水指數，運用在線網站（https:wolfpsort.hgc.jp/）進行亞細胞定位預測。

1.3 荔枝LcALMTs 系統進化關系與蛋白結構分析

為進一步了解LcALMTs 蛋白，利用公開發表模式植物擬南芥（14 個）和水稻（8 個）中的ALMTs 蛋白序列，擬南芥AtALMTs 蛋白序列從擬南芥官網TAIR（https://www.arabidopsis.org）下載獲得，水稻OsALMTs 蛋白序列從網站Rice Genome Annotation Project（http://eice.plantbiology.msu.edu/）獲得。16 個荔枝ALMTs 蛋白序列，使用MEGA 11 軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ），保持其他參數不變，設置Bootstrap 值為1 000，構建系統進化樹。

利用GORIV（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_gor4.html）預測蛋白質二級結構，然后利用在線工具SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預測蛋白質三級結構。

1.4 荔枝LcALMTs 的基因結構與保守基序分析

從荔枝基因數據庫中獲取ALMT家族成員的基因序列和對應的CDS序列，運用GSDS（http:gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線軟件進行荔枝ALMTs成員編碼區、內含子和非編碼區的結構分析。

使用MEME（http:meme-suite.org/tools/meme）在線軟件設置基數為12，其余為默認參數下預測分析荔枝ALMT 家族成員編碼蛋白的保守基序。

1.5 荔枝LcALMTs 啟動子上順式作用元件分析

利用在線網站Plantcare（http:bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對LcALMTs5'端上游2 000 bp 的序列進行順式作用元件分析。

1.6 荔枝LcALMTs 的染色體定位

根據荔枝全基因組注釋信息得到染色體基因位置信息，借助TBtools 軟件實現可視化。

1.7 荔枝LcALMTs 的組織表達

從荔枝基因組數據庫獲取LcALMTs基因在不同組織中的表達量（http://www.sapindaceae.com/），通過TBtools 繪制熱圖。

1.8 部分LcALMTs 的實時熒光定量PCR

使用植物RNA 提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司），提取妃子笑不同組織（根、嫩葉、老葉、雄花、雌花、果皮、果柄）RNA。取1 μL 檢測RNA 質量和濃度，樣品符合要求后利用M-MLV 逆轉錄酶（TaKaRa）反轉錄合成cDNA。利用在線軟件Primer 3.0 設計熒光定量引物，以LcActin為內參（表1），通過Blast 分析引物的特異性，并交由廣州艾基生物技術有限公司合成引物序列。

表1 RT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-PCR used in this study

使用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）試劑盒制備反應體系，其中cDNA 1 μL（相當于25 ng 總RNA），2 μL 基因特異性引物，10 μL 2×SYBR Premix ExTaq，用去RNA 酶的ddH2O 補足20 μL。使用Roche 480 Ⅱ定量PCR 系統（瑞士）進行RT-PCR，反應條件為：94℃預變性2 min，94 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40 個循環。每個樣品3 次重復。采用2-ΔΔct法計算目標基因相對表達量，以根為對照。

2 結果與分析

2.1 荔枝LcALMT 家族成員基本信息及蛋白理化性質、亞細胞定位分析

本研究共鑒定出16個荔枝LcALMTs（LcALMT1～LcALMT16），其基本信息如表2。理化性質分析發現，LcALMTs 蛋白編碼的氨基酸數目在118～803 aa，分子量大小在12.60～89.54 kD，等電點在5.16～9.07 之間，其中堿性蛋白（pI＞7）10 個、酸性蛋白（pI＜7）6 個，不穩定系數介于25.57～45.17，且LcALMT1、LcALMT13、LcALMT14、LcALMT16屬于不穩定蛋白（不穩定系數＞40）。亞細胞定位預測顯示，該家族成員蛋白均定位于質膜上。

表2 荔枝LcALMTs 基本信息及其蛋白理化性質、亞細胞定位分析Table 2 Basic information of LcALMTs in litchi and analysis of its protein physicochemical properties and subcellular localization

2.2 荔枝LcALMTs 系統進化樹及蛋白結構分析

使用MEGA 11 生成荔枝LcALMTs 系統進化樹圖，由圖1 可知，該家族成員可分為5 個亞族。第Ⅰ、Ⅱ、Ⅴ亞族均包含2 個LcALMT 成員，第Ⅳ亞族包含3 個LcALMT 成員，第Ⅲ亞族包含7個LcALMT 成員。荔枝LcALMTs 成員在5 個亞族中分布不均勻，主要在第Ⅲ亞族。從進化樹來看，荔枝ALMT 家族成員與擬南芥的ALMT 家族成員親緣關系更近。

圖1 荔枝、擬南芥和水稻ALMTs 系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of ALMT proteins in Litchi chinesis,Arabidopsis thaliana and Oryza sativa L.

對荔枝LcALMTs 蛋白二級結構進行分析發現，該家族蛋白二級結構包含α-螺旋、延伸鏈、無規則卷曲和β 轉角（表3）。其中α-螺旋占比最高、均大于50%，延伸鏈占比為9.69%～19.50%，無規則卷曲占比為18.64%～57.32%，β 轉角占比為1.94%～7.73%。蛋白質三級結構（圖2）預測顯示，位于同一亞族的LcALMTs 蛋白結構相似，如亞族I 中的LcALMT3 和LcALMT5，亞族Ⅲ中的LcALMT12、LcALMT13 和LcALMT16 均具有相似結構。

圖2 LcALMTs 蛋白三級結構Fig.2 Tertiary structure of LcALMT proteins

表3 LcALMTs 蛋白二級結構Table 3 Secondary structure of LcALMT proteins

2.3 荔枝LcALMTs 基因結構及保守基序分析

運用GSDS 軟件對荔枝ALMT家族成員編碼區、內含子和非編碼區進行結構分析，由圖3 可知，荔枝LcALMTs外顯子數目在3～10 個，其中LcALMT12外顯子數目最多（10 個）；LcALMT1、LcALMT3、LcALMT4、LcALMT5、LcALMT6、LcALMT8和LcALMT15均含有6 個外顯子，LcALMT7、LcALMT10、LcALMT11、LcALMT14基因均不含有非編碼區。

圖3 荔枝 LcALMTs 基因結構Fig.3 Gene structure of LcALMTs in litchi

利用MEME 在線網站分析保守基序，基序數量上限設置為12，其他參數不變，結果（圖4A）顯示，有13 個LcALMTs 蛋白均含有motif 1；除LcALMT11 外，其他蛋白均含有motif 4；LcALMT11 和LcALMT14 僅含有2 個保守基序，分別為motif 11、motif 5 和motif 6、motif 4。由NCBI 網站分析得知荔枝ALMT 家族含有ALMT和ALMT superfamily 兩個結構域，由圖4B 可知，15 個LcALMTs 蛋白均只含有1 個結構域，而LcALMT12 包含上述2 個結構域，其中ALMT superfamily 結構域位于N 端、ALMT 結構域位于C 端。由SMART（http://smart.embl.de/）網站分析可知，motif 1～motif 7 均屬于ALMT 結構域，motif 8～motif 12 未知。

圖4 荔枝LcALMTs 蛋白保守結構域Fig.4 Conservative domains of LcALMT proteins in Litchi

2.4 荔枝LcALMTs 的染色體定位分析

染色體定位分析結果（圖5）表明，LcALMT基因家族只定位在荔枝15 條染色體中的6 條染色體上，其中LcALMT1和LcALMT2定位在Chr3 上，LcALMT3、LcALMT4和LcALMT5定位在Chr10 上，LcALMT6、LcALMT15和LcALMT16分別定位在Chr12、Chr14 和Chr15 上，Chr13 上LcALMT 蛋白分布最多且緊密。

圖5 荔枝LcALMTs 基因染色體定位Fig.5 Chromosomal localization of LcALMT genes in Litchi

2.5 荔枝LcALMTs 啟動子上順式作用元件分析

利用Plantcare 在線網站對LcALMTs基因5′端上游2 000 bp 的序列預測順式作用元件，除去一般性調控轉錄元件（如TATA-box、CAATbox）等未知功能元件外，共發現536 個順式作用元件，其中光響應元件最多、共有219 個（占40.86%），荔枝LcALMTs基因均至少含有5 個光響應元件，如TCT-motiff、G-box、Box4 和AT1-motif 等（圖6）。其次是激素響應元件、共有216 個（占40.30%），主要包括脫落酸響應元件（ABRE）、水楊酸響應元件（TCA-element）、茉莉酸甲酯響應元件、赤霉素響應元件和生長素響應元件。其中LcALMT7含有的茉莉酸甲酯響應元件最多、有94 個。整個LcALMT家族成員中，LcALMT4不含脫落酸響應元件。生長發育元件有30 個（5.60%），主要包括胚乳表達元件、玉米醇溶蛋白代謝調節相關元件、柵欄葉肉細胞分化元件、種子特異性調控元件和參與細胞周期調控元件。非生物脅迫元件有44 個（8.21%），主要包括防御應激響應元件TC-rich repeats、無氧誘導相關元件ARE、低溫響應元件LTR 和誘導子激活元件。其他元件有27 個（5.04%），包括光響應MYB 結合位點、干旱脅迫誘導MYB 結合位點、蛋白結合位點、ATBP-1 結合位點和MYBHv1 結合位點。以上結果表明，荔枝LcALMTs成員可能具有差異化的生物學功能，參與荔枝的光響應、激素響應、生長發育與脅迫響應等相關過程。

圖6 荔枝LcALMTs 啟動子上順式作用元件分析Fig.6 Analysis of cis-regulatory elements on LcALMTs promoter in Litchi

2.6 荔枝LcALMTs 的組織表達

從荔枝基因組數據庫中LcALMT家族成員在不同組織中的表達量（圖7）來看，LcALMT5和LcALMT15在不同組織中都有表達且表達量均較高，其中LcALMT5在雄花中的表達量最高，LcALMT15在假種皮中的表達量最高、是果皮中的16.9 倍。LcALMT10和LcALMT14在荔枝的各組織中均未檢測出表達。LcALMT3只在雄蕊中有表達，且表達量極低。LcALMT4在種子中的表達量最高、是葉中表達量的13.6 倍，在不育雄蕊中未檢測出表達。挑取LcALMT家族成員中表達量較高的3 個基因LcALMT4、LcALMT5和LcALMT15進行熒光定量驗證，分析妃子笑不同組織（根、嫩葉、老葉、雄花、雌花、果皮、果柄）中LcALMTs的表達情況，以根的表達量為1、各基因在各部位下的表達量與其比較進行定量，結果（圖8）顯示，LcALMT4、LcALMT5和LcALMT15在不同組織中均有表達，但存在表達量的差異。LcALMT4、LcALMT5和LcALMT15均在雄花中表達最高、其次為雌花。LcALMT5的表達水平與轉錄組結果較為一致。

圖7 荔枝LcALMTs 基因表達模式分析Fig.7 Expression patterns analysis of LcALMT genes in Litchi

圖8 荔枝LcALMT4/5/15 相對表達水平Fig.8 Relative expression levels of LcALMT4/5/15 in Litchi

3 討論

本研究對荔枝ALMT基因的全基因組進行鑒定與表達分析，對其部分功能進行預測，可為研究荔枝生物學功能奠定一定基礎。ALMT 廣泛存在于植物中，參與植物的生理過程，其功能也相應被探索，如植物耐鋁性［17-19］、礦質營養［20-21］、果實酸度［22-23］、氣孔運動［24-27］、參與種子發育［28-29］等。第1 個植物基因TaALMT1［6］被發現后，越來越多的ALMT 家族成員在不同植物中也相應被研究，但在荔枝中未見到ALMT基因家族的報道。本研究從荔枝基因庫得到ALMT 數據，對其ALMT 家族成員進行鑒定，并系統分析該家族成員的蛋白理化性質、系統發育、基因結構、染色體定位、保守基序、順式作用元件、蛋白結構和表達模式等。

從荔枝基因組中鑒定出16個LcALMTs基因，數量與草莓相同、多于擬南芥（14 個）［9］、少于蘋果ALMT 家族成員［14］。荔枝ALMT 家族成員均定位于質膜上，與蘋果中MdALMT13 在煙草亞細胞定位結果［15］一致，均定位于質膜上。荔枝ALMT家族成員外顯子數目在3～10 個，蘋果中ALMT家族成員外顯子數量為4～12 個［15］，則兩者之間外顯子數量差距較大，這可能是荔枝在進化過程中發生了外顯子的缺失。染色體只定位在荔枝15 條染色體中的6 條染色體上，Chr13 上LcALMTs分布最多且緊密，與蘿卜ALMT家族成員定位在9 條染色體上有差異［18］，具體原因還需進一步探究。荔枝ALMT基因家族成員含有多種順式作用元件，均包含光響應元件，激素響應元件生長發育元件，且光響應元件數量最多，暗示LcALMTs基因的表達可能受光照、激素調節和生長發育條件的影響且受光照影響最大，這與前人在其他物種中的研究結果一致。LcALMT7基因含茉莉酸響應元件最多、達94 個，表明該基因的表達量可能主要受茉莉酸的調控，故不同基因成員之間表達量不同主要與光照、激素調控，與生長發育條件有著巨大關系。該家族成員蛋白結構中α-螺旋占比最高，位于同一亞族的ALMT蛋白一般結構相似。系統進化分析發現，荔枝ALMTs 蛋白可以分為5 個亞族，這與蘿卜ALMT家族分類［30］一致。荔枝ALMT家族成員在不同組織中的表達量不同，LcALMT4主要在種子中表達，與MdALMT13主要在根中高度表達結果［31］一致。采用qRT-PCR 對LcALMT4、LcALMT5、LcALMT15在荔枝不同組織中的表達水平進行檢測，結果表明LcALMT4、LcALMT5、LcALMT15在各組織中均有表達，且在雄花中高度表達，推測LcALMT4、LcALMT5、LcALMT15可能參與雄花的調控，在雄花發育中起作用。綜上，不同物種之間的基因在進化過程中多數存在相同或相似功能，表達量之間的差異不同，與生長環境和激素調節相關聯。

4 結論

利用生物信息學方法從荔枝基因組中鑒定出16 個ALMTs成員，這些成員蛋白均定位于質膜上，染色體定位在荔枝15 條染色體中的6 條染色體上，且在Chr13 上LcALMTs分布最多且緊密。荔枝ALMT基因家族成員啟動子含有多種順式作用元件，光響應元件含量最多；蛋白結構中，α-螺旋占比最高；五個亞族中，位于同一亞族的ALMTs 蛋白一般結構相似。其相對表達量來看LcALMT4、LcALMT5和LcALMT15在不同組織中均有表達，且均在雄花中表達最高，其次為雌花。