苦瓜苗期對高溫脅迫的生理響應及耐熱性初步評價

江 定，李光光，黃劍鋒，鄭巖松

（廣州市農業科學研究院，廣東 廣州 510335）

【研究意義】苦瓜（MomordicacharantiaL.）屬于葫蘆科苦瓜屬一年生攀援草本植物，性喜溫暖濕潤環境，較耐熱不耐寒，最適生長溫度為20～30 ℃［1-4］。廣東處于中國東南沿海低緯地區，據伍紅雨等［5］研究發現，廣東1961—2018 年平均高溫日數（日最高氣溫≥35 ℃）為16.3 d，其中2014 年最多（31.5 d）、1973 年最少（4.6 d），近58 年來高溫日數逐漸增加，上升速率為3.03 d/（10 年）。廣東的盛夏季節經常伴隨著極端和持續高溫等自然災害，嚴重影響農作物的生長和發育，造成農作物減產、減收［6］，其中苦瓜就是經常被高溫危害的一種蔬菜作物。據中國農技推廣信息服務平臺報道［7］，2021 年廣東全年苦瓜種植面積在2.7 萬hm2以上，是廣東瓜類蔬菜重要的經濟作物，具有重要的產業地位。而高溫脅迫已成為影響苦瓜夏秋季節正常生長的主要因素，不僅使植株停止生長，甚至引起植株死亡。因此，認識和了解苦瓜高溫脅迫生理響應情況，有助于采取措施提高苦瓜的抗逆性，同時合理評價苦瓜耐熱種質資源，對種質創新及篩選耐熱新品種具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】目前，我國已有研究從農藝性狀、生理特性等方面開展了苦瓜耐熱性的鑒定及評價指標的篩選等。在苦瓜農藝性狀研究方面，通過調查夏季高溫環境下苦瓜植株田間表現，篩選出與苦瓜耐熱性相關的農藝性狀指標。鄭巖松等［8］研究表明，苦瓜的耐熱性與初花期、開花天數、果肉橫徑、果肉厚和總產量等性狀指標呈正相關；李家明等［9］研究篩選出苦瓜單瓜重、葉柄長、瓜瘤密度、植株分枝性、葉長、主蔓直徑、葉寬、瓜色、種子顏色、種子花紋和瓜肉厚等11 個耐熱性鑒定指標；曾晶等［10］研究發現，產量、商品果數和單果重的變化率可作為苦瓜成株期耐熱性強弱的鑒定指標。在苦瓜生理特性研究方面，郭培國等［2］研究表明，電解質滲透率、丙二醛含量、葉綠素含量、葉綠素熒光參數等與耐熱性相關的生理指標可用于苦瓜耐熱性評價；陳中釤等［11］研究篩選出超氧化物歧化酶（SOD）活性、葉綠素（Chl）含量、丙二醛（MDA）含量、相對電導率（REC）、過氧化氫（H2O2）含量和最大光化學效率（Fv/Fm）等6 個顯著影響苦瓜苗期耐熱性評價的單項指標。在各類農作物中，眾多研究人員通過研究作物苗期來進行耐熱性鑒定［12-14］，并且主要檢測的生理指標大多數為相對電導率（REC）、丙二醛（MDA）含量、脯氨酸（Pro）含量、過氧化氫酶（POD）活性、超氧化物歧化酶（SOD）活性和過氧化氫酶（CAT）活性等，獲得了不錯的鑒定結果?？偟膩碚f，對比其他農作物，苦瓜耐熱性方面的研究相對較少、較薄弱?！颈狙芯壳腥朦c】在苦瓜耐熱性方面研究中，利用測定REC、MDA 和Pro含量以及POD、SOD、CAT 活性等生理指標并綜合評價苦瓜耐熱能力的研究并不多。因此，本研究結合前人對苦瓜和其他農作物利用較好的6 個耐熱性評價生理指標進行測定，通過隸屬函數法綜合評價苦瓜材料的耐熱能力?！緮M解決的關鍵問題】本研究以10 份苦瓜自交系和6 份苦瓜雜交種為試驗材料，通過高溫脅迫循環處理，開展不同苦瓜材料間的生理響應情況和耐熱能力分析，以期為后續苦瓜耐熱育種、中間材料的篩選與研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試苦瓜材料：10 份高代自交系，6 份雜種一代品種或組合（表1），均由廣州市農業科學研究院提供（選育）。所有苦瓜材料在2022 年4月6 日用32 孔穴盤種植于廣州市農業科學研究院海珠區總部，后續的檢測試驗在廣州市農業科學研究院重點實驗室完成。

表1 苦瓜材料信息Table 1 Bitter Gourd Materials Information

主要試劑：POD、SOD（NBT 法）、CAT（紫外吸收法）、MDA 和Pro 含量測試盒均購自蘇州科銘生物技術有限公司。

主要儀器：實驗室電導率儀FE30，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；萬能粉碎機TAISITE，天津市泰斯特儀器有限公司；紫外可見分光光度計UV-2450，日本島津有限公司；微量電子天平Quintix35-1CN，德國賽多利斯天平，規格為30 g/0.01mg；高速冷凍離心機Sigma3-18k，德國西格瑪實驗室離心機公司；電熱恒溫水槽DK-8D 型，上海益恒實驗儀器有限公司。

1.2 高溫脅迫下苦瓜苗期生理指標測定

將長勢均勻、3 葉1 心期的16 份苦瓜材料幼苗各分成2 小份，一份（每份苦瓜材料16 株）移至光照培養箱，進行高溫脅迫循環處理，設置白天40 ℃/12h、夜間25 ℃/12h，相對濕度75%，光照強度10 000 Lx；另一份（每份苦瓜材料16 株）置于常溫條件下（25 ℃）作對照。高溫脅迫循環處理3 d 后，分別取16 份苦瓜材料苦瓜葉片共32個樣品，測定REC、MDA 含量、Pro 含量、POD活性、SOD 活性和CAT 活性等生理指標，探索高溫脅迫下不同苦瓜材料的生理響應。

1.2.1 REC 在苦瓜幼苗經高溫脅迫循環處理3 d后，分別采集常溫和高溫處理下苦瓜葉片，每份苦瓜材料采4 株，每株采2 片完全展開葉共8 片，合計32 個樣品。將葉片在純凈水中洗凈并擦干，采用1.2 cm 的打孔器提取16 個葉片圓片，放進50 mL 試管中，加入30 mL 純凈水，常溫下大力搖晃，然后靜置10 h，測量浸提液電導率（R1）；之后置于100 ℃水浴煮沸30 min 后取出，待溫度降至常溫后測量浸提液電導率（R2）。重復測定3 次，取平均值。

REC（%）=R1/R2×100

1.2.2 MDA 和Pro 含量 在苦瓜幼苗經高溫脅迫循環處理3 d 后，分別采集常溫和高溫處理下苦瓜葉片，每份苦瓜材料采4 株每株2 片完全展開葉共8 片，合計32 個樣品。將葉片在純凈水中洗凈并擦干，使用MDA 和Pro 含量測試盒，按照試劑盒說明書進行測定。

1.2.3 抗氧化酶活性 在苦瓜幼苗經高溫脅迫循環處理3 d 后，分別采集常溫和高溫處理下苦瓜葉片，每份苦瓜材料采4 株每株2 片完全展開葉共8 片，合計32 個樣品。在純凈水中洗凈并擦干，使用測試盒測定POD、SOD 和CAT 活性，具體操作步驟按各試劑盒說明書。

1.3 數據處理

使用Microsoft Excel 2016 軟件、SPSS 20.0 軟件進行數據統計和分析比較。

耐熱系數（Heat-tolerance coefficient，HTC）=處理測量值/對照測量值

采用隸屬函數法分析評價每個材料耐熱性。隸屬函數值計算公式為：

式中，A 為各材料指標的隸屬函數值，且A ∈［0,1］；Hmin、Hmax分別為各參試材料的最小值、最大值；B 為材料的模糊隸屬函數均值，n為指標數。隸屬函數均值B越大，表明耐熱性越強。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫對苦瓜苗期葉片相對電導率的影響

植物葉片REC 可以表征植物細胞膜受損傷的大小，是衡量植物逆境脅迫受害程度的重要生理指標［15］。從16 份苦瓜材料常溫與高溫脅迫的葉片REC 變化來看（表2），在常溫環境生長的各苦瓜材料苗期葉片的REC 相對穩定，說明此時各苦瓜材料的電解質膜內外平衡，細胞膜透性正常運作；在經過高溫脅迫處理3 d 后，各苦瓜材料苗期葉片REC 明顯上升，但各苦瓜材料苗期葉片的REC 變化幅度不同，KG1 增幅最大、為29.34%，KG7 增幅最小、為1.68%，其中增幅顯著的苦瓜材料有KG1、KG2、KG9、KG10、KG11、KG13、KG14、KG15 和KG16。

表2 高溫脅迫與常溫下16 份苦瓜材料的相對電導率、丙二醛含量和脯氨酸含量Table 2 Relative electrical conductivity,malondialdehyde and proline content of 16 bitter gourd materials under high temperature stress and normal temperature

2.2 高溫脅迫對苦瓜苗期葉片丙二醛和脯氨酸含量的影響

MDA 是由于植物衰老或在逆境條件下受傷害，其組織或器官膜脂質發生過氧化反應的產物，MDA 含量變化與植物衰老及逆境傷害有密切關系，是評價質膜損傷程度的重要指標［16］。從表2 可以看出，經過高溫脅迫處理3 d 后，KG1 和KG2 的MDA 含量顯著增加，增幅分別為12.99%和106.15%；其他14 份苦瓜材料的MDA 含量下降，其中KG15 降幅最大、為57.00%，KG9 降幅最小、為4.54%，降幅顯著的苦瓜材料有KG3、KG4、KG5、KG6、KG8、KG10、KG11、KG12、KG13、KG14、KG15 和KG16。

Pro積累是高溫逆境下植物自我保護的手段，能有效束縛蛋白質水分以減少水分流失。一般狀態下植物體內的Pro 含量較低，高溫脅迫下植物通過積累Pro 以提升其抗性［17］。從表2 可以看出，經過高溫脅迫處理3 d 后，有6 份苦瓜材料葉片Pro 含量增加，10 份苦瓜材料下降，KG1增幅最大、為175.83%，增幅顯著的苦瓜材料有KG1、KG2、KG3、KG4 和KG10；KG8 降幅最大、為43.66%，降幅顯著的苦瓜材料有KG6、KG7、KG8、KG9、KG11、KG14、KG15 和KG16。

2.3 高溫脅迫對苗期苦瓜葉片抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT、POD 是植物體內的抗氧化酶，在植物逆境代謝中起著重要的保護作用［18］。從表3 可以看出，經過高溫脅迫處理3 d 后，苦瓜材料KG5 和KG14 的SOD 活性下降，且與對照相比，KG14 顯著下降、為21.95 %；其他14 份苦瓜材料SOD 活性均有不同程度的增加，以KG10增幅最大、為183.85%，KG13 增幅最小、為5.75%，其中增幅顯著的苦瓜材料有KG1、KG2、KG3、KG4、KG6、KG7、KG8、KG9、KG10、KG11、KG12、KG15 和KG16。同樣的，各苦瓜材料的CAT 活性也表現出有增有降的情況，其中KG8、KG10、KG12 和KG16 的CAT 活性顯著增加，其他12 份苦瓜材料CAT 活性均有不同程度的下降，以KG7 降幅最大、為76.48%，KG15 降幅最小、為6.03%；降幅顯著的苦瓜材料有KG1、KG2、KG3、KG4、KG5、KG7、KG9、KG11、KG13 和KG14。POD 活性則表現出16 份苦瓜材料全部顯著增加，以KG11 增幅最大、為419.90%，KG10增幅最小、為13.00%?？傮w來看，苦瓜材料的SOD 和CAT 活性沒有表現出規律的一致增加或者下降，而POD 活性都表現出一致增加，可能是由于POD 對高溫的響應與SOD 和CAT 不同。在SOD 和CAT 活性不足時，植物通過POD 活性增加來彌補對H2O2清除能力的降低。

表3 高溫脅迫與常溫條件下16 份苦瓜材料的抗氧化酶活性Table 3 Antioxidant enzyme activities of 16 bitter gourd materials under high temperature stress and normal temperature

2.4 苦瓜材料的耐熱性初步評價

由各單項指標的耐熱性系數（表4）可知，不同苦瓜材料經高溫脅迫后，其REC、POD 與對照相比均不同程度上升（HTC＞1），而MDA、Pro、SOD 和CAT 在各材料間的耐熱系數表現不一致，有的上升，有的下降。從變異系數可以看出，CAT 變異系數排在第1 位，為0.785；REC的變異系數為0.088，在所有6 項指標中變異系數最小，表明高溫脅迫對苦瓜葉片的CAT 影響較大，對REC 的影響較小。由于同一材料不同單項指標以及同一指標不同材料的耐熱系數變化都不同，難以根據單一指標的耐熱系數判斷材料耐熱性的強弱，因此運用隸屬函數法對16 份苦瓜材料耐高溫評價指標進行初步評價，平均隸屬函數均值越大，表明耐熱性越強，由表5 可知,16 份苦瓜材料的耐熱能力順序依次為KG1＞KG2＞KG16＞KG11＞KG10＞KG3＞KG9＞KG12＞KG15＞KG4＞KG13＞KG8＞KG6＞KG5＞KG7＞KG14，其中KG1 為最耐熱苦瓜材料，KG14 為最不耐熱苦瓜材料。

表4 16 份苦瓜材料的各項指標耐熱系數Table 4 Heat resistance coefficients of various indicators from 16 bitter gourd materials

表5 16 份苦瓜材料的隸屬函數值Table 5 Membership function values of 16 bitter gourd materials

3 討論

高溫脅迫會對苦瓜產業帶來不利影響，尤其是在廣東夏秋季栽培的時候影響更突出。本研究表明各苦瓜材料經高溫處理后各生理指標均發生了顯著變化，對高溫的抵抗性差異明顯。高溫脅迫引起植物細胞受害癥狀反映在多個方面，其中會使細胞質膜發生膜脂過氧化作用，使細胞膜滲透性增加，電解質外滲。MDA 是植物細胞膜脂過氧化產物［19］，REC 和MDA 含量能反映植物體內膜脂過氧化水平，間接反映熱害程度。本研究中高溫處理后各苦瓜材料苗期葉片的REC 上升，但有些材料上升差異不顯著，與郭培國等［2］和陳中釤等［11］的研究結果一致。各苦瓜材料苗期葉片中，有2 份苦瓜材料MDA 含量增加，其他14 份苦瓜材料都減少，與郭培國等［2］研究高溫脅迫對苦瓜葉片MDA 含量影響發現4 份苦瓜材料全部增加的結果不一致，與陳中釤等［11］研究中高溫脅迫對苦瓜苗期葉片MDA 含量有2 份苦瓜材料減少、其他18 份苦瓜材料都增加的結果也不一致，可能是高溫脅迫對不同苦瓜材料產生的MDA 含量應激反應也會不同導致的。

Pro 是植物體內有機滲透調節物質之一，可以調節細胞質的滲透勢保護蛋白質分子，增加蛋白質分子的水合度維持光合活性作為活性氧的清除劑等［20］。本研究中各苦瓜材料Pro 含量在高溫脅迫處理后有升有降，與郭培國等［2］和陳中釤等［11］對苦瓜材料進行高溫脅迫處理后發現其體內Pro 含量全部增加的結果不一致，這可能與苦瓜材料、高溫程度和脅迫時間的差異性有關。而有研究表明，耐熱性較好的植物在高溫脅迫下Pro 含量上升更快，植物體內Pro 積累越多其耐熱性就越強［21-22］，但也有Pro 累積量與品種的耐熱性強弱無關的研究結果［23］，還有研究認為耐熱性弱的植物材料Pro 累積量高于耐熱性強的材料［24］。因此，僅憑Pro 含量的增加或者減少無法判斷耐熱性強弱，只能表明Pro 在高溫逆境下參與苦瓜耐熱性的應激反應進行自我保護，其含量多少與苦瓜苗期耐熱性存在一定相關性。

SOD、CAT 和POD 是植物體內清除活性氧自由基的重要抗氧化保護酶，本研究各苦瓜材料經過高溫脅迫處理后苗期葉片的SOD 和CAT 活性有增加也有下降，POD 活性全部增加，與陳中釤等［11］的研究結果有所不同，可能是由于供試材料與處理方法不同，苦瓜植株對逆境的響應不同造成的，但說明這些抗氧化酶活性與苦瓜的耐高溫脅迫性有一定的相關性，溫度過高苦瓜會改變自身的抗氧化酶活性來清除體內過多的超氧自由基，從而減輕自身受高溫脅迫造成傷害的影響。還有研究表明高溫脅迫后黃瓜葉片SOD 和POD活性增加，CAT 活性下降［25］，或POD 和CAT活性增加，SOD 活性下降［26］，或SOD、POD 和CAT 活性均下降［27］等情況。本研究中3 種抗氧化酶活性的變化與上述研究均不一致。這可能與試驗材料、高溫程度、脅迫時間和提取條件［28］等因素的不同有關，這些生理指標與高溫生理響應的相關性有待進一步深入研究。

總體來看，苦瓜受高溫脅迫后，這6 個生理指標產生了不同變化，說明這6 個生理指標與苦瓜耐熱性存在不同程度的相關性。郭培國等［2］發現REC、MDA 含量、葉綠素含量的變化值和葉綠素熒光參數比值（Fv/Fm）可以考慮作為評價苦瓜耐熱性強弱的生理指標。陳中釤等［11］對苦瓜材料進行高溫脅迫研究，篩選出SOD、Chl、MDA、REC、H2O2和Fv/Fm 等6 個顯著影響苦瓜苗期耐熱性評價的單項指標。而從本研究結果來看，苦瓜的耐熱生理響應機制受多種因素影響，單一指標不足以判定苦瓜對逆境的適應能力。通過對耐熱性評價常用的6 個生理指標REC、MDA、Pro、SOD、CAT 和POD 進行測定，使用隸屬函數法綜合這6 個抗性相關指標進行苦瓜耐熱性初步評價，為苦瓜苗期耐熱性鑒定和評價提供了理論依據，但在苦瓜耐熱評價過程中仍需要綜合考慮材料的差異性、植株結果時期田間農藝性狀、產量性狀等其他指標的影響，以提高綜合評價的準確性。

耐熱性評價在農作物新品種選育方面的研究利用有著廣闊的應用前景，但需要深入研究與完善。陳中釤等［11］對苦瓜苗期耐熱性生理指標進行測定，綜合評價篩選出5 個強耐熱類型苦瓜自交系，可作為耐熱苦瓜新品種選配的親本材料。姚金曉等［29］對12 份冬瓜材料測定相關的熱害指數、形態學指標、生理生化指標，綜合評價篩選到強耐熱品種夏冠1 號和玲瓏節瓜。田守波等［30］對23 份瓠瓜材料生理生化指標進行測定，綜合評價篩選到9 份耐熱性強的瓠瓜材料。萬正林等［31］對4 份南方厚皮甜瓜品種耐熱性進行比較，通過測定甜瓜苗期葉片中抗氧化酶（SOD、CAT、POD）活性、MDA 含量與葉綠素含量等，綜合評價篩選出最耐熱的甜瓜品種桂蜜12 號。因此，充分利用耐熱性評價方法，有助于作物種質資源的鑒評與新品種選育。

4 結論

本研究結果表明，16 份苗期苦瓜材料的REC在高溫脅迫與常溫條件下相比全部增加，其中增幅顯著的苦瓜材料有9 份；MDA 含量有2 份苦瓜材料顯著增加，12 份苦瓜材料顯著下降；Pro 含量有5 份苦瓜材料顯著增加，而有8 份苦瓜材料顯著下降。對于抗氧化酶活性結果來說，在高溫脅迫與常溫條件下相比較，SOD 活性有1 份苦瓜材料顯著下降，而有13 份苦瓜材料顯著增加；CAT 活性有4 份苦瓜材料顯著增加，而有10 份苦瓜材料顯著下降；而POD 活性則是16 份苦瓜材料全部顯著增加。本研究篩選出耐熱能力排在前5 名的苦瓜材料（KG1、KG2、KG16、KG11 和KG10）具有潛在的應用價值，可在后續苦瓜耐熱育種中加以利用，其中KG1、KG2 和KG10 等3個耐熱性較強的苦瓜自交系，可作為耐熱苦瓜新品種試配的親本材料；KG11 和KG16 為耐熱性較強的雜種一代，可進一步田間驗證結果時期耐熱性強弱的真實性，以便后續進行該雜種一代新品種的推廣應用。