2種品牌糞便血紅蛋白和轉鐵蛋白膠體金免疫層析試紙檢測限和檢出率比較*

王娟,孫婷婷,武愛文,冷家驊,劉汝鋒,王悅,徐國賓(北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所,惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室,.檢驗科,.胃腸腫瘤中心,北京 100142)

糞便血紅蛋白(hemoglobin,Hb)是輔助消化道出血診斷的標志物,多采用膠體金免疫層析法進行定性檢測。具有更高檢測靈敏度的糞便血紅蛋白免疫學定量檢測(fecal immunological test,FIT)被各國指南推薦用于結直腸癌篩查[1]。Hb可經胃黏膜分泌的消化酶和腸道細菌的分解被降解,免疫反應性減弱甚至導致檢測結果呈假陰性[2]。轉鐵蛋白(transferrin,Trf)不易被胃酸和腸道細菌降解,在糞便中的穩定性高于Hb。文獻報道糞便Hb與Trf聯合定性檢測的陽性率顯著高于Hb單檢[3]。糞便Hb和Trf聯檢對于消化道出血的篩檢率高,受到推薦。糞便Hb和Trf定性與定量檢測試劑品牌多,其檢測靈敏度影響糞便檢出的陽性率。本研究旨在了解幾種膠體金定性試紙檢測下限是否與說明書標示值相符,觀察不同品牌試紙檢測糞便樣本Hb和Trf的陽性率,比較不同品牌試紙單檢和聯檢的陽性率與檢測一致性。

1 材料與方法

1.1糞便樣本收集 連續收集2022年7月至9月北京大學腫瘤醫院住院患者送檢的糞便樣本268例,男144例,女124例,年齡20～81歲,平均年齡56.7歲。本研究獲得北京大學腫瘤醫院倫理委員會批準(批件號:2022YJZ57)。入選患者于入院前均簽署樣本可用于臨床研究的同意書。糞便樣本留取后2 h內完成檢測。

1.2Hb和Trf標準液配制

1.2.1Hb、Trf儲存液配制 取比色法測定Hb濃度為100 g/L的人全血樣本1 mL,加入蒸餾水破壞紅細胞并定容至100 mL,配制得1 g/L Hb儲存液[4]。取免疫比濁法測定Trf濃度為2 g/L的血清樣本2 mL,加入生理鹽水定容至100 mL,配制得40 mg/L Trf儲存液。

1.2.2膠體金試紙檢測限確定 用各廠家試劑盒配套的樣本稀釋液倍比稀釋儲存液配制Hb、Trf應用液。稀釋后的Hb、Trf應用液濃度分別為1 μg/mL、0.8 μg/mL、0.6 μg/mL、0.4 μg/mL、0.2 μg/mL、0.15 μg/mL、0.1 μg/mL、0.05 μg/mL、0.01 μg/mL以及400 ng/mL、300 ng/mL、200 ng/mL、100 ng/mL、40 ng/mL、20 ng/mL、10 ng/mL、8 ng/mL。使用不同品牌的Hb和Trf試紙平行檢測不同濃度應用液10次,檢測結果均為陽性的Hb或Trf最低應用液濃度定義為該試紙的檢測下限。

1.3統計學分析 用SPSS 12.0統計軟件進行統計學分析。計數資料以例數或百分比表示,組間率的比較采用配對卡方檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1檢測限 Hb濃度≥150 ng/mL,Trf濃度≥40 ng/mL時,A、B 2種品牌試紙10次檢測結果均為陽性。Hb濃度<50 ng/mL,Trf濃度<10 ng/mL時,A、B 2種品牌試紙10次檢測結果均為陰性。A、B 2種品牌試紙的Hb檢測限為150 ng/mL,Trf為40 ng/mL。檢測結果見表1。

表1 2種品牌膠體金試紙檢測不同濃度Hb、Trf溶液結果(n=10)

2.2糞便樣本Hb和Trf檢出率 用A、B 2種品牌試紙同時檢測268例糞便樣本Hb和Trf,結果見表2。A品牌試紙Hb單檢陽性率(42.5%)和聯合Trf檢測陽性率(60.1%)均高于B品牌(28.4%、55.2%)(P<0.05);2種品牌試紙Hb、Trf聯合檢測陽性率均高于單檢,差異有統計學意義。雖然A、B 2種品牌試紙Hb、Trf檢測下限相同,但患者糞便樣本檢測陽性率有差異。2種品牌試紙Hb和Trf檢測結果均為+/+、+/-、-/+和-/-的總一致性為80.2%(215/268)。結果表明2種品牌Hb和Trf完全一致率未達到預期值(如90%以上)。進一步觀察發現,2種品牌試紙Hb、Trf陽性一致率分別為65.2%(75/115)和88.3%(121/137)。B品牌Hb檢出率低是2種品牌檢測總一致性低的原因。

表2 2種品牌膠體金試紙檢測糞便樣本Hb和Trf的一致性(n=268)

A品牌試紙Hb/Trf +/+、+/-、-/+占總樣本量(268例)的比例分別為29.9%、12.7%和17.5%,總陽性率為60.1%;B品牌試紙Hb/Trf +/+、+/-、-/+占比分別為22.0%、6.3%和26.9%,總陽性率為55.2%。2種品牌Hb、Trf聯檢陽性率差值為4.9%(60.1% vs 55.2%),低于2種品牌Hb檢測陽性率的差值14%(42.5% vs 28.4%),說明聯合糞便Trf檢測可提高檢出的總陽性率并減少消化道出血的漏檢率。

A品牌Hb/Trf -/-的107例糞便樣本中,B品牌Hb/Trf +/-、-/+分別有1例和7例,僅占7.5%(8/107)。B品牌Hb/Trf -/-的120例糞便樣本中,A品牌Hb/Trf +/+、+/-、-/+分別有2例、16例和3例,占17.5%(21/120)。說明檢出陽性率有差異的2種品牌均存在漏檢情況,漏檢樣本可能多為Hb、Trf含量較低的樣本。

3 討論

消化道出血原因多。惡性腫瘤相關的消化道出血原因包括腫瘤浸潤出血(23.8%)、消化道靜脈曲張(19.7%)、消化道潰瘍(16.3%)和消化道糜爛(10.9%)等[5-6]?？鼓[瘤治療(包括手術、放療、化療、免疫治療、靶向治療等)均有可能導致腫瘤壞死破潰、潰瘍、感染或發生炎性腸病、門靜脈高壓,從而導致消化道出血[6-7]。對于懷疑有急性消化道出血的患者,應進行多學科會診(MDT)評估,并進行緊急處理,對于慢性消化道出血者也應明確病因。消化道出血的臨床表現因出血部位及出血速率而不同,輕者可無癥狀或伴有貧血及血容量減少,嚴重者可出現休克甚至危及生命,及時發現早期出血尤為重要。糞便Hb檢測是廣泛應用的快速篩查消化道出血的方法。Hb在胃腸道中的穩定性低于Trf,西京醫院郝曉柯團隊定性檢測了363例腫瘤患者糞便樣本Hb和Trf,單檢和聯檢的陽性率分別為36.1%、46.0%和55.1%[8],聯檢較Hb單檢陽性率高19.0%。本實驗也觀察到類似的結果。多項試驗結果表明Hb和Trf聯檢的確可提高消化道出血的陽性檢出率并減少部分出血的漏檢,但糞便Hb與Trf單檢和聯檢對上下消化道出血的篩檢效能仍不明確,這可能是我國部分地區糞便Trf尚未列入醫療服務項目的原因。

本研究發現實際測量的A、B 2種品牌膠體金試紙Hb、Trf檢測下限相同,均與試劑盒說明書標示靈敏度吻合,但2種品牌試紙檢測糞便樣本的陽性率有差異。我們認為這種陽性率的差異可能與膜試紙的結構和含水量影響膠體金標記抗體與檢測靶抗原復合物的遷移速度有關,也可能與不同品牌試紙膠體金標記抗體檢測抗原復合物穩定性受糞便基質影響程度不同有關。因此實現不同醫院間糞便Hb、Trf定性檢測結果的互通之路面臨很多難題。我們在選擇糞便Hb、Trf檢測試劑時,除比較說明書宣稱的檢測靈敏度外,還應用倍比稀釋的標準液驗證標示的檢測限,并比較臨床送檢糞便樣本的陽性檢出率。

目前已有免疫比濁、免疫熒光法定量檢測糞便Hb、Trf的試劑盒問世,定量法較膠體金檢測更敏感。觀察糞便Hb、Trf、鈣衛蛋白、乳鐵蛋白等特種蛋白質定性與定量檢測對于各種消化道腫瘤和消化道出血的篩查效能,明確糞便特種蛋白定量檢測是否有助于急慢性消化道出血量的判斷及其對消化道出血干預的影響是有意義的,需要進一步的研究。