QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定糌粑中15種真菌毒素的含量

蔣曉宏 ,霍宗利 ,朱 峰 ,周永林 ,沈 菲*

(1.拉薩市疾病預防控制中心,拉薩 850000;2.江蘇省疾病預防控制中心,南京 210000)

糌粑是藏族人民的傳統食品,它是以產于西藏、青海、甘肅等高寒地區的青稞為原料,經除雜、清洗、晾干、翻炒、磨粉等工藝制成的粉末狀食物,也被稱為青稞炒面[1]。糌粑擁有非常豐富的營養成分,富含蛋白質、糖、脂肪、纖維素、氨基酸和礦物質,缺少瓜果蔬菜的高寒地區的人民經常食用,可避免營養缺乏[2-4]。與全國其他地區的糧食產業相比,糌粑產業相對比較落后,管理、生產體系尚未規范,生產過程中可能存在產品質量風險。糌粑產品中含有約6%(質量分數)的水分,其在溫度和濕度均較高的環境存放,極易吸潮結塊,促進了微生物的生長,進而變質,影響糌粑的品質[5-6]。

真菌毒素是真菌產生的次生代謝產物,具有致癌、致畸、致突變的特性,易導致急性或慢性中毒。迄今為止,已有超過500種真菌毒素被發現,研究主要聚焦于二十多種對人類和動物有明確毒性作用的化合物。根據真菌毒素的化學結構及其與人類和動物健康的相關性,可將其劃分為主要真菌毒素(包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、單端孢霉烯族毒素、伏馬菌素、棒曲霉素和玉米赤酶烯酮類毒素)、新興真菌毒素[鏈格孢霉毒素和新興鐮刀菌毒素(白僵菌素和恩鐮孢菌素)]和其他真菌毒素等[7]。這些毒素可通過多種方式污染食品,如直接感染谷類等農作物,污染原料導致咖啡、果汁等加工食品受到污染,飼料中的毒素遷移導致肉、蛋、奶等動物源性食品污染等[8]。

糌粑作為藏族獨有的傳統主食,在原料生長與采收、成品加工、貯藏及運輸中都易受到產毒真菌的侵染,并且可能被多種產毒真菌同時侵染[9],但目前鮮有相關報道,因此有必要建立糌粑中真菌毒素的檢測方法。近年來,QuECh ERS-超高效液相色譜-串聯質譜技術由于其高效、簡便和環保的特點,能夠有效地提取和凈化基質中多種真菌毒素,廣泛應用于食品中真菌毒素的分析[10-13]。

本工作以Qu ECh ERS 作為樣品前處理方法,選取了植物源性食品中主要真菌毒素污染物[脫氧雪腐鐮刀菌烯醇類、黃曲霉毒素類、伏馬毒素類、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、雜色曲霉毒素(ST)等]作為研究對象,提出了超高效液相色譜-串聯質譜法測定糌粑中15種真菌毒素含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-30A 型超高效液相色譜儀;QTRAP 5500型三重四極桿質譜儀;2-16KL 型臺式冷凍離心機;1-14型臺式離心機;OA-SYS型氮吹儀;Vortex-Genie 2型渦旋混合器。

單標準溶液:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、15-乙?；撗跹└牭毒┐?15-ACDON)、3-乙?；撗跹└牭毒┐?3-ACDON)、HT-2 毒素(HT-2)、T-2 毒素(T-2)、ZEN 標準溶液的質量濃度均為100 mg·L－1;伏馬毒素B1(FB1)、伏馬毒素B2(FB2)、伏馬毒素B3(FB3)、ST 標準溶液的質量濃度均為50 mg·L－1;OTA 為10 mg·L－1,黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素B1(AFB1)標準溶液的質量濃度均為2 mg·L－1,黃曲霉毒素G2(AFG2)、黃曲霉毒素B2(AFB2)標準溶液的質量濃度均為0.5 mg·L－1。使用時用乙腈稀釋至所需質量濃度。

混合標準溶液:分別取適量的15種真菌毒素標準溶液,用乙腈稀釋成DON、15-ACDON、3-ACDON、HT-2的質量濃度為1 mg·L－1,其余真菌毒素質量濃度為0.1 mg·L－1的混合標準溶液,于－20 ℃保存。

硫酸鈉、氯化鈉、硫酸鎂均為分析純;乙腈、甲酸均為色譜純;試驗用水為質譜級。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);流量0.3 mL·min－1;柱溫40 ℃;進樣量10μL;流動相A 為0.2%(體積分數,下同)甲酸溶液,B 為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.5 min時,B為5%;1.5～4.5 min時,B 由5%升至23%;4.5～11.0 min 時,B 由23% 升至50%,保持3.0 min;14.0～16.0 min時,B 由50%升至100%;16.0～16.1 min 時,B 由100%跳轉至5%,保持0.9 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,離子源溫度550 ℃,正離子(ESI＋)、負離子(ESI－)模式同時掃描;多反應監測(MRM)模式;毛細管電壓5 500 V(ESI＋模式)/－4 500 V(ESI－模式);氣簾氣流量31.8 L·min－1,霧化氣流量8.4 L·min－1,輔助氣流量6.8 L·min－1。其他質譜參數見表1,其中“*”為定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

準確稱取1 g(精確至0.001 g)均質過的糌粑粉末,置于50 mL 離心管中,加入5 mL 水和10 mL含10%(體積分數,下同)甲酸的乙腈溶液,渦旋振蕩提取10 min,加入鹽析劑(4 g硫酸鈉,1 g氯化鈉),渦旋振蕩10 min,以轉速10 000 r·min－1離心10 min。取1.5 mL上清液,置于裝有150 mg硫酸鎂、100 mg C18、100 mgN-丙基乙二胺(PSA)的2 mL凈化管中,渦旋振蕩5 min,以轉速14 800 r·min－1離心10 min。取0.8 mL 上清液,氮吹至近干,用0.4 mL 20%(體積分數)乙腈溶液復溶,渦旋混合5 min,過0.22μm 濾膜后,按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 儀器工作條件的選擇

采用針泵方式進樣,將200μg·L－1單標準溶液以7μL·min－1的流量注入質譜儀,在ESI＋、ESI－模式下,分別進行Q1母離子和Q3子離子掃描,ZEN 在ESI－模式下響應高,其他14種真菌毒素均在ESI＋模式下響應較好,分別選取最合適的離子對,優化最優的去簇電壓、碰撞能量等參數,得到最佳質譜參數,具體見1.2.2節。

試驗考察了不同水相[0.1%(體積分數)氨水、0.2%甲酸溶液、水]和不同有機相(甲醇、乙腈)組合的流動相對化合物響應值和分離度的影響。結果表明,對于含有乙酰氧基團的真菌毒素,乙腈-水體系的洗脫效果和化合物的響應均好于甲醇-水體系,因為乙酰氧類化合物在甲醇溶劑中不穩定[14]。由于待測真菌毒素多數是ESI＋模式掃描,甲酸可增強ESI＋模式下大部分真菌毒素的離子化效率,提高目標化合物的響應,雖然甲酸對ESI－下ZEN 的靈敏度略有影響,但是能滿足檢測需求。綜合考慮,試驗選用0.2%甲酸溶液-乙腈體系為流動相。

在優化的儀器工作條件下,得到的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 15種真菌毒素的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of 15 mycotoxins

2.2 提取劑的選擇

試驗考察了甲醇、乙腈作為提取劑時目標物的提取效率。結果表明:甲醇極性小,溶解性強,提取時基質效應較為明顯,且對DON 的提取效率影響較大;乙腈的選擇性更好,可有效減少脂肪、色素等雜質的提取。綜合考慮,試驗選擇乙腈作為提取劑。

由于伏馬毒素類和赭曲霉毒素類真菌毒素具有羧基,水溶性強,對酸具有敏感性,加入甲酸可增強其穩定性,提高提取效率,因此試驗進一步比較了乙腈、含1%(體積分數,下同)甲酸的乙腈溶液、含5%(體積分數,下同)甲酸的乙腈溶液、含10%甲酸的乙腈溶液對真菌毒素回收率的影響。結果表明:使用乙腈提取時,FB1、FB2、FB3和OTA 的回收率均低于5.0%,其余真菌毒素的回收率在50.0%～80.0%內;使用含1%甲酸的乙腈溶液提取時,OTA的回收率提高至30.0%,FB1、FB2、FB3的回收率均未變化,其余真菌毒素的回收率在60.0%～85.0%內;使用含5%甲酸的乙腈溶液提取時,FB1、FB2、FB3的回收率在25.0%～45.0%內,OTA 的回收率提高至90.0%,其余真菌毒素的回收率均在75.0%以上;使用含10%甲酸的乙腈溶液提取時,15種真菌毒素的回收率均大于75.0%。因此,試驗選擇含10%甲酸的乙腈溶液作為提取劑。

2.3 凈化劑及其用量的選擇

C18主要用于去除脂質等非極性雜質;PSA 用于消除各種有機酸、色素、糖,并同時消除部分水;石墨化碳黑(GCB)可去除類甾體、葉綠素等色素,但GCB具有強吸附性,在使用時部分被測物不易洗脫。試驗探討了不同用量的PSA、C18和GCB 對15種真菌毒素回收率的影響,每個試驗重復3次。其中,凈化劑中硫酸鎂的主要作用是吸附水分,對目標化合物的回收不會有影響,故此處不再討論硫酸鎂的用量。

固定PSA、C18用量均為100 mg,考察了不添加GCB以及GCB用量為5,10,20 mg時對真菌毒素回收率的影響,如圖2所示。

圖2 GCB用量對15種真菌毒素回收率的影響Fig.2 Effect of GCB amount on the recovery of 15 mycotoxins

由圖2可知:GCB的用量對部分真菌毒素的回收率影響很大。相較于不添加GCB,GCB 用量為5 mg時ST 的回收率下降了50%;GCB用量增加至20 mg 時ST 的回收率低于5.0%,AFB1、AFB2、OTA 的回收率也明顯下降。GCB對具有平面分子結構的雜質(如甾醇和葉綠素等)吸附效果好,對具有平面分子結構或不完全平面分子結構的真菌毒素也有較強的吸附作用[15]。ST、AFB1、AFB2具有明顯的平面結構,易被GCB吸附,因此GCB對這些真菌毒素的回收率影響較大。綜合考慮,樣品處理過程中不使用GCB。

固定PSA 用量為100 mg,不加入GCB,試驗考察了不添加C18以及C18用量為50,100 mg時對真菌毒素回收率的影響,如圖3所示。

圖3 C18用量對15種真菌毒素回收率的影響Fig.3 Effect of C18 amount on the recovery of 15 mycotoxins

由圖3可知:不添加C18時,FB2的回收率低于50.0%,隨著C18用量的增加,FB2的回收率有明顯提升;C18用量對3-ACDON、AFG1、HT-2、T-2、OTA 回收率的影響不大;AFG2、AFB2的回收率在C18用量為50 mg時最優,其余真菌毒素的回收率均在C18用量為100 mg時最佳。固定C18用量為100 mg,不加入GCB,考察了不添加PSA 以及PSA 用量為50,100 mg時對真菌毒素回收率的影響,如圖4所示。

由圖4可知:不添加PSA 時,AFB1和ST 的回收率低于50.0%,二者回收率均隨著PSA 用量的增加而提高;HT-2的回收率有隨著PSA 用量增加而降低的趨勢,AFG2、FB3、T-2、OTA 的回收率在PSA 用量為50 mg時最優,其余真菌毒素的回收率在PSA 用量為100 mg時最佳。

綜合考慮,試驗最終優化得到的凈化劑用量為PSA 100 mg和C18100 mg,在此條件下各真菌毒素回收率均達到75.0%以上。

2.4 基質效應

基質效應可能會導致峰形拖尾、線性差及重現性差,可利用不同濃度水平的目標化合物在空白溶劑中的標準曲線斜率和在基質溶液中的工作曲線斜率進行計算[16]。試驗采用空白糌粑基質提取液和空白溶劑分別配制標準溶液系列,獲得工作曲線和標準曲線(相關系數均大于0.990 0),基質效應＝(工作曲線的斜率－標準曲線的斜率)/標準曲線的斜率×100%。結果表明:T-2、3-ACDON、AFG1的基質效應絕對值均在20.0%～50.0%內,AFB2、FB2、ZEN 的基質效應絕對值均在10.0%～20.0%內,其余真菌毒素的基質效應絕對值均小于10.0%。說明大多數真菌毒素的基質效應較小,只有3種真菌毒素的基質效應絕對值在20.0%～50.0%內。使用內標和基質校正標準曲線(即工作曲線)定量是常用的去除基質效應的方法,而真菌毒素種類較多,找到對應的內標難度較大,且真菌毒素的內標價格非常昂貴,為了降低檢測成本,試驗采用基質校正標準曲線進行準確定量,可以消除基質效應的影響。

2.5 工作曲線、檢出限與測定下限

取陰性糌粑樣品,按照試驗方法制備空白基質提取液,用其配制混合標準溶液系列,其中DON、15-ACDON、3-ACDON、HT-2 的質量濃度為5.0,20,50,100,200μg·L－1,其余真菌毒素的質量濃度為0.5,2.0,5.0,10,20μg·L－1。以化合物的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制工作曲線,得到的線性范圍、線性回歸方程、相關系數見表2。

表2 線性參數、檢出限及測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

以3倍信噪比(S/N)確定化合物的檢出限(3S/N),以10 倍信噪比確定化合物的測定下限(10S/N),結果見表2。

2.6 精密度與回收試驗

選取空白糌粑樣品,按2 倍測定下限(低)、10倍測定下限(中)、20倍測定下限(高)等3個濃度水平進行加標回收試驗,每個濃度水平選取6個平行樣,按照試驗方法測定,計算真菌毒素的回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。由表3可知,15種真菌毒素在糌粑中的回收率為75.8%～105%,測定值的RSD 為0.10%～9.5%。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.7 樣品分析

從拉薩市購買不同廠家的糌粑共10批,包括糌粑(3批)、黑糌粑(2批)、豌豆糌粑(1批)、水磨糌粑(1批)、仲嘎糌粑(1批)、羅布瓊孜糌粑(1批)、萌動糌粑(1 批),按照試驗方法進行測定。結果表明,10批糌粑中有7批檢出OTA,檢出率高達70%,檢出量為0.4～32.3μg·kg－1,其余真菌毒素均未檢出,說明OTA 污染的概率較高。國家標準GB 2761－2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》規定谷物及其制品中OTA 的限量為5μg·kg－1,試驗發現兩批糌粑中OTA 含量超標,亟需重視糌粑中真菌毒素的安全性,并進行相關監控。

本工作采用Qu ECh ERS 樣品前處理方法,以超高效液相色譜-串聯質譜法測定糌粑中15種真菌毒素的含量。方法前處理簡單、靈敏度高、專屬性強、精密度好、穩定可靠,可用于糌粑中真菌毒素的含量測定和安全性防控。