基于ERA-CRISPR/Cas12a-LFD的犀牛特異性檢測技術

王 瑛，張 沖，蔡一村，王鑫杰，林穎崢，馮之航，潘良文

（1.上?？萍即髮W免疫化學研究所，上海，201210；2.昆明海關技術中心，昆明，650100；3.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心，上海，200135；4.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室深圳分中心，農業農村部農業基因數據分析重點實驗室，中國農業科學院（深圳）農業基因組研究所，深圳，518120）

犀牛隸屬于哺乳綱（Mammalia）奇蹄目（Perissodactyla）犀科（Rhinocerotidae），包括白犀（Ceratotherium simum）、黑犀（Diceros bicornis）、印度犀（Rhinoceros unicornis）、爪哇犀（Rh.sondaicus）和蘇門答臘犀（Dicerorhinus sumatrensis），目前均被列入CITES 附錄Ⅰ，白犀指名亞種（Ceratotherium simum simum）（僅南非和斯威士蘭種群）被列入附錄Ⅱ。犀牛種群目前面臨的主要威脅是人類的開發活動導致其棲息地減少和碎片化，同時因其角制品在傳統醫學［1-3］和工藝品［4-5］市場上具有重要價值，假冒［6］、盜獵和走私行為［7］屢禁不止。為保護犀牛，提高打擊非法活動的有效性，開發一種能夠快速檢測犀牛DNA 的技術非常必要。目前，基于遺傳信息的物種鑒定技術［8］一般需要在有較高環境和儀器條件的分子生物學實驗室中進行，而新興的酶促重組等溫擴增（enzymatic recombinase amplification，ERA）［9］和基于CRISPR/Cas12a 系統的核酸檢測技術［10-13］提供了一種全新的檢測策略，甚至可以在野外條件下完成特異性物種檢測鑒定?；谶@一策略，本研究建立了一種基于ERA-CRISPR/Cas12a-LFD［14-16］的犀牛特異性核酸快速鑒定技術，能夠快速準確地鑒定犀牛DNA。該技術基于3 個嚴格相互制約的特異性限制，包括ERA的引物特異性、crRNA特異性識別靶基因序列及外源DNA 上的特殊PAM 位點與crRNA 匹配［17-18］機制。這種“三位一體”的特異性要求增加了物種特異性識別限制，從而提高了檢測的準確性和有效性。

1 材料與方法

1.1 樣品準備

使用包括從本地超市或電商平臺購買的肉類樣本及保存在上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心實驗室的野生動物核酸樣本，均經過一代測序鑒定確認物種信息（表1）。核酸提取試劑使用美國OMEGA公司的Mag-Bind?Viral DNA/RNA 96 Kit，核酸純化使用普洛麥格（北京）生物技術有限公司的Wizard?Genomic DNA Purification Kit，普通PCR 采用寶生物工程（大連）有限公司的PremixTaq?（ExTaq? Version 2.0），核酸定量使用美國通用醫療公司的GE NanoVue Plus 超微量分光光度計和賽默飛世爾科技（中國）有限公司的Qubit dsDNA BR Assay Kit 核酸定量試劑盒，測序選擇Illumina MiSeq 高通量測序平臺和相關試劑［19］。人工合成了白犀（Y07726.1）、蘇門答臘犀（FJ905816.1）、黑犀（FJ905814.1）、爪哇犀（FJ905815）［20］和印度犀（X97336.1）［21］的靶基因片段，并克隆至pUC57 載體。為了使用數字PCR 精確定量質粒的絕對拷貝數，在人工合成時加入標簽序列。

表1 特異性動物物種核酸樣本Tab.1 Species-specific animal nucleic acid samples

1.2 試劑與儀器

核酸釋放劑（NR201）、ERA 基礎型核酸擴增試劑盒（KS101）、側向流試紙條（CRISPR，TS104）均購自蘇州先達基因科技有限公司；EnGen?Lba Cas12a（Cpf1）購自美國New England Biolabs公司。

快速等溫擴增儀Genie Ⅲ，英國OptiGene 公司；VeritiTM96 梯 度PCR 儀，美 國Applied Biosystems 公司；NanoVue Plus 超微量分光光度計，英國GE 公司；Invitrogen Qubit?2.0 熒光定量儀，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Life ViiATM7 實時熒光定量PCR儀，美國Applied Biosystems 公司；Illumina MiSeq 高通量測序儀，美國Illumina公司。

1.3 ERA引物和crRNA設計

選擇犀牛12S 核糖體RNA 基因（12S ribosomal RNA，GenBank：MF066643.1）作為ERA 擴增靶基因［22］。首先，通過序列比對確定了一個283 bp（654～937 bp）的特定區域，并在該區域內尋找候選PAM 位點（TTTV，V=G or C or A），利用在線設計軟件Cas-Designer（http：//rgenome.net/cas-designer/）［23-24］設 計與PAM 位點匹配的crRNA。根據ERA 引物設計原則，使用Applied Biosystems 公司的Primer Express v3.0 在PAM 位點和crRNA 的上下游區域設計犀牛特異性ERA 引物。引物和crRNA 均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表2。

表2 ERA引物和crRNA序列Tab.2 ERA primers and crRNA sequences

1.4 ERA-CRISPR/Cas12a-LFD

采用基于ERA 技術的核酸擴增試劑盒（蘇州先達基因科技有限公司）擴增靶基因片段。ERA 反應在50.0 μL的體系中進行，包括20.0 μL溶解劑，正、反向引物（10 μmol/L）各2.5 μL，2.0 μL DNA 模板，并用ddH2O補足48.0 μL混勻后，在反應管蓋上加入2.0 μL激活劑（同步激活反應），小心關閉管蓋，離心使激活劑進入預混液中，快速將反應管置于等溫擴增儀中或腋下，孵育5 min。取2.0 μL ERA 擴增產物加入到CRISPR/Cas12a-LFD 檢測反應體系。各組分含量：250.0 nmol/L Cpf1 1.0 μL，25.0 pmol/L ss-DNA（FAM-Biotin）探針1.0 μL，1.0 μmol/L crRNA 1.0 μL 和2.0 μL NEBufer 3.1（100 mmol/L NaCl，50.0 mmol/L Tris-HCl，10.0 mmol/L MgCl2，100.0 μg/mL BSA，pH7.5），總反應體系20.0 μL。在等溫擴增儀（40 ℃）或腋下孵育15 min 后，在20.0 μL 的反應產物中加入80.0 μL 雜交檢測分析緩沖液（先達）。在室溫條件下，將側向流試紙條直立插入反應液。當對照條帶（C 條帶，試紙條頂端）完全顯色后，測試帶（T 條帶，試紙條底端）上的信號可以用肉眼觀察并記錄。

1.5 特異性檢測

為評估檢測方法的特異性，使用ERA-CRISPR/Cas12a-LFD對上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心實驗室物種樣本庫中保存的18 種不同動物的特異性核酸（表1）進行檢測。對1種犀牛組織中提取的核酸（印度犀）和4種人工合成的含有犀牛靶基因序列的質粒DNA進行5種犀牛通用性檢測，以確保5種犀牛均可以檢出。核酸樣本濃度大于20.0 ng/μL，質粒樣本大于1×106拷貝/孔。每組試驗獨立重復3次，以最終確認結果。

1.6 最低檢測下限（LOD95%）測定

在本研究中，最低檢測下限（LOD95%）定義為超過95%的重復檢測樣本產生陽性結果的最低DNA拷貝數。以5 個人工合成的含有犀牛靶基因的核酸樣本為檢測模板，用QX200 微滴式數字PCR（ddPCR）系統（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）進行定量檢測。反應體系：上、下游引物各1.8 μL（終濃度為900 nmol/L），0.5 μL 探針（終濃度為250 nmol/L），10.0 μL ddPCR Master Mix（Bio-Rad，Hercules，CA，USA），4.0 μL 模板DNA（人工合成犀牛靶基因）和1.9 μL 雙蒸水（Thermo Scientific，Salt Lake City，UT，USA）。使用QX200 ddPCR 液滴發生器（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）將反應混合物分成大約2×104個獨立液滴。常規PCR 在伯樂T100?熱循環儀（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）中進行：95 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，98 ℃延伸10 min，40個循環。最后使用微滴分析儀對陽性液滴進行分析和計算，通過泊松分布分析確定樣本DNA 的絕對拷貝數［25］。精確定量的核酸樣本進行稀釋，從每個反應1×104個拷貝數開始進行連續10倍稀釋，最低拷貝數約為每個反應1拷貝。使用5個濃度梯度，每個稀釋梯度做1 個反應，分別進行3 次獨立的ERACRISPR/Cas12a-LFD 檢測，同時設置陰性對照。完成后對數據進行統計分析。

1.7 環境條件變化的穩定性驗證

與在分子生物學實驗室應用的檢測方法穩定的應用環境不同的是，本檢測方法的應用場景可能更為復雜且影響因素也可能更多。需要考慮幾個常見的影響因素，包括擴增設備、試劑用量（包括引物和擴增試劑），以及擴增條件（包括溫度和時間）。為了確定這些因素對檢測結果的不確定性變化或疊加影響，在標準檢測體系中進行如下改變：將引物添加量由標準的2.50 μL增加到2.75 μL或減少到2.25 μL；將溶解劑由20.0 μL增加到25.0 μL或減少到15.0 μL；將等溫擴增溫度由40 ℃增加到42 ℃或減少到38 ℃；在標準的5 min 擴增時間基礎上，將擴增時間增加或減少1 min?？紤]到實驗在野外環境中應用時無法使用電加熱設備，設計并測試了人體腋下溫度疊加試劑添加量變化和擴增時間的變化對檢測結果的影響程度。腋下溫度使用水銀體溫計連續測量3 次記平均值（每次腋下放置3 min 穩定后讀數）。

1.8 現場條件應用性測試

實驗室檢測和野外現場檢測場景存在許多差異，因此應用該檢測方法對實際樣本進行全流程應用測試，以評估其現場適用性。檢測使用的核酸樣本均源于海關口岸截獲的可疑動物角粉、血液、毛皮和藥品等。為了制備適用于等溫擴增反應的DNA，利用商業化試劑盒，從犀牛角粉等樣品中提取DNA，即將20 mg 犀牛角粉或其他固體樣品（約芝麻粒大?。┘尤?00 μL 的DNA 釋放劑NR201（蘇州先達基因科技有限公司），混勻后在95 ℃水浴中震蕩浸泡5 min。如果樣本為液體（如組織液、血液等），則需取15 μL 加入1.5 mL 的離心管中，再加入150 μL 的核酸釋放劑，振蕩混勻，95 ℃水浴3 min，產物直接用于后續的ERA-CRISPR/Cas12a-LFD 檢測。在4 個不同地點讓4 位檢測人員進行實際操作，以盡可能模擬真實應用場景。實驗操作人員均未接受過系統分子生物學實驗技術培訓，實驗操作地點在分子生物學實驗室外，并未刻意提前清潔操作環境。此外，對盲樣、操作說明和試劑耗材進行打包分發。實驗結束時，操作人員使用智能手機拍照并獨立填寫實驗報告，及時反饋實驗結果。

1.9 統計和再現性

由至少3 個獨立實驗產生的結果取均值，使用GraphPad Prism 7.0進行統計分析和繪圖。

2 結果

2.1 犀牛特異性ERA引物和crRNA設計驗證

使用在線生物信息學分析軟件（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對5 種現生犀牛和其他哺乳動物的核酸序列進行比對分析，選擇以犀牛線粒體12S核糖體RNA 基因作為檢測靶點設計犀牛特異性ERA引物和crRNA（圖1）。

圖1 犀牛特異性ERA引物和crRNAFig.1 Rhinoceros-specific ERA primers and crRNA

由于CRISPR/Cas12a 檢測信號的強弱依賴于crRNA 引導的靶向切割效率，這可能會受到crRNA二級結構和匹配序列的影響［26］。序列比對分析顯示，ERA 引物和crRNA 的靶向區域在5 種犀牛中高度保守（表3），存在少量突變位點（表3 中紅色字體）。

表3 犀牛特異性ERA引物和crRNA突變位點Tab.3 Rhinoceros-specific ERA primers and crRNA mutant loci

2.2 特異性檢測

特異性驗證使用5 種現生犀牛特有的核酸樣本和其他13 種哺乳動物核酸樣本（表1）進行ERACRISPR/Cas12a-LFD 檢測。結果顯示，本研究設計使用的犀牛特異性檢測方法針對5 種現生犀牛核酸樣本均出現了檢測帶而沒有出現控制帶或控制帶顯示微弱的情況；其他13 種哺乳動物核酸樣品均沒有出現檢測帶而只出現了控制帶（圖2）。在每次測試中，樣品都加入基本相同量的模板DNA，每個反應孔中加入大約1 000個拷貝的DNA，所有特異性和非特異性樣品都產生了預期的條帶信號。結果說明本研究所設計、優化和建立的特異性ERA-CRISPR/Cas12a-LFD 檢測方法可以準確識別5 種現生犀牛成分。

圖2 ERA-CRISPR/Cas12q-LFD特異性檢測Fig.2 ERA-CRISPR/Cas12q-LFD specificity assay

2.3 最低檢測下限（LOD95%）測定

利用數字PCR技術和預先添加的標簽基因對人工合成的5 種犀牛質粒進行核酸拷貝數的絕對定量檢測。經過換算和稀釋，絕對拷貝數從1.00×104拷貝/孔到1 拷貝/孔，共5 個濃度。采用該檢測方法對這5個濃度核酸樣本的檢測結果顯示（圖3），在10拷貝/孔的濃度水平，除了蘇門答臘犀和印度犀檢出陽性條帶，其他3 種犀牛核酸在這一濃度水平上均無法穩定檢出。在100 拷貝/孔的濃度水平，5 種犀牛核酸都可以穩定檢出陽性條帶。這些結果說明，該檢測方法在100拷貝/孔濃度水平可以做到全部陽性樣本的穩定檢出。因此，該檢測方法的最低檢測限（LOD95%）是10拷貝/孔。

圖3 最低檢測下限檢測結果Fig.3 Lowest detection limit test results

2.4 穩定性驗證結果

將引物和擴增試劑的添加量在標準值的基礎上進行適當增減，并將擴增溫度增加或減少2 ℃。8組實驗的檢測結果均為陽性（表4）。結果表明，即使在野外環境、實驗操作中出現一定范圍內的變化，導致實驗體系中一些試劑添加量出現增減或者溫度出現一定變化的情況下，該檢測方法仍能夠完成犀牛特異性核酸檢測。驗證實驗說明該檢測技術具有較好的穩定性。

表4 不同影響因素對檢測結果的影響Tab.4 Effect of different influencing factors on the test results

2.5 現場應用性測試結果

為了進一步縮短現場檢測時間，使用商業化的一步法DNA 快速釋放劑代替傳統的DNA 提取步驟，使該方法更適合在現場應用，在30 min的測試期間，4 名操作人員在4個不同地點進行了獨立檢測，結果一致，盲樣的檢測結果均正確。陽性信號的確認時間集中在27～30 min（表5），沒有出現超時。這些實驗結果初步證明了犀牛特異性ERA-CRISPR/Cas12a-LFD檢測方法可以成功地應用于野外環境中動物樣本現場檢測。

表5 犀牛特異性ERA-CRISPR/Cas12a-LFD現場應用檢測結果Tab.5 Rhinocerose-specific ERA-CRISPR/Cas12a-LFD field application test results

3 討論

本研究的目標是為了解決野生動物資源保護工作中野生動物物種的現場鑒定技術問題。傳統的分子生物學鑒定技術，特別是常用的實時熒光定量PCR（qPCR）技術［8］，雖然具有高特異性和高靈敏度，但對現場應用存在一定的限制，需要專業技術人員、高水平的實驗環境和復雜精密的檢測儀器［27］。因此，提出了基于ERA-CRISPR/Cas12a-LFD 技術的檢測方法以實現對犀牛源性成分的現場鑒定。

本研究建立、優化和驗證的物種特異性ERACRISPR/Cas12a-LFD 檢測方法具備現場應用所需的多項關鍵要素，突破了依賴傳統分子生物學實驗室的技術限制。與傳統的分子生物學鑒定技術相比，該檢測方法具有多項技術優勢。最突出的是對模板DNA 數量的低要求，利用CRISPR 技術的非特異性剪切活性，只需少量的模板DNA 來觸發反應并釋放信號完成識別。該方法對模板DNA 的低要求使得不需要精密變溫儀器的等溫擴增技術得以順利應用。較高的特異性也是該技術的優勢，擴增階段ERA 引物可以在反應初始就對樣本進行一次特異性篩選擴增，識別階段引入的特異性crRNA 序列不但特異性識別擴增產物上特異性靶序列，還對與其匹配的PAM 位點進行識別。這就從多個角度提供了靶基因特異性識別的多重限制，是其他檢測方法不具備的。讀取信號階段，利用LFD 技術可以在非實驗室環境中快速完成特異性信號的識別。這些新技術的創新性結合使用為現場物種鑒定提供了有力的支持，并為相關領域的研究提供了新的思路和方法。

在實際應用中，野生動物資源走私是海關日常工作中面臨的一個重要問題，特別是與瀕危野生動物有關的產品的物種鑒定，是工作中一個較大的難點。海關的分子生物學鑒定實驗室通常位于遠離海關監管的一線港口和查驗點。采樣、送樣和檢測全流程周期較長，直接影響人貨通關效率。犀牛角及其制品的走私是其中一個具有典型代表的問題。針對這一問題，快速、準確、靈敏的物種識別技術至關重要。本研究建立的犀牛特異性ERA-CRISPR/Cas12a-LFD檢測技術可以在實驗室外完成犀牛源性成分的現場鑒定。與傳統的實驗室實時定量PCR相比，該技術不僅降低了成本，還通過簡化檢測過程降低了對實驗條件的要求，展現了在野外物種鑒定方面的潛力。實驗結果表明，在較低的實驗環境下，5 個現生犀牛的核酸樣本可以被準確地顯示在試紙條上，其他哺乳動物沒有陽性條帶出現；非專業人員可以在非實驗室環境中對樣品的物種信息進行準確鑒定；全流程檢測時間是傳統實驗室檢測鑒定技術所需時間的1/4，這還不包括樣本從口岸查驗點流轉到實驗室的時間。

綜上所述，本研究成功建立了基于ERACRISPR/Cas12a-LFD 的犀牛特異性現場檢測技術，并證明其在非實驗室環境中快速靈敏地識別犀牛成分的能力。該技術具備實時檢測所需的關鍵要素，并在現場驗證實驗中展示了良好的效果；具有廣泛應用的潛力，可以應用于海關緝私、生態環境監測、生物多樣性監測和生物遺傳材料的現場篩選等領域，實現高速、高靈敏度和高精度的犀牛物種遺傳信息識別。