凝血酶調節蛋白聯合中性粒細胞肽?；彼崦搧啺泵?預警非瓣膜性房顫合并急性缺血性腦卒中患者缺血事件復發*

任杰,王競,門劍龍,張鵬(.天津市西青醫院檢驗科,天津 300380;.天津醫科大學總醫院精準醫學中心,天津 30035)

非瓣膜性心房顫動(nonvalvular atrial Fibrillation,NVAF)是引發急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)的重要風險誘因[1],不但可造成血管栓塞,而且在短時間內易再次形成血栓,從而導致殘疾或死亡的臨床后果。目前,臨床上對AIS患者血栓復發的早期識別能力仍存在明顯不足,尤其缺乏利用生物標志物對腦血管缺血事件的預警研究。在前期研究中,我們通過血管損傷標志物對NVAF患者的缺血事件風險進行了早期預警的研究發現,血管損傷與患者的臨床轉歸密切相關[2-3]。存在的問題是,現階段可用于臨床的實驗室指標較少,尚不能滿足臨床對于NVAF相關缺血事件風險預警的需求?；诖?本研究對164例NVAF合并AIS患者的血栓調節蛋白(thrombomodulin,TM)和中性粒細胞肽?；彼崦搧啺泵?(neutrophil peptidylarginine deiminase 4,PAD4)水平進行觀察,分析水平變化特征和趨勢,探索兩項指標對于NVAF合并AIS患者缺血性事件復發的預警性能和臨床價值。

1 對象與方法

1.1研究對象 納入2020年8月至2023年2月期間于天津市西青醫院就診的NVAF合并AIS患者164例為患者組,男71例,女93例,年齡51～83歲,中位年齡67.9歲;入組患者診斷標準參照《中國急性缺血性卒中診療指南2018》[4];入組患者排除重癥感染、惡性腫瘤、心臟手術史、血液系統疾病、嚴重肝腎疾病和長期服用激素類等藥物,發病前1個月均未接受抗凝及抗生素治療。入組患者均在發病4.5 h內接受靜脈溶栓。收集入組患者在治療前和接受治療7 d時的外周靜脈血,第2次采集血液樣本后,對入組患者進行為期90 d的隨訪,起止時間為2020年8月1日至2023年5月31日,以患者再次發生AIS及相關死亡為終點事件(缺血事件復發),患者組在隨訪期內有25例患者再次發生AIS,其中6例患者死亡。根據終點事件,將患者組進一步分為缺血事件復發組25例,未復發組139例。本研究通過天津市西青醫院倫理委員會審批(批準文號:XQYYLL-2020-11)。

1.2標本采集、處理與檢測 收集入組患者在治療前和接受治療7 d時的外周靜脈血,以2 664×g離心15 min,枸櫞酸鈉抗凝管中的乏血小板血漿樣本用于TM檢測,分離膠促凝管中的血清樣本用于PAD4檢測。采用Shine i2900型全自動化學發光免疫分析儀及配套試劑盒(化學發光免疫分析法,廣州萬孚生物公司)測定血漿凝血酶調節蛋白(thrombomodulin,TM)水平;采用Freedom EVO Clinical免疫分析加樣儀和Sunrise酶標儀(瑞士TECAN公司)及PAD4測定試劑盒(武漢酶免科技生物有限公司)檢測血清PAD4水平。上述兩項實驗均嚴格按照操作說明書進行。

1.3統計學分析 采用SPSS 18.0統計軟件進行數據分析,以M(P25,P75)表示偏態分布的數據;以Kruskal-WallisH檢驗進行多組間比對,以Mann-WhitneyU檢驗進行兩組間數據比對;用Friedman秩和檢驗進行同組內各時間節點數據比較;用ROC曲線分析診斷性能;用Logistic回歸進行關聯性分析;用Kaplan-Meier曲線進行生存分析,Cox比例風險回歸模型評價TM和PAD4預測患者90 d內復發風險的性能;以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1AIS患者TM和PAD4測定結果

2.1.1血漿TM測定結果 見表1。AIS患者組在治療前、后的血漿TM水平均高于健康對照組,差異有統計學意義(U值分別為682.5和2 079.5,P值均<0.001)。

表1 AIS患者血漿TM測定結果

在治療前和治療后,復發組血漿TM水平均高于未復發組,差異有統計學意義(U值分別為399.0和200.5,P值均<0.001)。

AIS患者治療后血漿TM水平低于治療前(Z=-5.546,P<0.001),未復發組治療后血漿TM水平低于治療前(Z=-6.748,P<0.001),復發組治療后TM水平與治療前間差異無統計學意義(Z=-1.386,P=0.166)。

2.1.2血清PAD4測定結果 見表2。AIS患者組在治療前、后血清PAD4水平均高于健康對照組,差異有統計學意義(U值分別為27.5和314.5,P值均<0.001)。

表2 AIS患者血清PAD4測定結果

治療前,未復發組血清PAD4水平與復發組間的差異無統計學意義(U=1 370.0,P=0.093)。治療后,復發組高于未復發組,差異有統計學意義(U=213.0,P<0.001)

AIS患者治療后血清PAD4水平低于治療前(Z=-7.888,P<0.001),未復發組治療后血漿PAD4水平低于治療前(Z=-10.229,P<0.001),復發組治療后PAD4水平高于治療前(Z=-3.996,P<0.001)。

2.2TM和PAD4預測AIS患者90 d隨訪期內缺血事件復發的ROC 見圖1。治療前,ROC曲線下面積(AUCROC)為0.885(95%CI:0.830～0.941),當血漿TM臨界值為13.04 TU/mL時,診斷敏感性為84.0%,特異性為74.1%。治療后,AUCROC為0.909(95%CI:0.860～0.957),當血漿TM臨界值為10.52 TU/mL時,診斷敏感性為92.0%,特異性為74.8%。

治療前,AUCROC為0.606(95%CI:0.500～0.711),當血清PAD4臨界值為11.45 ng/mL時,診斷敏感性為84.0%,特異性為39.6%。治療后,AUCROC為0.939(95%CI:0.899～0.979),當血漿PAD4臨界值為10.00 ng/mL時,診斷敏感性為96.0%,特異性為62.6%。

采用TM聯合PAD4進行評估,結果顯示,治療前的AUCROC為0.877(95%CI:0.814～0.939);治療后的AUCROC為0.976(95%CI:0.955～0.997)。

2.3AIS患者治療后TM和PAD4水平與臨床病生理因素的多因素Logistic回歸分析 表3顯示,用Logistic回歸進行多因素分析,AIS患者治療后的TM、PAD4水平均與性別和血管疾病無顯著相關性(P>0.05),與充血性心力衰竭和高血壓有顯著相關性(P<0.05)。

表3 TM和PAD4水平與臨床病生理因素的Logistic多元分析

2.4生存分析 見圖2。與低于臨界值的AIS患者比較,治療后血漿TM水平高于臨界值(10.52 TU/mL)的患者與在90 d隨訪期內缺血事件復發的累積風險概率顯著增高(Log-rankχ2=20.597,P<0.001),治療后血清PAD4水平高于臨界值(≥10.00 ng/mL)的患者在90 d隨訪期內缺血事件復發的累積風險概率顯著增高(Log-rankχ2=5.836,P=0.016),TM聯合PAD4在90 d隨訪期內缺血事件復發的累積風險概率顯著增高(Log-rankχ2=27.786,P<0.001)。

注:綠色虛線為高于臨界值,藍色實線為低于臨界值;A、B、C分別為TM、PAD4、TM聯合PAD4。圖2 AIS患者在治療后90 d內缺血事件復發的累積風險概率

2.5Cox回歸分析 見表4。對AIS患者進行治療后90 d的隨訪,用Cox回歸模型分析TM和PAD4預測患者缺血事件復發的HR值為1.335和1.162,提示單獨使用TM或PAD4均不能獨立預測隨訪期內的缺血事件復發風險。將TM與PAD4聯合評估,HR值為1.397(P=0.036),表明兩項指標聯合分析可有效預測隨訪期內缺血事件復發風險。

表4 Cox回歸分析TM和PAD4預測AIS患者治療后90 d內缺血事件復發

3 討論

TM是一種表達于血管內皮細胞表面的單鏈跨膜糖蛋白,有多個結構域,參與調控凝血、免疫等多種生物過程,對維持人體器官正常功能具有重要意義[5]。在生理狀態下,TM通過與凝血酶形成復合物,激活蛋白C以滅活凝血因子Ⅴa和Ⅷa,下調凝血酶生成以實現抗凝效應。游離于血漿中的TM是一類結構不完整的可溶性TM片段,其血漿濃度顯著增高多見于嚴重的血管損傷[6]。中性粒細胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps,NETs)是一種由顆粒衍生蛋白修飾的DNA支架組成的胞外網狀結構,具有促炎和抗炎雙重作用,但NETs的過表達對機體的損害超過其保護作用。NETs的抗炎特性與血栓形成密切相關,有研究顯示其過量生成在AIS的發病機制中起關鍵作用[7],幾乎在所有類型的AIS患者的血栓栓子中均可發現NETs結構,在NVAF合并AIS的致病過程中也發揮重要作用,同時NETs生成或清除不力對腦卒中后的血管重建和血管修復產生負面影響[8]。PAD4是NETs形成的關鍵酶,在NETs表達過程中參與誘導組蛋白瓜氨酸化[9],因此血清中PAD4的含量可反映外周血中NETs的生成水平。

本研究顯示,AIS患者發病的急性期,血漿TM水平顯著增高,提示由于NVAF所致血流動力學異常引發較為嚴重的血管損傷,導致TM從血管內皮細胞膜表面大量脫落到血漿中。進一步的分析顯示,在隨訪期內復發缺血事件的患者,其在治療前階段時血漿TM水平即顯著高于未復發的患者;在治療后,隨訪期內未復發缺血事件患者的血漿TM水平顯著降低,而復發缺血事件的患者則與治療前無顯著差異,仍處于高水平。上述特征表明,由于持續的血管損傷是NVAF患者發生AIS的重要驅動因素和病理基礎,而高水平的血漿TM則是血管內皮細胞受損的標志,因此如患者血漿TM持續處于高水平,提示血管損傷趨勢并未得到緩解。

血清PAD4水平的顯著增高與血管損傷后的NETs相關炎性過程密切相關。有研究表明,外周血中的NETs相關生物標志物水平在動脈血管病變時發生顯著改變,并與病情嚴重程度、臨床結局顯著相關[10]。在研究中發現,血清PAD4水平在AIS發病的急性期(治療前)顯著增高,在治療后階段,隨訪期內未復發缺血事件的患者的PAD4水平出現顯著降低,而隨訪期內復發缺血事件的患者則較治療前水平更高,則進一步表明血管壁炎性損害持續存在,并參與構成了血栓前狀態和缺血事件復發的病理基礎。

ROC曲線分析顯示,以治療前的血漿TM水平對隨訪期內缺血事件的預警性能優于PAD4;在治療后,TM和PAD4預測隨訪期內缺血事件均具有良好的診斷性能,其原因可能與TM和PAD4對于血管損傷的反應機制不同有關。在血栓形成的急性期,血管內皮的顯著損傷既是血栓形成驅動因素,同時在血栓形成后仍可進一步加重,TM作為敏感反映血管內皮受損的標志物,其血漿水平變化伴隨疾病發生發展的全過程;PAD4作為NETs的標志物,雖然在血管壁炎性病變過程中存在上調表達的趨勢,但NVAF患者在AIS發生的急性期,其缺血事件主要為心源性栓子脫落所致,因此PAD4的表達水平與該階段病理過程的關聯性較弱,但在隨訪期內,PAD4基于其在血管重建過程中的角色,對于缺血事件復發的預警性能略優于TM。Logistic回歸分析也顯示,TM和PAD4與充血性心力衰竭和高血壓等臨床因素均有顯著關聯性,說明兩項指標的變化趨勢受到多種與血管損傷相關因素的影響和制約,本研究將TM和PAD4進行聯合ROC曲線分析,進一步提高了在隨訪期內缺血事件的預警性能。

生存分析和Cox回歸分析結果顯示,與低于臨界值的患者比較,治療后TM水平或PAD4水平仍高于臨界值的患者與在隨訪期內缺血事件復發的累積風險概率顯著增高,但兩項指標的單獨評估時,其HR值為1.335和1.162(P值均>0.05),提示均不能具有獨立預測缺血事件復發風險的能力。本文將TM與PAD4做聯合評估,其HR值為1.397(P<0.05),表明兩項指標聯合分析可有效預測AIS患者的缺血事件復發風險。

綜上所述,NVAF并發AIS患者由于存在嚴重的血管損傷,其TM和PAD4水平顯著增高,并隨病情發展而改變,通過對上述兩項指標的動態監測和聯合評估,可有效預警AIS患者缺血事件復發的風險,為臨床早期識別和及時干預提供依據。