超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法篩查尿液中150種藥物與毒物

滕小梅 ,汪 蓉 ,倪春芳 ,梁 晨 ,張玉榮*

(1.青島海洋生物醫藥研究院,青島 266071;2.上海市公安局物證鑒定中心 上海市現場物證重點實驗室,上海 200083)

我國吸毒的人數仍處于高位,濫用藥物與新型毒品的品種數量持續增長,禁毒工作面臨著嚴峻的形勢[1-2]。涉毒案件時有發生,毒物品種廣泛,具體案件分析目標物不明確,給案件偵破造成很大的困難。目前的毒物篩查方法遠不能滿足辦案的需要,建立快速、準確的高通量篩查方法具有重要意義。

液相色譜與質譜聯用技術已成功應用于寬范圍的毒物篩查[3-6]。篩查技術需要強大數據庫的支持,與串聯四極桿質譜相比,飛行時間質譜具有更高的質量數分辨率和掃描速率[3],不受限于檢測化合物的數目,以更高的靈敏度提供了具有非靶向篩選能力的完整質譜數據,因而更適合未知多目標物的篩查。事實上,飛行時間質譜已被證明對于法醫毒理學篩查非常有效[7-11]。

血液(血漿、血清)、尿液、胃內容物、唾液、毛發等是涉毒案件中常見的生物檢材[12-13],本課題組前期工作[14]已建立超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜法(UHPLC-Q-TOF/MSE,其中E 是能量energy的簡寫,MSE技術可以設置兩個不同能量通道,同時獲得母離子和碎片離子信息)篩查人全血中150種藥物與毒物的方法,包含苯二氮艸卓類、抗抑郁藥、阿片類、除草劑、殺蟲劑等。與血清或血漿相比,尿液取樣方便,所含藥物與毒物含量相對較高[12,15],本工作進一步完成了篩查尿液中150種藥物與毒物,并進行了方法學驗證,可為涉毒案件偵破工作提供快速、準確的篩查方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC型超高效液相色譜儀;Xevo QTOF 型四極桿-飛行時間質譜儀,配Lock-spray接口、Masslynx V4.1數據處理系統和UNIFI篩查軟件;ELGA Labwater PURELAB型純化水系統。

單標準儲備溶液:準確稱取150種化合物標準品,根據不同理化性質采用甲醇或乙腈作溶劑,分別配制成1.0 g·L－1或0.1 g·L－1的單標準儲備溶液,保存于－20 ℃。

混合標準溶液:5 mg·L－1,取適量的150種化合物的單標準儲備溶液,混合,用甲醇稀釋,配制成5 mg·L－1混合標準溶液。

系統適用性溶液:采用10 種不同相對分子質量、極性和化學性質的化合物的混合溶液作系統適用性溶液,10種化合物分別為尼古丁、東莨菪堿、米那普侖、曲普利啶、噻奈普汀、泰必利、丁咯地爾、曲唑酮、氯氮平和奮乃靜。使用前將購買的系統適用性溶液用水稀釋至100μg·L－1,在每次分析運行開始時進樣,以驗證儀器性能。

甲醇、乙腈、甲酸和甲酸銨均為色譜純;四硼酸鈉、氫氧化鈉、二氯甲烷、異戊醇、乙醚和己烷均為分析純;試驗用水為自制超純水(電阻率18.2 MΩ·cm,總有機碳質量分數小于1×10－9)。

使用的150種化合物標準品購自公安部物證鑒定中心、中國食品藥品檢定研究院、上海市農藥研究所等不同標準物質生產廠家。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS C18色譜柱(150 mm×2.1 mm,3.5μm);柱溫50 ℃;樣品室溫度4 ℃;進樣量10μL;流動相A 為含0.1%(體積分數)甲酸的乙腈溶液,B為5 mmol·L－1甲酸銨溶液(pH 3.0);流量420μL·min－1。梯度洗脫程序:0～0.50 min時,A 為13%;0.50～10.00 min時,A 由13%升至50%;10.00～10.75 min時,A 由50%升至95%,保持1.50 min;12.25～12.50 min時,A 由95%降至13%,保持2.50 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子源,正離子全掃描模式,離子源溫度120 ℃;毛細管電壓3 000 V,錐孔電壓25 V;去溶劑氣(氮氣)流量800 L·h－1,溫度450 ℃;錐孔氣(氮氣)流量20 L·h－1;低碰撞能量6 eV;高碰撞能量10～30 eV;質量數采集范圍質荷比(m/z)50～1 000 Da。以亮氨酸腦啡肽(m/z556.277 1)實時進樣,校正外界環境造成的質量數偏移,質量濃度為2 mg·L－1,流量為5μL·min－1。其他質譜參數見文獻[14]中表1。

表1 保留時間的精密度試驗結果(n＝8)Tab.1 Results of test for precision of retention time(n＝8)

1.2.3 篩查條件

采用Masslynx V4.1 數據處理系統和UNIFI篩查軟件采集數據和控制儀器。收集150種藥物與毒物的保留時間和質譜信息,建立質譜庫文本數據,導入UNIFI篩查軟件,對未知物進行高通量快速篩查。將數據庫中標準化合物的保留時間、母離子及碎片離子信息與實際樣品的進行對比,保留時間偏差的絕對值小于0.25 min及質量數偏差的絕對值小于10 m Da的化合物將會自動顯示在篩查結果中,即為陽性結果。在每個序列開始時首先進樣系統適用性溶液,并根據系統適用性化合物的保留時間和準確質量數偏差來設定篩查的標準范圍。

1.3 試驗方法

參照文獻[14]取250μL 尿液于2 mL 離心管中,準確加入混合標準溶液10μL及pH 9.5的飽和硼酸鹽溶液125μL,渦旋混合15 s。將750μL 提取溶劑體積比為50∶30∶20∶0.5的乙醚-二氯甲烷-己烷-異戊醇混合液加入離心管中,渦旋60 s。以轉速13 000 r·min－1離心5 min,轉移上層(有機層)液體至1.5 mL的離心管中。在50 ℃水浴空氣流下揮干,殘渣用250μL 初始流動相溶液復溶,渦旋混合,按儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 質譜行為和定性分析

以篩查實際案件的陽性結果為例,圖1是在儀器工作條件下篩查得到的氟哌啶醇質譜圖。

圖1 氟哌啶醇的質譜圖Fig.1 MS spectra of haloperidol

由圖1可知,在低碰撞能量時得到的氟哌啶醇母離子為m/z376.147 4,與理論值m/z376.147 5基本一致;在高碰撞能量時得到的氟哌啶醇碎片離子為m/z165.069 5和358.137 6,與理論值(m/z165.071 1和358.136 9)相符。

150種化合物是根據化合物的保留時間和母離子準確質量數來鑒定的,碎片離子也包含在內,用來提高鑒別的可信度和區分同分異構體的可能性。在本工作測定的150種化合物中,共有13組同分異構體?；诓煌谋Ａ魰r間或獨特的碎片離子,13組同分異構體中的10 組可以成功地彼此區分;其余3組同分異構體,即麻黃堿和偽麻黃堿、倍他米松和地塞米松、嗎啡和氫嗎啡酮不能通過上述方法具體區分。

2.2 保留時間的精密度試驗

取空白尿液,添加系統適用性溶液(100μg·L－1),并按試驗方法測定,用于評估保留時間的重現性。通過分析同一日8次進樣及連續8日每日進樣一次的尿液樣本數據,計算保留時間的相對標準偏差(RSD),以考察系統適用性化合物保留時間的日內和日間精密度,結果見表1。

2.3 選擇性試驗

取空白尿液、混合標準溶液、加標尿液(加標量為25.0μg·L－1),按試驗方法測定,以各目標物保留時間、母離子及碎片離子信息進行定性分析。結果表明,空白尿液背景未見內源性物質干擾,加標尿液與混合標準溶液中化合物的保留時間及離子對信息一致。

2.4 殘留試驗

進樣一針高濃度水平(質量濃度為200μg·L－1)的尿液后,再進3 針空白溶劑,考察化合物在整個檢測系統的殘留情況。結果顯示,第一針空白溶劑進樣后發現普拉西泮和普羅帕酮有殘留,但后續兩針空白進樣后沒有再出現。因此,篩查遇到這兩種化合物時,需要加一針空白溶劑。

2.5 基質效應和提取回收率

選取68個化合物作為代表性化合物,這些化合物的保留時間貫穿150種化合物的出峰位置?？疾炝?8個化合物在尿液中的基質效應和提取回收率(RE)?；|效應包含絕對基質效應(a ME)和相對基質效應(r ME)。試驗采用絕對基質效應來評估基質對化合物質譜信號的抑制或增強程度。

取空白尿液,按試驗方法處理樣品,收集上層有機溶劑,在有機溶劑中加入標準溶液,搖勻,于50℃水浴空氣流下揮干,殘渣用250μL初始流動相溶液復溶,按試驗方法進行測定,各分析物的峰面積記作A;取標準溶液于50 ℃水浴空氣流下揮干,然后用250μL初始流動相溶液復溶,按儀器工作條件進行測定,各分析物的峰面積記作B;按照a ME＝A/B×100%計算絕對基質效應。

取空白尿液,加入標準溶液,按試驗方法處理樣品,并進樣測定,各分析物的峰面積記作C,按照RE＝C/A×100%計算提取回收率。結果見表2。

表2 基質效應和提取回收率Tab.2 Matrix effect and recovery of extraction

試驗所建立的篩查方法是初篩尿液中藥物與毒物的定性方法,本課題組前期已建立全血基質的篩查方法[14]。全血與尿液都是常見的生物檢材,考慮到實際案件的應用,不同生物檢材采用相同的方法,操作簡單,且有利于推廣,因此試驗采用與血樣一致的樣品前處理方法來處理尿樣。由表2可知,該方法的絕對基質效應為23.1%～119%,平均值為69.5%;提取回收率為30.8%～115%,平均值為84.6%。尿液主要成分是水(質量分數96%～97%)、無機鹽(主要是鈉鹽和氯鹽)和有機物(主要是尿素,還含有少量的糖類、蛋白質、酶、性激素等)[3],主要的干擾成分是無機鹽[16];另外,尿液中含有的各種酶會使部分目標物發生酶解。尿液中一些化合物的絕對基質效應較明顯,可能是因為一些內源性物質(如無機鹽、酶)未完全去除干凈而造成的。

通過計算6個來源空白尿液基質得到的A/B的變異系數,得到化合物在不同批次尿液基質間的相對基質效應。結果表明,除地芬諾酯(相對基質效應40.7%)、甲基麻黃堿(相對基質效應19.1%)外,其他化合物的相對基質效應均小于15%,說明化合物在不同批次尿液中受到的基質影響差異小。

綜上可知,對于多種藥物與毒物的同時測定,這些化合物的基質效應和提取回收率還是可以接受的,說明本方法仍不失為一種可行的檢測方法。

2.6 檢出限

在空白尿液中添加不同質量濃度的混合標準溶液,化合物在尿液中的質量濃度分別為0.2,1.0,5.0,25.0,100.0,200.0μg·L－1,按試驗方法對上述溶液處理后進樣分析。以3倍信噪比(S/N)計算各化合物的檢出限(3S/N),結果見表3。

表3 檢出限Tab.3 Detection limits

由表3 可知:150 種化合物的檢出限為0.2～25.0 μg·L－1,其中112 個化合物的檢出限為0.2μg·L－1,20 個化合物的檢出限為1.0μg·L－1,13個化合物的檢出限為5.0μg·L－1,5個化合物的檢出限為25.0μg·L－1。

2.7 穩定性試驗

在空白尿液中添加混合標準溶液(各化合物的質量濃度均為25.0μg·L－1),考察了不同條件下樣品的穩定性,包括短期穩定性(將尿液樣品于室溫存放7 h)、長期穩定性(將尿液樣品于－20 ℃存放10 d)、處理后進樣器放置穩定性(尿液樣品經處理后在自動進樣器中于4 ℃存放24 h)和凍融穩定性(將尿液樣品于－20 ℃存放24 h,取出置于室溫下30 min,將尿液樣品溶解后再于－20 ℃存放24 h,如此重復凍融3個循環,第3個循環時進行測定)。

結果表明:O3-單乙酰嗎啡、敵百蟲、海洛因和普拉西泮于室溫存放7 h不穩定;氯硝西泮、東莨菪內酯、乙草胺、魚藤酮、奧沙西泮、海洛因、O3-單乙酰嗎啡于－20 ℃存放10 d后發生部分降解;除福爾可定、氯丙嗪和硝西泮外,所有化合物在自動進樣器中于4 ℃存放24 h后均保持穩定;O3-單乙酰嗎啡在3次凍融循環條件下降解。對于上述化合物的更優儲存條件還需進一步研究。

2.8 實際案例分析

將建立的篩查方法用于實際案例分析。篩查120個尿液實際案例,共有10個樣品(1?！?0＃)呈陽性(咖啡因沒有統計),分別為氯胺酮和去甲氯胺酮(1＃)、氯硝西泮(2＃)、嗎啡(3＃)、地西泮和去甲基安定(4＃)、氯硝西泮和阿普唑侖(5＃)、甲基安非他明(6＃)、可卡因(7＃)、東莨菪堿(8＃)、阿普唑侖和α-羥基-阿普唑侖(9＃)、氟哌啶醇(10＃)。用氣相色譜-質譜聯用儀對篩查的陽性樣品進行了驗證,證明了UHPLC-Q-TOF/MSE方法作為日常篩查工具的適用性。

本工作建立了尿液中150種藥物與毒物的篩查技術,采用相同的樣品前處理、色譜系統和檢測系統,新的化合物可以很容易添加到篩查方法中,方法快速簡單、準確可靠,有利于推廣。另外,涉毒案件復雜,涉及的生物檢材多種多樣,下一步工作將開發其他基質中藥物與毒物的檢測手段,并進一步擴充篩查數據庫,為涉毒案件偵破工作提供準確、高效的多未知目標物篩查技術,提高辦案效率。