貂熊線粒體基因組全序列分析及其系統進化

張士芳，魏 丹，郭 媛，劉應竹，路 平，劉鳳春，朱世兵

（1.黑龍江省科學院自然與生態研究所，哈爾濱，150040；2.黑龍江雙河國家級自然保護區管理局，塔河，165204）

線粒體基因組是線粒體中的遺傳物質，參與蛋白質合成，能自主轉錄、復制和翻譯成蛋白質，具有進化速率快、分子質量小、結構簡單和母系遺傳等特點，已被廣泛應用在物種的起源、進化和系統發育研究中［1-2］，對研究物種系統進化和分類地位、物種遺傳多樣性和群體遺傳結構等也都具有十分重要的意義。

貂熊（Gulo gulo）是食肉目（Carnivora）鼬科（Mustelidae）貂熊屬（Gulo）下的唯一物種，列入國家一級重點保護野生動物名錄。貂熊是環北極型動物，分布同寒溫帶針葉林分布一致，廣泛分布在北美和歐亞大陸北部［3］。貂熊僅在中國東北大興安嶺部分區域和新疆北部阿勒泰地區有分布，種群數量估計為300 只左右［4］。由于貂熊在國內分布面積和數量均較少，屬于研究較少的物種，目前只在貂熊的種群［5-6］、生境［7-8］、食性［8］和線粒體［9-10］等方面有研究。而在歐洲和北美，對貂熊的全面研究工作都較為重視，在分布區擁有完善的保護和管理措施。貂熊與其他鼬科動物無論是形態還是習性差異都較大，分類地位也一直存在爭議。貂熊和貂屬動物雖同屬于鼬科，但由于生態和形態差異，長期以來被認為是遠親，分屬于不同的亞科［11］，而部分形態學和行為學觀察［12］及分子研究［13-14］則認為貂熊和貂屬（Martes）動物親緣關系更為密切。本研究對中國的貂熊進行線粒體基因組全序列測定和生物信息學分析，并結合GenBank 中其他21 種鼬科動物線粒體基因組數據，對鼬科部分物種的系統發生關系進行研究，以期為貂熊的分類、進化和系統發育提供基因依據。

1 材料與方法

1.1 材料

貂熊DNA 提取于貂熊血液，樣品來自救助于大興安嶺地區飼養在齊齊哈爾龍沙動植物園的1 只雌性個體。采后肢靜脈血液5 mL 放置于含抗凝劑的采血管內，冰箱內4 ℃保存?；蚪MDNA 的提取參考從哺乳動物血液中提取DNA 的方法［15］，使用酚-氯仿法提取基因組DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。-20 ℃保存備用。

選取GenBank 已公布的日本貂（Martes melampus）（登錄號：AB291076）和分布于瑞典的貂熊（登錄號：AM711901）線粒體基因組全序列，設計可覆蓋貂熊線粒體基因組全序列引物。PCR 擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳回收，純化后利用ABI 3730xl 測序儀測序。

1.2 序列分析

測序得到的序列通過Chromas 和DNAman（LynnonBiosoft，Canada）分析，人工校正后拼接，最后得到貂熊線粒體基因組全序列，通過與近緣物種線粒體基因組比較及通過ClustalX 和DNAman 軟件分析定位蛋白編碼基因、tRNA 基因、rRNA 基因和非編碼控制區。DNAstar統計序列全長、堿基含量等信息。利用在線軟件OGDRAW（http：//ogdraw.mpimp-golm.mpg.de/index.shtml）繪制貂熊線粒體基因結構圖。使用RNAfold 在線預測網站RNAfold web server（http：//rna.tbi.univie.ac.at）對rRNA 二級結構進行預測。

1.3 系統進化分析

在NCBI數據庫，通過BLAST相互比對，下載21種相關鼬科動物線粒體基因全序列，結合本研究測定的貂熊線粒體基因全序列，組成22種鼬科動物序列庫，以棕熊（Ursus arctos）為外群，序列信息見表1。通過MEGA11采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）和最大似然法（maximum likelihood，ML）構建系統進化樹，其中NJ 法經Bootstrap 法檢驗，共1 000 次循環，根據置信度選擇模型maximum composite likelihood。ML 進化樹經Bootstrap 法檢驗，共1 000 次循環，比對后最優模型為GTR+G+I，進化樹模型選擇general time reversible model，點位進化率（rates among sites）選擇G+I，其他參數設為默認。

表1 進化分析物種的線粒體全基因組序列信息Tab.1 Information on samples for phylogenetic analysis

2 結果

2.1 基因組組成與基因排列

獲得的貂熊線粒體基因組全序列全長為16 575 bp，序列提交NCBI 基因數據庫，GenBank 登錄號為KR611313。與大多數哺乳動物相似，貂熊的線粒體基因組成包括13種蛋白質編碼基因、22種轉運RNA（tRNA）、2 種核糖體RNA（rRNA）和1 個非編碼控制區（D-loop）。在整個基因組中只有ND61個蛋白質編碼基因和tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Glu和tRNA-Pro8 個tRNA基因位于L鏈，其余基因均位于H鏈（圖1）。

圖1 貂熊線粒體結構Fig.1 Mitochondria structure of wolverine

整個貂熊線粒體基因排列十分緊密，在編碼區37 個基因之間共有11 個間隔，間隔總長度為33 bp，占DNA 總長的0.20%。7 個重疊區（75 bp）占DNA總長的0.45%，在tRNA-Ile與tRNA-Gln，COX1與tRNA-Ser，ATP8與ATP6，ATP6與COX3，ND4L與ND4，ND5與ND6，以及tRNA-Thr與tRNA-Pro之間，最大重疊為43 bp，位于ATP8與ATP6之間（表2）。在tRNA-Asn與tRNA-Cys之間有1 個長度為33 bp 的莖環結構保守序列Rep Origin，其二級結構如圖2 所示，柄部有3個核苷酸，莖部由8對互補的堿基組成，環結構由14個核苷酸組成。

圖2 貂熊Rep Origin的二級結構Fig.2 The Rep Origin secondary structure of wolverine

表2 貂熊線粒體基因組組成Tab.2 Gene contents of wolverine mitochondrial genome

2.2 核苷酸組成

由表3 可知，貂熊mtDNA 4 種堿基含量分別為：A=32.18%、G=14.26%、T=26.75%和C=26.81%；AT含量（58.93%）＞CG 含量（41.07%），存在顯著的AT富集。蛋白質編碼基因包括3 782 個密碼子，其AT含量為58.58%，與全基因組相似，密碼子的堿基組成是第3位點密碼子AT含量最高（60.80%），且明顯高于D-loop 區AT 含量（55.62%），而密碼子第1位點和第2位點的AT含量均低于全序列。

表3 貂熊線粒體基因組核苷酸組成Tab.3 Nucleotide composition of wolverine mitochondrial genome

2.3 蛋白質編碼基因

貂熊線粒體基因組同其他脊椎動物相同，有13 個蛋白質編碼基因，包括1 個細胞色素b基因（Cyt b），2個ATP酶亞基基因ATP8和ATP6，3個細胞色素氧化酶亞基基因，即COX1、COX2和COX3，以及7 個NADH 脫氫酶亞基基因ND1、ND2、ND3、ND4L、ND4、ND5和ND6。貂熊蛋白質編碼基因總長度為11 346 bp，編碼3 739 個氨基酸，堿基組成A=31.01%、G=13.16%、T=27.57% 和C=28.27% ；AT 含量（58.58%）＞CG 含量（41.42%），與全序列堿基組成相似。在貂熊蛋白質編碼基因中，H鏈上有5個閱讀框重疊，COX1和tRNA-Ser有3個重疊，ATP8和ATP6有43 個重疊，ATP6和COX3有1 個重疊，ND4L和ND4有7 個重疊，ND5和ND6有17 個重疊，與紫貂（Martes zibellina）線粒體基因組非常相似［16］，僅COX1和tRNA-Ser間的重疊數不同。

在貂熊的13 種蛋白編碼基因中，共有4 種起始密碼子，ND6以TTA為起始密碼子，ND3以ATA為起始密碼子，ND2和ND5兩個蛋白質基因均是以ATT為起始密碼子，其余9 個蛋白質編碼基因COX1、COX2、COX3、ATP6、ATP8、ND1、ND4、ND4L和Cyt b均以ATG 為起始密碼子，具有明顯的多樣性。終止密碼子方面，貂熊的13個蛋白質編碼基因中，6個蛋白質編碼基因COX1，COX2、ATP8、ATP6、ND4L和ND5以TAA 為終止密碼子，Cyt b以TGA 為終止密碼子，這7 種蛋白質編碼基因具有完全終止密碼子，其余6 個蛋白質編碼基因ND1、ND2、COX3、ND3、ND4和ND6均以不完全終止密碼子T 為終止密碼子（表2）。不完全終止密碼子T 的使用頻率也比較高。在已知的鼬科動物中，日本貂出現不完全終止密碼子4 次，紫貂有7 次，而貂熊有 6 次，使用較頻繁。在其他貂屬動物線粒體DNA中，使用T或TA的不完全終止密碼子的現象也十分常見［17］，其3'端通常與tRNA緊密相連，甚至發生重疊，通過在3'端添加Poly A 來完成轉錄過程。

2.4 tRNA

tRNA 即轉運RNA（transfer RNA），貂熊線粒體基因組包括22 個tRNA 基因（表2），長度為61～75 bp，排列順序與其他鼬科動物相同，其中tRNAGln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNASer、tRNA-Glu和tRNA-Pro由L 鏈編碼，其余14 種tRNA均由H鏈編碼。

對貂熊22 個tRNA 基因的二級結構進行預測，結果顯示除了tRNA-Lys二氫尿嘧啶環缺失外，其余21 個tRNA 基因均為標準的三葉草二級結構。部分tRNA 基因的二級結構見圖3。在22 個tRNA 基因二級結構中出現了35 處堿基錯配的情況，其中U—G錯配最多，有25 處，U—U 錯配5 處，A—A 錯配3 處，以及A—C 錯配2 處。通常認為這些錯配符合擺動配對原則，有利于維持tRNA二級結構穩定［18］。

圖3 貂熊部分tRNA二級結構Fig.3 Secondary structure of some tRNA of wolverine

2.5 rRNA

貂熊核糖體RNA 基因即rRNA 基因（12S rRNA和16S rRNA）長度分別為961、1 569 bp，分別位于tRNA-Phe和tRNA-Val之間，tRNA-Val與tRNA-Leu之間，2 個rRNA 基因間由tRNA-Val相隔。2個rRNA 的AT 含量分別為59.00%和59.85%，均略高于全序列含量。利用RNAfold 軟件預測12S rRNA 和16S rRNA 基因二級結構，結果顯示，rRNA 的二級結構比較復雜，形成多個復雜的莖環結構（圖4）。

圖4 貂熊rRNA二級結構Fig.4 rRNA secondary structure of wolverine

2.6 D-loop控制區

D-loop 區是線粒體DNA 上的主要非編碼區，受到的進化壓力較小，有較高的變異性，在整個線粒體基因組中屬于進化速度較快的區域［19-20］。貂熊的控制區序列長1 129 bp，位于tRNA-Phe和tRNA-Pro之間。堿基組成A=30.12%、G=14.35%、T=25.51%、C=30.03%；AT含量（55.62%）＞CG含量（44.38%）。

2.7 系統進化

在NCBI數據庫中通過BLAST比對，下載21種相關鼬科動物線粒體基因全序列組成基因組全序列數據，以棕熊為外群物種，分別采用鄰接法（NJ法）和最大似然法（ML法）構建鼬科22種動物的進化樹（圖5，圖6）。結果顯示，2種方法構建的系統進化樹的拓撲結構基本相似，且各個節點都具有較高支持率。外群棕熊單獨一支，位于最底部，22種鼬科動物分為5個大支，鼬屬（Mustela）的黑足鼬（M.nigripes）、林鼬（M.putorius）、黃鼬（M.sibirica）、香鼬（M.altaica）、伶鼬（M.nivalis）、白鼬（M.erminea）和黃腹鼬（M.kathiah）聚為一支；鼬屬的長尾鼬（M.frenata）同美洲水鼬屬（Neovison）的美洲水鼬（N.vison）聚為一支；水獺亞科（Lutrinae）的水獺（Lutra lutra）和海獺（Enhydra lutris）則構成另一分支；狗獾屬（Meles）的狗獾（M.meles）和豬獾屬（Arctonyx）的豬獾（A.collaris）聚為一支；紫貂和松貂（Martes martes）先聚為一支，后依次與日本貂、美洲貂（M.americana）、石貂（M.foina）、黃喉貂（M.flavignla）、貂熊和漁貂（M.pennanti）聚合形成一個大的分支。2種方法測得的結果均顯示，貂熊同漁貂和黃喉貂的關系較近。這同Marmi等［21］基于線粒體Cyt b基因數據對貂類系統發育進行研究時所獲結果相似。張洪海等［22］通過對線粒體DNA控制區全序列數據的分析也確定了鼬亞科（Mustelinae）和貂熊屬的分類地位；此外，徐純柱等［16］基于部分線粒體控制區基因序列構建的貂類進化樹，顯示貂熊同漁貂和黃喉貂親緣關系最近。

圖5 22種鼬科動物NJ進化樹Fig.5 NJ evolution tree of 22 species of Mustelidae

圖6 22種鼬科動物ML進化樹Fig.6 ML evolution tree of 22 species of Mustelidae

3 討論

鼬科是食肉目中一個多樣性較高的科，各成員之間無論是形態，還是生活習性都有很大差異，多數鼬科動物是動作敏捷的小型食肉動物，也有體型略大的，如貂熊和海獺等，既有陸棲動物，也有水棲或半水棲動物。而貂熊是體型最大的鼬科動物，并且是貂熊屬下唯一種，是一種特化的物種，能夠捕食大中型動物且有腐食性。貂熊分類地位和親緣關系的研究具有重要意義，研究人員已從不同方向對其進行了研究。依據形態學研究，Miller［23］認為，雖然貂熊齒形與鼬亞科其他屬動物相似，但是它的牙齒十分粗鈍，上裂齒特別強大，而小前臼齒在上下頜緊閉時不能接觸，加上半蹠行性的足等特點，這些差異足以構成亞科特征。而Ellerman 等［24］認為，貂熊齒形和頭骨結構等主要特征與鼬科各屬動物相近，認為應該將其歸并在鼬科內。目前，后一種觀點得到了較多支持。

隨著測序技術越來越先進，研究人員可以通過GenBank 簡便快速獲取大量的分子數據，這對系統發育學研究非常有利，因為更多的分類單元采樣可以提高系統發育的準確性［25］。本研究基于mtDNA全序列構建的系統發育樹支持貂熊歸為鼬科動物的觀點。采用NJ 和ML 法構建的鼬科22 種動物的進化樹基本一致，表明結果可靠。進化樹顯示貂熊先同鼬科貂屬的7 種動物聚成一支，再與鼬屬動物和豬獾、狗獾聚合，說明貂熊同貂屬動物進化關系較近。2 種進化樹均顯示貂熊系統分化節點位于黃喉貂和漁貂之間。這也同近年來分子系統學研究認為貂熊同貂屬的關系更近，應該歸為貂亞科（Martinae）［26］或者貂熊亞科（Guloninae）［27-30］的結論一致。貂屬動物的進化樹中，紫貂和松貂先聚為一支，再與日本貂聚合，然后與美洲貂聚合，再同石貂聚合這一拓撲結構，也同形態學研究認為的松貂、紫貂、日本貂和美洲貂的親緣關系較近，而與石貂的親緣關系較遠［31］相一致。

本研究通過貂熊線粒體基因組全序列對貂熊與鼬科動物的系統進化關系進行了探索，但為了更準確地反映其系統進化關系，后續還需結合動物地理學、形態學及古生物學等方法進行綜合分析。