超高效液相色譜-串聯質譜法測定葵花籽中4種交鏈孢霉毒素的含量

畢 珊,吳玉田,楊紹群,劉貴榮,王穎怡,趙正雨

(貴州省疾病預防控制中心,貴陽 550004)

交鏈孢霉又稱鏈格孢霉菌,普遍分布于自然界中,是一種極為常見的腐生菌和植物病原菌[1-2],其產生的毒素種類達70 余種,主要包括交鏈孢酚(AOH)、交鏈孢酚單甲醚(AME)、細交鏈孢菌酮酸(TeA)和騰毒素(TEN)[3-4]。交鏈孢霉毒素對人體具有一定的致癌、致畸等慢性或急性毒性作用,如果多種交鏈孢霉毒素同時存在可產生協同作用,導致毒性增強[5-6]?？ㄗ咽莻涫軞g迎的大眾休閑食品,亦可作為食用油原料?？ㄗ言趦Σ剡^程中會出現發熱、發霉、變質等現象,易受到交鏈孢霉毒素的污染,其營養價值大大降低甚至會對人體造成傷害。因此,監測葵花籽中交鏈孢霉毒素的含量具有重要意義。

近年來,國內外已有較多關于食品中交鏈孢霉毒素檢測技術方面的文獻報道[7-13],其中高效液相色譜-串聯質譜法由于具有靈敏度高、定性準確、重現性好的特點,已經成為主流方法,但我國尚未建立食品中交鏈孢霉毒素的限量標準,同時也鮮有關于測定葵花籽中交鏈孢霉毒素含量的報道。本工作針對葵花籽基質樣品,提出了超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)測定葵花籽中交鏈孢霉毒素含量的方法,并用于實際樣品檢測,以期了解葵花籽中交鏈孢霉毒素污染狀況,同時為葵花籽中交鏈孢霉毒素標準方法的研究開發提供基礎依據。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

SCIEX QTRAP 6500＋型超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀;MPW-352R 型高速冷凍離心機;TTC-DC11型氮吹儀;Milli-Q 型超純水機;Waters Oasis HLB固相萃取柱。

單標準溶液:100.0 mg·L－1,準確稱取1.0 mg AOH、AME、TeA、TEN 標準品,用甲醇溶解、稀釋,轉移至10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成質量濃度均為100.0 mg·L－1的單標準溶液。同法制備交鏈孢酚-d2(AOH-d2)、交鏈孢酚單甲醚-d3(AME-d3)、細交鏈孢菌酮酸-d13(TeA-d13)、滕毒素-d3(TEN-d3)的單內標溶液。

混合標準溶液:移取適量的單標準溶液,用甲醇逐級稀釋,配制成AME質量濃度為10.0μg·L－1、TEN 和AOH 質量濃度為100.0μg·L－1、TeA 質量濃度為500.0μg·L－1的混合標準溶液。

混合內標溶液:移取適量的單內標溶液,用甲醇逐級稀釋,配制成AME-d3質量濃度為100.0μg·L－1、TEN-d3和 AOH-d2的質量濃度為1 000.0μg·L－1、TeA-d13的質量濃度為5 000.0μg·L－1的混合內標溶液。

標準品:AOH,10 mg/瓶;AME,10 mg/瓶;TeA,10 mg/瓶;TEN,1 mg/瓶;AOH-d2,1 mg/瓶;AME-d3,1 mg/瓶;TeA-d13,1 mg/瓶;TEN-d3,0.25 mg/瓶。

乙腈、甲醇均為色譜純;其他試劑均為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7μm);柱溫40 ℃;進樣體積3.0 μL;流量0.2 mL·min－1;流動相A 為1.0 mmol·L－1碳酸氫銨溶液,B 為甲醇。梯度洗脫程序:0～2.0 min時,B為5%;2.0～4.0 min時,B由5%升至90%,保持2.0 min;6.0～6.5 min時,B由90%降至5%,保持3.5 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,負離子(ESI－)掃描模式;噴霧電壓4 500 V;離子源溫度500 ℃;霧化氣1壓力0.4 MPa,霧化氣2 壓力0.4 MPa,氣簾氣壓力0.2 MPa,碰撞氣壓力0.1 MPa;多反應監測(MRM)模式。其他質譜參數見表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

用高速粉碎機粉碎葵花籽樣品,取2.5 g,置于50 mL聚丙烯刻度離心管中,加入500.0μL混合內標溶液,混勻,放置過夜,加入25.0 mL 體積比為45∶10∶45的乙腈-甲醇-0.05 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0)混合液,以轉速2 500 r·min－1振蕩提取10 min,以轉速10 000 r·min－1離心10 min,轉移上清液,并用水定容至30.0 mL,搖勻。取6.0 mL提取液,加入15.0 mL 0.05 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液(pH 3.0),搖勻,過Waters Oasis HLB固相萃取柱(預先用5.0 mL甲醇和5.0 mL水活化),用20%(體積分數)甲醇溶液淋洗,抽干固相萃取柱,用10 mL體積比為1∶1的含1%(體積分數,下同)氨水的甲醇-乙腈混合液進行洗脫,收集洗脫液,在水浴40 ℃下氮吹至近干,殘渣用200.0μL甲醇復溶,并用水定容至2.0 mL,渦旋后按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

4種交鏈孢霉毒素混合標準溶液和實際葵花籽樣品的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms

2.2 固相萃取柱的選擇

Waters Oasis HLB固相萃取柱是一種適用于酸性、中性和堿性化合物的通用性凈化小柱,其良好的化學穩定性、高而穩定的回收率備受研究者的青睞。為驗證Waters Oasis HLB固相萃取柱在葵花籽基質凈化中的應用優勢,采用空白基質加標的方式,在相同加標量(AME 的質量分數為2.0μg·kg－1,AOH 和TEN 的質量分數為20.0μg·kg－1,TeA 的質量分數為100.0μg·kg－1)條件下制備6個平行樣,將Waters Oasis HLB柱(簡稱HLB柱)與實驗室常用的Hypersep Retain PEP柱(簡稱PEP柱)、Hypersep C18柱(簡稱C18柱)的凈化效果進行對比(除不加混合內標溶液外,樣品提取與凈化同1.3節)。

3種固相萃取柱凈化下葵花籽基質樣品中4種交鏈孢霉毒素的回收率結果見圖2。

圖2 3種固相萃取柱凈化下目標物的回收率Fig.2 Recovery of targets purified by three solid phase extraction columns

由圖2可知:固相萃取柱凈化下葵花籽基質樣品中4種交鏈孢霉毒素的回收率為46.3%～114%,HLB柱對葵花籽基質樣品中目標物的回收率最好,其次是PEP柱、C18柱。原因在于HLB柱的吸附劑是水脂平衡的水可浸潤的反相吸附劑,由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物,其吸附容量較高,吸附性較強,與C18柱鍵合了硅膠相比,吸附劑的表面積增大2～3倍,凈化效果較好;PEP 柱采用高純度、高滲透率的苯乙烯二乙烯基聚合物,鍵合脲功能團使它對極性和非極性分析物均有保留,其表面同時具有親水性和憎水性基團,吸附能力也遠高于C18柱,4種毒素在PEP柱上仍有較好的回收率;C18柱鍵合硅膠,適用于高保留性烷基鍵合相化合物,吸附能力弱,對含油脂的葵花籽基質中目標物的保留能力較差,且雜質干擾較大,不建議在含油性基質的凈化過程中使用。因此,試驗選擇Waters Oasis HLB固相萃取柱為凈化柱。

2.3 洗脫劑的選擇

保證其他條件不變,試驗考察了不同洗脫劑(5.0 mL甲醇＋5.0 mL乙腈、10 mL體積比為1∶1的含1%氨水的甲醇-乙腈混合液)的洗脫效果。結果顯示:使用兩種洗脫劑時,目標物的回收率無太大差別,但洗脫劑中有氨水時目標物峰形更為尖銳、信號更強,同時基線也更平滑。因此,試驗選擇10 mL體積比為1∶1的含1%氨水的甲醇-乙腈混合液作為洗脫劑。

2.4 標準曲線和測定下限

取混合標準溶液0,20,50,100,200,400,800,1 000μL置于不同的10 mL容量瓶中,均加入適量的混合內標溶液,依次加入甲醇500,480,450,400,300,100,0,0μL,用水定容,配制成AME 的質量濃度分別為0,0.02,0.05,0.10,0.20,0.40,0.80,1.00μg·L－1,TEN 和AOH 的質量濃度分別為0,0.20,0.50,1.00,2.00,4.00,8.00,10.0μg·L－1,TeA 的質量濃度分別為0,1.00,2.50,5.00,10.0,20.0,40.0,50.0μg·L－1的混合標準溶液系列,其中同位素內標TeA-d13的質量濃度均為25.0μg·L－1,AOH-d2和 TEN-d3的質量濃度均為5.00μg·L－1,AME-d3的質量濃度均為0.50μg·L－1。按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以目標物的質量濃度為橫坐標,以峰面積與各自內標峰面積的比值為縱坐標,繪制標準曲線。所得線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表2。

表2 線性參數和測定下限Tab.2 Linearity parameters and lower limits of determination

以10倍信噪比(S/N)計算測定下限(10S/N),結果見表2。

2.5 精密度試驗

隨機選取3份陽性樣品,每份樣品制備7組平行樣,按照試驗方法測定,計算測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。

表3 精密度試驗結果(n＝7)Tab.3 Results of test for precision(n＝7)

由表3 可知,各目標物測定值的RSD 為3.9%～12%,表明方法重現性良好,該檢測方法的建立具有實際可操作性。

2.6 回收試驗

對空白葵花籽樣品進行低、中、高等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平同時設計6組平行試驗,按照試驗方法進行測定,計算回收率和測定值的RSD,結果見表4。

表4 回收試驗結果(n＝6)Tab.4 Results of test for recovery(n＝6)

由表4可知,目標物的回收率為75.0%～112%,測定值的RSD 為4.3%～12%,說明該方法的準確度良好,并進一步驗證了方法的精密度良好。

2.7 樣品分析

隨機抽取市售散裝、袋裝葵花籽樣品19份,按照試驗方法測定4種交鏈孢霉毒素的含量,測定結果見表5。

表5 樣品分析結果Tab.5 Analytical results of the samples

由表5可知:AOH、AME、TeA 和TEN 檢出率分別為36.8%,52.6%,89.5%,84.2%。檢出率和檢出量最高的是TeA,平均值為1 890.16μg·kg－1,主要源于葵花籽在加工、運輸和儲藏期間發生霉變;TEN 的檢出率次之,平均值為20.26μg·kg－1?？梢?葵花籽中4種交鏈孢霉毒素均有不同程度檢出,其中受TeA 毒素污染的風險最大,其次是TEN。

本工作提出了UHPLC-MS/MS測定葵花籽中交鏈孢霉毒素含量的方法,同時對3種常見的固相萃取柱進行了對比,對洗脫劑進行了考察,采用內標法定量,提高了定量結果的準確度。本方法具有操作簡便、準確度好、靈敏度高等特點,適用于葵花籽中4種交鏈孢霉毒素含量的測定。對實際樣品檢測時發現,葵花籽中4種交鏈孢霉毒素的暴露水平高,污染情況嚴重,其中,TeA 和TEN 檢出率高,且以TeA 污染情況最為嚴重。若經常食用受毒素污染的葵花籽或葵花籽油會對人體健康造成一定影響,相關部門應加強對交鏈孢霉毒素污染水平的監測與調查,保障人民的身體健康,同時為制定國家標準提供相關基礎數據。