理化實驗室能力驗證的關鍵技術控制要素實踐與應用

丁丹婷,朱怡平,溫憶敏,熊麗蓓

(上海市疾病預防控制中心化學品毒性檢定所,上海 200336)

能力驗證是由具有相關資質的機構組織實施,利用實驗室間比對,按照預先定制的準則評價參加者的能力[1]。理化實驗室參加能力驗證是一項重要的質量控制工作。能力驗證可用于評定實驗室從事特定檢測或測量的能力、監視實驗室的持續能力、識別實驗室間的差異以及發現實驗室存在的問題等[2]。通常情況下,能力驗證結果對實驗室相當重要,直接關系到資質認定、能力維持等相關利益。所以,參與能力驗證的分析人員需盡可能從能力驗證的要求、檢測方法學、具體樣品特殊性、結合日常實驗經驗等方面落實各個檢測環節技術要求和質量控制要求。目前各實驗室在各類能力驗證中,除在思想上較為重視外,一般僅將其作為檢測工作予以實施,缺乏對能力驗證的關鍵因素進行預測性研究、準備以及主動控制的措施,因而容易使檢測結果出現偏差[3]。通過總結多年參加能力驗證的數據及經驗積累,本工作提出了能力驗證的“四步法”流程并對關鍵技術控制要素等方面進行探討,可為理化實驗室參與能力驗證工作提供參考、拓寬工作思路。

1 能力驗證“四步法”的流程與實施技巧

本工作將實驗室開展能力驗證工作的流程劃分為四步,分別為“檢測方法關鍵要素確認”“取樣方案制定與初測”“檢測方案確定與測定”和“數據整理與報告”。

1.1 檢測方法關鍵要素確認

參加能力驗證的人員(以下均簡稱“人員”)開展能力驗證項目的檢測方法關鍵要素確認是整個能力驗證工作中的重要準備工作。根據能力驗證項目的要求,首先核實項目檢測所需要使用的方法,聚焦方法的關鍵實施技術操作重點[4],如方法原理、提取液酸度控制要求、關鍵試劑、前處理耗材規格要求及其操作細節、標準曲線的類型及其范圍、定量方式等。必要時還需進一步了解項目的限值情況,以利于在檢測中對細節進行合理化調整。最后,在明確本次驗證中需要注意的關鍵操作控制節點后,重點圍繞標準溶液的準確度(包括溯源的符合性、不同源結果的比對、空白基質的確定、必要實物質控樣準備等)、過程控制(包括試劑空白檢測、全流程空白檢測、同類基質樣品的回收率測試或實物質控樣測試等),開展以操作熟練度和基本控制要求為目的的模擬檢測。在評估上述試驗結果指標均達到滿意預期后,方可開展下一步工作,否則應查找原因并待問題解決后才能開展下一步工作,以確保試驗方法的可行性以及實驗室當前的各項試驗條件均準備妥當。

確認檢測方法關鍵要素不僅能進一步檢驗該方法是否適用于能力驗證樣品的檢測,而且可以幫助實驗室自查當前的各項試驗條件是否處于該項目檢測的理想狀態。

1.2 取樣方案制定與初測

在開啟能力驗證樣品之前,應根據該樣品性狀、數量、目標化合物的物理化學性質、儲存要求等制定取樣方案與保存方案,要兼顧保證樣品的均勻性、穩定性和不受污染等,確保目標化合物的量值能在檢測周期內穩定。取樣方案應包括每次測定的樣品用量、分裝的必要性、分裝容器潔凈度及其耐受性、取樣或分樣后的保存條件等。一般情況下,由于能力驗證樣品的數量有限,取樣量不能簡單按日常檢測方法或作業指導書中的規定值來操作,而需根據能力驗證樣品說明書、樣品中目標化合物含量或者整體的試驗計劃合理安排取樣量。對于一些不穩定或易變質的樣品,應考慮在首次取樣時,同步將樣品均勻化,按每次測定需要量進行分裝,選擇合適的分裝容器,必要時應進行容器的本底測定,避免容器對樣品產生污染。啟封后的樣品或經處理后的測試樣品也需要采取必要的措施保證樣品的保存符合穩定性要求,如動植物源性食品一般采用冷凍方式,而一般包裝食品采用室溫保存等。在進行初測時,應根據能力驗證要求的取樣量開展檢測,同時按照“檢測方法關鍵要素確認”環節的各試驗內容開展檢測,重點聚焦在標準曲線、過程空白、一個濃度水平添加的回收試驗等,一方面與預期的結果進行比對評估,以確?，F有方法的熟練、穩定、可重復,另一方面可獲得基本接近的驗證結果,為樣品正式測定的試驗方案的制定提供指向性的依據[5]。同時對于禁用物質,應充分考慮儀器靈敏度與加標樣品檢出限的符合情況。

1.3 檢測方案確定與測定

根據能力驗證樣品的初步測定情況,在對檢測技術方案進行必要的細化與調整的基礎上,確定正式檢測方案。相關內容可能涉及取樣量調整、稀釋倍數設定[6]、標準曲線檢測范圍精細化調整、加標濃度水平設置、測定重復次數設定等,如標準曲線檢測范圍應保持在原方法規定濃度水平的范圍內,樣品進樣濃度水平應位于調整后標準曲線檢測范圍的40%～70%內,同時還應兼顧回收試驗加標量與標準曲線檢測范圍關系;標準溶液系列配制過程中,避免因系統誤差而發生準確度問題,如標準曲線各點來源于不同濃度水平的前級溶液,需注意稀釋比例不合適、配制器具不合適等問題;針對樣品含量,是否需要調整內標的添加量,以確保測定濃度水平與內標含量比例的合理性;根據樣品初測結果,確定檢測準確度評估的加標濃度水平或實物質控樣的適宜性及相關技術要求等;適當考慮能力驗證申報時限對整體檢測方案的限制以及是否安排其他檢測方法對該樣品進行檢測結果的比對。在明確最終的驗證方案后,檢測人員應實施標準曲線配制與測定、試劑空白(過程空白或空白基質)測定、空白基質加標回收測試或實物質控樣測試、不少于3個能力驗證樣品的測試、能力驗證樣品加標回收測試等檢測工作,必要時可以考慮人員比對、標準曲線的溯源質控等其他內容。其中空白基質加標回收測試是為了證明檢測過程與前期工作質量的一致性,而能力驗證樣品加標回收測試是為了證明其與空白基質加標回收測試結果的一致性;測定樣品數不少于3個,以應對檢測過程中可能存在的失敗或異常情況。一般而言,受檢測時間和取樣量的限制,此次測試的結果應為本次能力驗證的最終結果,原則上不應有結果異常問題的發生。因此,在實施這次正式檢測之前,務必慎之又慎,確保各環節指標均達到要求,否則應重復前兩步操作直到達到要求。如條件允許,可采用其他輔助方法,如電感耦合等離子體質譜法(ICPMS)對原子吸收光譜法結果進行驗證和補充等。

1.4 數據整理與報告

完成所有測試工作后,人員應對所有測試過程的數據等進行匯總分析,聚焦檢測操作過程中存在的標準偏離及其對結果可能產生的影響、標準溶液系列配制中的誤差問題、不同檢測范圍標準曲線的線性重復性與溯源符合性、不同加標量下回收試驗的穩定性、初測與正式測定的結果可比性、正式測定的平行數據偏差符合性、能力驗證樣品加標回收測試結果與空白基質加標回收測試結果的可比性、其他輔助方法的匹配度、禁用物質項目的靈敏度達標性等進行充分考慮,如對于內標回收率問題的統籌考慮,若內標的絕對回收率很低,無論目標化合物的回收率是否理想,都說明在試驗前處理過程中損耗過大,存在數據偏差的可能。在此基礎上依據機構對檢測記錄的相關要求,完成試驗報告的編制,經能力驗證小組審核通過后,方可出具正式檢測結果。

綜上,能力驗證的檢測工作已全部完成,但分析人員可根據在能力驗證工作中發現的新問題和新情況做更深入的技術探究,以完善現有的實驗室檢測方法。實驗室也可將能力驗證的數據材料收集起來,以備今后為類似項目的能力驗證工作提供參考。

2 能力驗證的關鍵技術控制要素

能力驗證工作可評定實驗室從事特定檢測項目的能力,同時也在一定程度上體現了一個實驗室的質量控制能力。為得到滿意的能力驗證結果,實驗室可以通過各種關鍵技術要素的把控將試驗數據控制在可靠范圍內。以下將具體探討各項關鍵技術控制要素。

2.1 計量溯源性工作保證

計量溯源性是通過文件規定的不間斷的校準鏈,將測量結果與參照對象聯系起來的特征[7],是測量結果相互承認的前提條件,包括標準物質溯源、實物質控樣溯源、測量儀器溯源等。標準物質和實物質控樣應盡量選擇經過國家有關部門或國際機構給予準確定值、符合定值溯源要求的標準物質,最好能與能力驗證任務所用標準品的來源機構相一致。檢測過程中所使用的稱量工具、定容容器、取樣器、測定儀器等均會引入測量不確定度,應經過具備相關資質的機構檢定或校準且符合技術要求方可使用。因此,在實驗室檢測中,計量溯源性工作是保證檢驗結果準確度的必要條件[8]。

2.2 能力驗證樣品的接收控制

實驗室在接收能力驗證樣品時,應仔細核對樣品名稱、數量、檢驗項目、檢驗依據、能力驗證說明書、提交日期、樣品保存條件、樣品狀態等。若在核對過程中發現問題,如冷鏈運輸的樣品在送到實驗室后發現樣品融化且處于常溫狀態時,應及時與能力驗證組織方進行溝通確認其是否具備可實施性,若該狀態下的樣品已無可實施性則應重新寄樣。

2.3 開展能力驗證試驗的準備工作

收到能力驗證樣品后,分析人員應仔細研讀能力驗證說明書,特別要明確此次能力驗證的要求,如檢測依據、樣品數量、需報送的平行樣個數、加標回收率個數、數據的單位、數據的有效位數、報送方式、截止日期等。制定由粗到細的驗證方案,如魚肉中硝基呋喃類藥物殘留量測定的能力驗證中,根據魚肉中硝基呋喃類藥物殘留量測定的能力驗證參試指導書(項目編號CNCA-22-04),按規定將魚肉凍干粉樣品以4倍蒸餾水復原,如取樣量為0.4 g則與國家標準GB/T 21311－2007(7.1.1)中規定的魚肉取樣量2 g左右的要求相一致[9];而規定“所選方法前處理過程中如有洗滌步驟,則跳過洗滌步驟,直接進行衍生”,又與GB/T 21311－2007(7.1.1)的要求不一致;本次能力驗證樣品只有2 g魚肉凍干粉,按規定最多能開展4次檢測,考慮到所有試驗的樣品用量,在初測和樣品加標試驗中均只用了0.2 g,同步縮小了進樣溶液的定容體積,確保了正式測定中有3次全量和最終0.4 g的備用量。

2.4 樣品編碼傳遞準確性保證

實驗室應對樣品編碼傳遞有相應的規定,特別是對于多樣品的能力驗證項目。樣品的原始編號和實驗中產生的子編碼需一一對應,并妥善記錄不能弄錯,以防因編碼傳遞的過失而產生最終數據結果的錯誤。

2.5 檢測過程中的準確度保證

在各驗證環節中,關注可能影響檢測準確度的因素,如試劑空白、全流程空白、同類基質空白樣品等測試與評價,既是對品質的控制,也是對實驗過程的環境符合性控制,同時開展在溯源性、測量等準確度方面的保證性工作。

在溯源性準確度控制方面,可采用在一定的環節加入必要的人員比對[10]、溯源性比對等手段,確保準確度。如在項目編號CNCA-22-04驗證中,檢測人員A 做全流程測試,配制標準曲線檢測范圍為1.0～25μg·L－1的標準溶液系列,檢測人員B從稱取標準物質開始獨立配制10μg·L－1的標準溶液進行比對測試。當兩名檢測人員的測定結果的標準偏差小于5%時,則認定檢測人員A 在標準溶液系列配制方面沒有明顯失誤。在魚粉中總汞及甲基汞(項目編號CNCA-21-02)的檢測能力驗證中,分別使用1 000,100 mg·L－1汞單元素溶液標準物質[GBW 08617和GBW(E)08124]作為第二源標準物質配制(1.00±0.008)μg·L－1標準溶液,測定結果分別為0.995μg·L－1和0.999μg·L－1,由此可證明第一源標準曲線無較大偏差。

在測定準確度控制方面,可以采用實物質控樣或加標回收方式進行,其中實物質控樣應盡可能選擇:①與能力驗證樣品同基質的樣品;②所含目標化合物濃度水平與能力驗證樣品相近的樣品[11];③不確定度符合能力驗證要求的實物質控樣。在加標回收方式中,需注意以下幾點:①為保證基體性質穩定,加標溶液的體積不應超過樣品體積的5%[12];②加標溶液應在樣品基質中充分混勻分散,不應出現互不相溶的現象導致回收率的差異;③加標水平應與能力驗證樣品的濃度水平接近或在標準曲線中間濃度水平范圍內[13];④如使用內標,則其峰面積應盡可能接近樣品中目標化合物的峰面積。在魚肉中3-氨基-2-口惡唑酮項目(項目編號CNCA-22-04)驗證中,按GB/T 21311－2007 方法規定使用內標3-氨基-2-口惡唑酮-d4,用量為0.01 mg·L－1×100μL,初測得到目標化合物峰面積為內標的10 倍,因此將內標加入量調整至0.1 mg·L－1×100μL,此時內標峰面積與樣品中目標化合物的峰面積基本相當,達1×105左右的同一數量級。

2.6 避免系統誤差的產生

系統誤差對準確度的影響往往容易忽視,如天平的選擇一般與稱量物的精度要求、結果數據的有效位數等相關[14]。在配制標準溶液系列過程中,除器具應檢定合格外,在進行超過100倍以上稀釋時,為避免系統誤差影響,應分步稀釋;標準曲線檢測范圍在日常檢測時應適當縮小,切不可隨意變更,同時兼顧能力驗證樣品中目標化合物的濃度水平,如在項目編號CNCA-22-04能力驗證中,GB/T 21311－2007方法中建議標準曲線的各點濃度水平分別為1,5,10,50,100μg·L－1,經初測最終將各點的濃度水平調整為1.0,2.5,5.0,10,15,20,25μg·L－1,兩個能力驗證樣品的目標化合物質量濃度分別為6,14μg·L－1,分布在標準曲線檢測范圍的中間;在實際能力驗證中,應盡量將標準曲線檢測范圍最高點和最低點的濃度水平控制在100倍內,避免濃度水平較低點對標準曲線的貢獻太小,在擬合標準曲線過程中引入誤差而造成最終的數據偏差。

2.7 數據提交注意事項

能力驗證樣品的數據提交需按照說明書上的要求,在規定的時限內提交檢測結果報告單、原始記錄、原始圖譜、相關附件材料等。在網上申報結果的過程中,填報人員一定要仔細核對數據的準確性,包括小數點位數、結果單位、化合物名稱與數據的對應性等,必要時應同時安排審核人員現場核對,避免填報錯誤導致能力驗證不通過。

3 結論

能力驗證既是對理化實驗室檢測能力的考核,也是實驗室質量控制水平的體現。能力驗證“四步法”的提出是本實驗室基于多年的工作經驗,吸取了各種失敗教訓后總結而得。它是從理化實驗室質量管理的角度指導檢測人員如何開展能力驗證工作,其中不僅包含了各階段的實施技巧和策略,更重要的是引導檢測人員如何應用各項關鍵技術控制要素提高檢測數據的準確度和可靠性。建議理化實驗室針對能力驗證工作制定符合自身實驗室情況的工作規范,用有效的質量控制手段宏觀把控數據的質量。此外,能力驗證工作有別于日常檢測,檢測人員只有提高思想意識,認真嚴謹對待,從檢測方法的原理、操作步驟的關鍵控制要素等深層次地學習和理解,規范操作,才能真正做好這項工作。