橡膠樹季風性落葉病病原菌的分離鑒定及其防治藥劑篩選

施玉萍， 劉一賢， 李國偉， 唐軼， 戴利銘， 李嵐嵐， 蔡志英*

（1.云南省熱帶作物科學研究所，云南省天然橡膠可持續利用研究重點實驗室（籌），天然橡膠良種選育與栽培技術國家地方聯合工程研究中心，云南 景洪 666100； 2.勐臘縣勐捧農場有限責任公司，云南 勐臘 666307；3.勐捧農場社區綜合服務中心，云南 勐臘 666307）

橡膠樹（Hevea brasiliensis）是一種用于生產商業天然橡膠的重要熱帶經濟作物[1-2]，主要種植于海南、廣東、廣西、福建、云南等熱帶地區北緣[3]。云南省是我國第一大天然橡膠種植和生產基地[4]，且天然橡膠產業作為云南省傳統優勢特色產業，為全省脫貧攻堅、社會安定團結、邊疆穩固發展和保障國家天然橡膠供給提供了強有力的保障[5]。

季風性落葉病是橡膠樹的主要病害之一，不僅危害橡膠樹的枝條、葉片和果實，還危害割面、樹干等部位，引起落葉、落果、割面潰瘍等，發病嚴重時導致膠樹停割，膠乳產量減少，病害防治成本增加，給橡膠產業發展造成巨大威脅。引起季風性落葉病的病原菌主要為疫霉屬（Phytophthoraspp.）真菌，其在亞洲、非洲和拉丁美洲等世界各橡膠種植區均有報道，且不同地區或國家，甚至同一地區的病原菌種類、分布和嚴重程度均存在差異[6-9]。我國云南西雙版納墾區自1965年首次發現季風性落葉病以來，發病面積不斷擴大，1978年西雙版納墾區5個農場發病面積為301.93 hm2，根據形態學特征將其病原菌鑒定為疫霉屬[10]。1984年，臨滄、德宏等地首次發現季風性落葉病害，并造成部分膠樹停割[11]。1991 年,西雙版納東風農場的發病面積達2 194.56 hm2，占投產膠園的25.3%，停割3 100 余株[12]。2012 年,西雙版納勐捧農場等6 個農場的病害發生總面積約8 729 hm2，其中重病面積933 hm2，停割面積237 hm2，致病菌為云南植膠區分布廣泛、致病力較強的柑桔褐腐疫霉（P.citrophthora）[13]。2014 年,季風性落葉病在云南大暴發，西雙版納州嘎灑鎮和東風農場受害的橡膠園總面積為8 129.91 hm2，給當地農戶造成了巨大損失[14-15]；臨滄市發病面積共666.7 hm2[16]。2021年8—9 月，西雙版納州勐臘縣發生季風性落葉病，災害面積約120.00 hm2；2022 年7—9 月，西雙版納州多地植膠區發生季風性落葉病，受害面積1 728.40 hm2，其中景洪164.53 hm2、勐滿50.67 hm2、勐醒380.17 hm2、東風533.03 hm2、勐捧600.00 hm2，主要受害品系為RRIM 600，病害在臨江林段、林段中部及山頂林段均有發生（實地調查，數據未發表）。

西雙版納植膠區橡膠樹季風性落葉病自發生以來，關于其病原菌種類、病害防治等進行的系統研究較少。我國已報道的季風性落葉病致病菌有棕櫚疫霉(P. palmivora）、惡疫霉（P. cactorum）、柑桔褐腐疫霉（P. citrophthora）、寄生疫霉（P.parasitica）、棕櫚疫霉（P. palmivora）、辣椒疫霉（P.capsici）、橡膠疫霉（P. heveae）[17-21]，這些致病菌都是根據病原菌的形態特征和生理生化特性來進行分類鑒定的，但疫霉菌屬真菌種間或種內的形態變異性較大，僅根據形態特征、生理生化特性、致病性等很難對該屬的病原菌種類進行準確鑒定，因此通過相對穩定的形態學特征，同時結合分子生物學方法，能夠使疫霉菌的分類更準確。目前，化學防治是控制季風性落葉病的主要手段，但在我國登記用于防治該病害的殺菌劑仍為空白，也未見該病害防治藥劑篩選的相關報道，膠農還存在亂用藥的情況，因此亟待篩選出有效的防治藥劑。

為確定近2 年引起西雙版納植膠區橡膠樹落葉病的致病菌，本研究采集感病樣本，采用組織分離法和菌絲尖端純化法進行病原菌的分離、純化，通過活體接種法測定致病性，然后結合形態學特征和分子生物學方法明確其分類地位；采用菌絲生長速率法測定15 種殺菌劑對該病原菌的抑菌活性，以期為該病的有效防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試橡膠樹感病葉片分別采自云南景洪橄欖壩農場5 分場（N 21°51′0″， E 100°55′43″，海拔700 m）、景洪市勐侖鎮阿克小寨大卡村(N 21°50′27″， E 101°12′9″，海拔800 m)、景洪市東風農場中林生產隊16 組（N 21°40′28″， E 100°45′54″，海拔720 m）、勐臘縣象明鄉曼林村小組臭水河居民點橡膠園(N 21°59′37″， E 101°18′19″，海拔761 m)、勐臘縣勐滿農場潤疆生產隊3 組（N 21°23′34″， E 101°18′51″，海拔577 m）。每個采集地選取感病橡膠樹10 株，每株選取1 片具有典型癥狀的葉片。

DNA 提取試劑盒PlantGen DNA Kit 購自北京康為世紀生物科技有限公司；2×Es TaqMasterMix(Dye) 購自康為世紀生物科技股份有限公司；其余試劑均為國產分析純。擴增儀（Veriti 96 well Thermal Cycler）購自美國Applied Biosystem 公司；DYY-6C 電泳儀購自北京六一儀器廠；UVP 凝膠成像系統購自美國 UVP 公司；SPX-250B-G 恒溫培養箱購自上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

供試培養基為胡蘿卜瓊脂（carrot agar，CA）培養基：胡蘿卜100 g（切片，100 mL水中浸泡1 h，煮沸5 min，過濾），瓊脂粉18 g，蒸餾水1 000 mL；皮氏培養液Petri：Ca(NO3)2·4H2O 0.4 g，KH2PO40.15 g，Mg(NO3)20.15 g，CaCl20.06 g，H2O 1 000 mL。

選取15 種不同劑型殺菌劑測定其對病原菌菌絲生長的抑制，詳見表1。

表1 供試殺菌劑Table 1 Information of tested fungicides

1.2 病原菌的分離及鑒定

1.2.1病原菌的分離 在感病葉片或葉柄的病健交界處剪取約5 mm×5 mm 的組織塊，置于70%的乙醇中浸泡30 s，1.5%次氯酸鈉浸泡60 s，無菌蒸餾水沖洗3次，將消毒過的組織塊置于CA 培養基上，28 ℃恒溫、黑暗條件下培養。待菌落長出后，采用菌絲尖端挑取法進行病原菌的純化，將純化的分離物轉接到CA 培養基上，28 ℃培養7 d 后，于4 ℃保存備用或在斜面上加礦物油密封保存。

1.2.2病原菌的形態特征及生理特性 菌落形態：將純化的病原菌接種于CA 培養基上，28 ℃黑暗培養5 d后記錄菌落形態。

孢子囊的誘導：將病原菌在CA 培養基上培養3~4 d，挑取菌落邊緣的菌絲塊置于載玻片上，滴加皮氏液，28 ℃、連續光照（15 W 日光燈）條件下保濕培養72 h，Lecia DM6B 顯微鏡下觀察并記錄孢子囊的形態特征，并隨機選取50 個成熟孢子囊測量大小。

生長溫度：將病原菌菌絲塊（直徑5 mm）轉接在CA 培養基上，分別于5、10、15、20、25、28、30、35 ℃黑暗培養5 d 后測量菌落直徑，每個溫度設置3次重復。

1.2.3系統進化分析 將純化后的病原菌接種到CA培養基上培養7 d，刮取約100 mg菌絲，用試劑盒提取病原菌基因組DNA，于-20 ℃保存備用。采用引物ITS1/ITS4和FM78/FM82（表2）分別進行PCR 擴增。PCR 產物送北京擎科生物科技有限公司昆明實驗室測序。

表2 PCR擴增ITS和COXⅡ基因的引物Table 2 Primer used to amplify ITS and COXⅡ genes

將測序所得序列提交GenBank 并與NCBI 數據庫已知序列進行BLASTn 比對分析，根據比對結果下載相似菌株序列，按ITS-COX Ⅱ進行序列拼接，利用鄰接法（(neighbor joining method，NJ）通過MEGA X 軟件構建系統發育樹，Bootstrap 檢驗的重復次數設置為1 000。

1.3 病原菌的柯赫氏法則驗證

在云南省熱帶作物科學研究所植保中心大棚的盆栽橡膠苗上進行致病性試驗，采用菌絲懸浮液噴霧法進行接種，方法如下：將純化的菌株在CA 培養基上培養8 d，輕輕刮下培養物，用無菌水勻漿，制成菌絲懸浮液。用噴壺將菌絲懸浮液均勻地噴灑到健康的橡膠嫩葉上；以噴灑無菌清水的橡膠嫩葉為對照。接種后套上塑料袋保濕48 h，每處理6 株，重復3 次。2 d 后逐日觀察接種植株的發病情況。根據柯赫氏法則，將接種后發病的橡膠葉片再進行分離，觀察分離菌株與原始菌株的培養性狀和形態特征是否一致。

1.4 病原菌防治藥劑的篩選

用直徑為5 mm 的打孔器在活化的病原菌菌落邊緣打取菌餅，接入到含不同殺菌劑的CA 培養基上，每個處理3 次重復，以不含殺菌劑的CA培養基為對照，28 ℃培養4 d，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落生長抑制率(式1)；并以藥劑含量對數為橫軸（x），菌落生長抑制率的機率值為縱軸（y）制作毒力曲線，求出毒力回歸方程：y=ax+b，計算不同藥劑對病原菌的半數效應劑量（EC50）。

1.5 數據統計

采用SPSS 24軟件進行數據的統計和分析。

2 結果與分析

2.1 病害的田間癥狀

病害的主要受害品系為RRIM 600，GT1 品系少量受害，病害在臨江林段、林段中部及山頂林段均有發生。受害林段葉片變紅、變黃、變稀疏，大量落葉。受害癥狀主要表現為葉片上有暗綠色至黑褐色水漬狀病斑，表面有一層白色霜霉狀物；大葉柄基部呈現水漬狀黑色病斑，受害變黑的葉柄部通常有白色凝膠滲出（圖1）。該病害的田間癥狀與橡膠樹季風性落葉病典型癥狀一致。

圖1 橡膠樹落葉病田間癥狀Fig. 1 Symptoms of abnormal leaf fall diseases on rubber tree in field

2.2 病原菌分離及致病性測定

經組織分離法從橡膠病樣上分離獲得真菌分離物，經菌絲尖端挑取法純化后，獲得菌落形態相同的20 株分離物，采用活體接種法進行致病性測定，發現所有分離物均能使橡膠樹葉片發病，發病癥狀與田間癥狀表現一致。

如圖2 所示，將分離病原菌接種于健康葉片4 d后，被侵染葉片形成水漬狀病斑，表面有白色霜霉層，且病斑邊緣有凝膠滲出；去除保濕用的塑料袋后，病斑不再繼續擴展。從發病葉片病斑上經反分離，獲得與原接種病原菌形態特征相同的分離物，表明獲得的分離物為橡膠樹落葉病致病菌。

圖2 病原菌菌絲懸液接種后的橡膠樹葉片癥狀Fig. 2 Pathogenicity assay conducted on rubber tree leaves with the mycelium suspension and the symptoms

2.3 形態學及生理學特征

分離獲得的20 株橡膠樹落葉病致病菌分離物具有一致的形態特征和生理學特性。由圖3 可知，病原菌在5、10 和35 ℃時不能生長，最適生長溫度為25~30 ℃，最高生長溫度35 ℃；28 ℃黑暗條件下，病原菌在CA 培養基上生長良好，生長速率為(15.20±0.47) mm·d-1；菌落白色，呈花瓣狀，邊緣不規則，菌絲緊貼培養基表面生長。

圖3 不同溫度下病原菌菌絲生長情況Fig. 3 Mycelial growth of the pathogen at different temperature on CA medium

由圖4 可知，菌絲粗細較均勻，寬3.15~5.18 μm，分枝處略縊縮，偶有珊瑚狀菌絲膨大體，未見厚垣孢子。孢囊梗有簡單的合軸分枝，成簇形成。孢子囊橢圓形、卵圓形，大小(14.80~28.81) μm× (10.65~20.19) μm，平均21.15 μm×14.21 μm，長寬比1.49，孢子囊乳突明顯，半球形，多數為1個，孢子囊成熟后脫落，孢子囊柄較短，平均11.87 μm。單獨培養條件下不形成有性器官。

圖4 CA培養基上病原菌的形態特征Fig. 4 Culture characteristics and microscopic features of the pathogen on CA culture medium

根據余永年等[20]的橡膠樹疫霉種（Phytophthora）分種檢索表，結合Chee[9]、中國真菌志（第6 卷）[25]、鄭小波等[26]的描述，將病原菌初步鑒定為簇囊疫霉（Phytophthora botryosa）。由此表明，近年西雙版納植膠區橡膠樹落葉是由季風性落葉病引起。

2.3 分子生物學分析

為了進一步明確分離菌的分類地位，對其進行分子生物學鑒定。選取菌株ML-2，使用引物ITS1/ITS4擴增產生的rDNA-ITS序列長度為799 bp，登錄號：OP753718，BLASTn 同源性比對與簇囊疫霉（P. botryosa）模式菌株CBS 581.69（登錄號：MH401211）的相似性達99.75%，與菌株LFDL1.1.1（登錄號：KC247900）的相似性為100%；使用引物FM82/FM78擴增的COX Ⅱ基因片段為600 bp，登錄號：OP776413，BLASTn 同源性比對與簇囊疫霉（P. botryosa）模式菌株CBS 581.69（登錄號：MH760280）的相似性為99.83%，與菌株P1044（登錄號：JN618581）的序列相似性為100%。

利用MEGA X 基于ITS和COX Ⅱ序列構建系統進化樹，結果（圖5）表明，病原菌ML-2 與簇囊疫霉（P. botryosa）聚到同一分支，親緣關系最近。因此，根據分子生物學分析結果，并結合病原菌形態學及生理學特征，將病原菌ML-2鑒定為簇囊疫霉（P. botryosa）。

圖5 基于ITS-COX Ⅱ基因聯合序列的系統發育分析Fig. 5 Phylogenetic analysis based on concatenated sequences of ITS and COX Ⅱ

2.5 防治藥劑篩選

由表3 可知，15 種供試藥劑對病原菌ML-2 表現出不同的抑制效果，除80%三乙膦酸鋁水分散粒劑、250 g·L-1嘧菌酯懸浮劑、500 g·L-1多菌靈懸浮劑外，其余藥劑對病原菌均表現出一定的抑制作用，但不同殺菌劑的抑制效果存在差異。48%烯?！で杷驊腋?、80%烯酰嗎啉水分散粒劑、30%烯?！ぜ姿`水分散粒劑、35%烯?！に迩钁腋?、30%氟吡菌胺·甲霜靈水分散粒劑、0.3%四霉素水劑對病原菌ML-2 菌絲生長的抑制效果較好，EC50分別為0.137 1、0.175 9、0.201 7、0.257 7、0.265 1、0.351 0 mg·L-1；其次為25%甲霜·霜霉威可濕性粉劑和72%甲霜·錳鋅可濕性粉劑，EC50分別為0.837 4 和3.295 2 mg·L-1；500 mg·L-1多菌靈懸浮劑的抑制效果最差，EC50為20 671.976 3 mg·L-1。

表3 15種殺菌劑的室內毒力測定Table 3 Toxicity of fifteen fungicides to Phytophthora botryosa

3 討論

本研究通過病原菌分離純化、柯赫氏法則驗證，同時結合形態學特征、生理學特性及分子生物學鑒定，明確了西雙版納州橡膠樹非正常落葉是由橡膠樹季風性落葉病引起，病原菌為簇囊疫霉（P. botryosa），這是首次在我國植膠區內發現該病原菌侵染引起橡膠樹季風性落葉病。簇囊疫霉是越南、泰國、馬來西亞等東南亞植膠區季風性落葉病的優勢致病菌，但我國僅在福建漳州芋葉上分離到該致病菌。研究表明，柑橘褐腐疫霉（P.citrophthora）是西雙版納地區橡膠樹季風性落葉病病原菌的主要優勢種[13,27]。本研究未分離到該病原菌，這可能是由于環境條件、栽培時間、栽培管理措施、栽培品系等的改變，導致橡膠樹季風性落葉病病原菌的種類、優勢種、致病力等也發生變化，亟須開展相關基礎研究工作。

Wastie 等[28]研究表明，當連續4 d 最高氣溫低于32.3 ℃、14 h內相對濕度達到90%，或者當日均降雨量超過2.5 mm 時，橡膠樹很容易暴發季風性落葉病。西雙版納植膠區發生季風性落葉病時，正是出現連續8~10 d 的陰雨天氣，日照少，相對濕度大，且日最高溫度不超過30 ℃。因此，在雨季各植膠區應密切關注天氣情況，盡可能及早預防。

目前，生產上防治疫霉屬真菌引起的橡膠樹季風性落葉病最普遍、有效的方法仍是化學防治，如采用甲霜靈、苯醚錳鋅油煙劑噴霧[14]，銅油劑、敵菌丹油劑彌霧噴施[29-30]，氯氧化銅或膠態銅等銅素殺菌劑溶于油中熱霧噴施，甲霜靈可濕性粉劑、64%殺毒礬可濕性粉劑、72%霜霉威水劑噴霧[31]等可防治該病害。但到目前為止，國內尚未見登記用于防治橡膠樹季風性落葉病的藥劑，也未見防治藥劑篩選的相關報道。橡膠樹屬于高大喬木，在防治藥劑劑型的選擇上會更傾向于煙霧劑，但隨著植保無人機的使用，藥劑劑型不再是限制因素。甲霜靈（苯基酰胺類殺菌劑）、烯酰嗎啉（羧酸酰胺類）、氰霜唑（磺胺咪唑類）、霜脲氰（氰基乙酰胺類）和嘧菌酯（甲氧基丙烯酸類）是生產上廣泛用于防治卵菌病害的內吸性殺菌劑，單獨使用一類殺菌劑時，病原菌易對其產生抗藥性，導致病害防治失敗，不同類型殺菌劑混合使用，在一定程度上可以降低病原菌產生抗藥性的機率[32]。本研究測定了15種生產上常用于防治卵菌綱的殺菌劑對橡膠樹季風性落葉病病原菌的抑菌活性，結果表明，這幾種殺菌劑的復配劑對P. botryosa菌絲生長均具有較好的抑制效果，但250 g·L-1嘧菌酯懸浮劑的抑菌效果較差，這可能是由于嘧菌酯的主要作用是抑制孢子萌發及游動孢子的釋放和游動，對病害治療作用差[33]。本研究表明，0.3%四霉素水劑對該病原菌的菌絲生長也具有較好的抑制效果。四霉素作為廣譜、高效、低毒的農用抗生素類生物殺菌劑，不僅可以有效防治病害，還可以誘導寄主體內防御酶活性升高，提高寄主抗病能力[34]。因此0.3%四霉素水劑對防治橡膠樹季風性落葉病具有很大的應用潛力，可作為候選藥劑單獨或與其它類型的殺菌劑混配使用。膠農由于缺乏對病害的正確認識，存在亂用、濫用藥劑的情況，例如多菌靈是其經常使用的藥劑，但多菌靈對卵菌無活性。因此，加強基層膠農或藥劑銷售商對病害病原菌種類的認識、選擇適合的防治藥劑也是今后亟需開展的工作。

本研究表明，48%烯?！で杷驊腋?、80%烯酰嗎啉水分散粒劑、30%烯?！ぜ姿`水分散粒劑、30%氟吡菌胺·甲霜靈水分散粒劑、35%烯?！に迩钁腋?、0.3%四霉素水劑可用作簇囊疫霉引起的橡膠樹季風性落葉病防治的備選藥劑，為田間藥劑防治提供了理論依據，但藥劑的最終防效還有待田間試驗進一步驗證。