持久性單增李斯特菌的抗逆表型及相關功能基因的研究進展

劉欣,王真,王園,2,趙青,劉陽泰,王翔,張紅芝,董慶利*

1(上海理工大學 健康科學與工程學院,上海,200093)2(上海中僑職業技術大學 食品藥品學院,上海,201514)3(上海市疾病預防控制中心,上海,200336)

單核細胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes,LM),簡稱單增李斯特菌,是一種兼性厭氧的革蘭氏陽性桿菌,攝入被單增李斯特菌污染的食物可引起李斯特菌病,致死率高達20%～30%[1]。全球化食品生產的改變和消費者習慣的變化,傾向于最低限度加工、即食、冷藏或冷凍食品,增加了李斯特菌病的發病率[2]。在2018—2021年間,我國北京豐臺區確診了多例單增李斯特菌病患者,但食品和環境溯源調查成功率較低[3]。2018年,歐洲報道了2 549例侵襲性李斯特菌病確診病例,其中死亡病例229例[4]。對李斯特菌病暴發的流行病調查顯示,大多數病例的暴發可歸因于食品,且與食品加工環境(如食品接觸面、包裝線)的持續污染有關[5]。

單增李斯特菌能在環境中長期存在的能力與其生物被膜形成能力、消毒劑耐受性等多種抗逆表型相關[6]。單增李斯特菌可在不銹鋼等食品接觸表面形成堅固的生物被膜,增強其對理化因子、殺菌劑、抗生素等的抗性,從而使常規的清洗殺菌措施無法完全清除細菌[6-7]。其次,在消毒劑、高溫、低pH等環境的選擇壓力下,微生物可通過遺傳調節或者生理適應性進化成耐受菌株,在環境中長期存活,最終發展成為持久性菌株[8]。目前,從食品加工環境中分離出的持久性單增李斯特菌的數量逐年增加,雖已有部分研究者圍繞其表型特征進行了一些探索,但都不夠全面,單增李斯特菌在食品加工環境中持久存在的原因仍不明晰,由其污染導致的李斯特菌病暴發事件不斷發生,因此非常有必要結合現有的研究結論,對促進其持久性的相關表型和相關功能基因進行系統的總結。

綜上所述,本文對持久性的概念和由單增李斯特菌污染引發的暴發事件進行整理介紹,重點分析單增李斯特菌持久性與生物被膜形成能力、消毒劑耐受性、耐熱性和耐酸性等表型的聯系,并對相關的功能基因進行總結,為單增李斯特菌持久性菌株的預防和控制提供理論參考。

1 持久性菌株及相關安全事件

1.1 持久性和持久性菌株的定義及判定

“持久性(persistence)”一詞可以具有多種含義,可以描述病原體在人類宿主中的長期存活;也用于描述病原體在肉制品、奶酪、水產品和蔬菜等食品中的長期存活;同樣可用于描述病原體在土壤、不銹鋼表面或復雜的加工廠環境中的長期存活[9]。

目前對于“單增李斯特菌持久性菌株”的定義還沒有一個完全統一的標準,不同研究中對持久性菌株分離時間、分離環境以及亞型的確定方法等細節上存在些許差異,如表1所示?？偟膩碚f,持久性菌株可被定義為從同一環境不同日期重復分離出的具有相同亞型的菌株[10],而不滿足這一定義的其他菌株則被稱為散發性菌株(sporadic strains)[11]或者非持久性菌株(nonpersistent strains)[12]。

1.2 李斯特菌病暴發事件及其溯源技術

單增李斯特菌持久性菌株已被確定為食品加工后的主要污染物,對公共健康和經濟造成了極大影響[11]。目前,PFGE、MLST和cgMLST等分型技術已被用作分子流行病學調查和溯源分析中的常規工具[18]。這些分型方法的發展,很大程度上為識別和控制持久性菌株提供了技術支持。

近年來,由單增李斯特菌持久性菌株引起人類李斯特病的暴發或散發事件頻頻發生,如表2所示。其中,多個國家的李斯特菌病暴發事件與ST5型菌株污染食品環境有關,分子流行病學研究顯示其臨床分離亞型與工廠中存在的持久性亞型同屬于一個克隆。該亞型的菌株在奶制品[19-20]、水果以及蔬菜類[21-23]等不同的即食加工環境都能持續存在,這顯示了ST5菌株在各個環境中的污染致病能力,需要我們進一步加強關注。另外,南非香腸[24]和德國血腸[25]污染導致了多人死亡,這兩起暴發事件是都由ST6型克隆菌株引發的,據調查顯示,該亞型菌株在不同大陸的食品生產設施中實現了交叉污染,且持續傳播的時間長達3年。此外,還有一些ST型(例如ST1、ST382、ST4等)也形成了“環境—食品—臨床”的傳播鏈[19, 23, 26],對人類健康安全和社會經濟都造成一定的影響。由此可見,單增李斯特菌持續存在于食品加工環境是食品安全和人類健康面臨的一大挑戰,探究其在食品加工環境長期存在的原因對于如何預防和控制致病菌將具有重要意義。

表2 近年來由單增李斯特菌持久性菌株引發的部分暴發性事件Table 2 Selected outbreaks caused by persistent L.monocytogenes in recent years

2 單增李斯特菌持久性菌株的表型特征研究

隨著單增李斯特菌在環境中不斷被檢出,與單增李斯特菌持久性相關的表型的研究逐步開展,通常認為持久性菌株具有某些特定的表型特征,例如:菌株的生物被膜形成能力、對消毒劑的耐受性以及對酸、熱、滲透壓或干燥等不同環境下的抗逆性,以下分述之。

2.1 生物被膜形成能力

生物被膜是由細菌和自身分泌的胞外聚合物質(extracellular polymeric substances,EPS)組成,可黏附在生物及非生物表面具有三維立體空間結構的細胞群體[29]。已有研究表明,單增李斯特菌可在常見的不銹鋼、聚苯乙烯等食物接觸表面上形成生物被膜[1,30]。生物被膜有助于微生物在不利環境中的持久性,因為它們提供了表型的多樣性和生態優勢。例如,生物被膜的胞外基質可充當物理屏障,并提供保護性生態位,以阻礙抗菌劑滲透到深層生物被膜中[31]。另外,生物被膜內養分轉移或代謝通量的隨機變化,使得生物被膜內細胞顯示出的生理狀態有利于細胞的持久存活[32]。而由水平基因轉移引起的整個種群在壓力條件下的適應性則是持久性形成的另一原因[33]。微生物在環境中形成難以清除的生物被膜給食品工業帶來了嚴重危害,因為它們構成了致病微生物和腐敗微生物的儲存庫,增加了加工廠中食品污染的風險。

生物被膜的形成會提高菌株在不利環境中的存活率,不少研究者對持久性菌株和散發性菌株的生物被膜形成能力進行了比較分析,如表3所示。結晶紫染色和活細胞計數通常被用來測量生物被膜的形成量,也有少數研究采用了熒光顯微鏡和掃描電子顯微鏡從微觀角度對生物被膜的結構進行觀察。另外,研究選擇聚苯乙烯或不銹鋼片作為生物被膜的接觸介質,這在很大程度上是對工廠常見生產設備表面的模擬,提高了研究結果的實際參考價值。從表3中的結果可知,所有的單增李斯特菌菌株都具有生物被膜的形成能力,一些研究者的實驗結果支持持久性菌株具備更強的生物膜形成能力這一猜想[11,34-37]。然而,另一些研究小組發現,持久性菌株和散發菌株的生物膜形成能力沒有顯著差異[38-39]。這些結果的差異可能與實驗樣本量的選擇及生物被膜的培養時間等實驗條件的不同有關?？傮w而言,單增李斯特菌形成生物被膜的能力與食品加工廠環境中分離的菌株的持久性之間的相關性仍不明晰,還需要更多的研究加以說明。

表3 單增李斯特菌持久性和散發性菌株:生物被膜形成能力的比較研究Table 3 Persistent and sporadic L.monocytogenes:A comparative study of biofilm formation capacity

2.2 消毒劑耐受性

消毒劑針對細菌細胞的不同部位具有不同的作用機制,包括細胞成分(如核酸、蛋白質或酶)、細胞膜(蛋白質和轉運泵)或巰基(酶和輔酶)[40]。長時間進行高濃度的消毒操作使得消毒劑殘留于環境中,細菌反復暴露于亞致死濃度下,并且在這種選擇性壓力下進化出對消毒劑的耐受性[41],這可能有助于細菌在環境中持久存活。CASEY等[42]則發現許多生物過程,如肽聚糖生物合成、細菌趨化性和運動性以及碳水化合物攝取,都參與了持久性單增李斯特菌對消毒劑的耐受反應。表4將部分針對持久性菌株和散發性菌株對消毒劑耐受能力的研究進行了整理,以了解單增李斯特菌持久性菌株與消毒劑耐受性的潛在關系。

表4 單增李斯特菌持久性和散發性菌株:消毒劑耐受性的比較研究Table 4 Persistent and sporadic L.monocytogenes:A comparative study of disinfectant tolerance

如表4所示,大多數研究選用了工廠中最常見的消毒劑(季銨鹽類消毒劑和含氯類消毒劑)對菌株的耐受能力進行評估比較,部分研究還對不同狀態下的菌株(浮游態、生物被膜)進行了消毒劑耐受能力測試。雖然之前有研究者提出消毒劑耐受性作為一種重要的環境適應能力,有助于單增李斯特菌在食品加工環境中長時間存活[43-44],但僅有部分研究證明了對消毒劑的抗性與病原體在不同食品加工環境中的持久性之間存在關聯[13,43-45],在其他一些研究中沒有記錄到持久性和增加的消毒劑耐性之間的明確聯系[12,46-48]。另外,大多數對消毒劑耐受性的研究僅簡單比較了消毒劑處理后,微生物的失活數量,卻忽略了微生物對消毒劑的適應及生長恢復能力。

ORGAZ等[49]對食品加工廠分離出來的6株持久性菌株和6株非持久性菌株進行殼聚糖或過氧乙酸消毒處理,并在24 h內比較了它們的活細胞數的恢復情況,結果表明持久性菌株在殼聚糖處理后顯示出更好的恢復能力。因此,未來對持久性菌株與散發菌株對消毒劑耐受性的比較研究,不僅要考慮微生物的失活水平,也要關注微生物接觸抗菌化合物后的亞致死細胞的恢復能力。

2.3 耐酸性、耐熱性及其他抗逆表型研究

研究表明,細菌在酸、熱、滲透壓或干燥等其他環境的抗逆性也與菌株的持久性有關。單增李斯特菌在這些不利的環境條件下可直接或間接誘發突變,進一步分化成具有獨特遺傳特征的菌株集群[50]?；诓煌瑧し磻到y對生存的可能重要性,研究人員評估了持久性和非持久性菌株對各種應激的耐受性。LUNDEN等[51]發現從肉類加工廠分離得到持久性菌株對酸性條件的耐受性顯著高于散發性菌株,這表明耐酸性可能幫助這些菌株在衛生程序中存活,從而促成單增李斯特菌在環境中的持久性。NOWAK等[37]對8株單增李斯特菌持久性菌株和8株散發性菌株的耐熱性、運動性和在干燥表面的存活能力進行了比較,結果發現持久性與運動性無關,而耐熱性可能有助于持久性,并且在干燥條件下,持久性菌株往往比散發菌株存活得更好。VOGEL等[52]的研究也表明,單增李斯特菌在干燥條件下存活數月的能力與其持久性的形成有關。鑒于每個細胞的生理異質性和復雜性,持久性細菌的出現是不同的耐受性相關機制的結果。最近對細菌持久性機制的研究發現,細菌SOS反應的激活,一種上調DNA修復功能的信號通路,可能與細菌持久性有關[53]。

值得注意的是,以上大多數研究僅將持久性分別與某一具體表型特性聯系起來討論,而忽略了整體環境的復雜性。例如,生物被膜的形成會增強單增李斯特菌對消毒劑的耐受性[6],而菌株對鹽、消毒劑等環境因子的適應也能反向影響生物被膜的形成[54-55],這些特性共同作用促進了菌株在環境中的持久性。所以對持久性菌株的研究,不因局限于某一因素,還應結合實際環境情況。

3 單增李斯特菌持久性菌株的抗逆基因研究

表型差異不是由單一突變、前噬菌體或其他遺傳差異引起的,而可能是不同的單增李斯特菌譜系所獨有的,或者是環境刺激和遺傳背景的多因素組合。因此,深入了解與單增李斯特菌持久性相關的基因或遺傳特征,對于如何更好地識別、預防和控制工廠生態位中的單增李斯特菌持久性菌株,避免食品安全事件的發生具有重要意義。

3.1 與生物被膜形成相關的基因

研究發現,單增李斯特菌生物被膜的形成與鞭毛、群體感應、EPS、毒力等各種功能基因調控有關,如表5所示。

表5 單增李斯特菌生物被膜相關的基因表達研究Table 5 Gene expression studies related to biofilm of L.monocytogenes

單增李斯特菌鞭毛的合成受flaA、motB、FlhB、FliM、FliY等基因/蛋白的調控。其中,flaA基因編碼鞭毛蛋白作為鞭毛的結構亞基,motB基因可調控鞭毛的運動能力,FlhB、FliM和FliY等蛋白不僅介導單增李斯特菌的運動,還參與調節鞭毛的合成[56]。cheA/Y是一種雙組分趨化系統,細菌通過CheA蛋白感知外部信號,并通過趨化蛋白CheY調節鞭毛轉子參與細菌運動,促進生物被膜的形成[57]。細菌群體感應(quorum sensing,QS)在食物腐敗、生物被膜形成和與食物相關的發病機制中起著重要作用。在單增李斯特菌中有2個群體感應體系,即寡肽介導的Agr群體感應系統和自誘導2(AI-2)LuxS群體感應系統[58]。其中Agr群體感應系統可以直接正調控生物被膜的形成,也可以調控毒力因子、耐藥因子并間接調控生物被膜的形成,是一種整體水平的調控網絡體系[59]。表面黏附蛋白BapL在單增李斯特菌聚集到介質表面的過程也起重要作用[60]。由基因lmo2515編碼的DegU是鞭毛蛋白基因flaA的轉錄激活劑,與鞭毛糖蛋白的形成密切相關,直接影響生物被膜的形成[61]。此外,由prfA編碼的 PrfA蛋白是一種關鍵的轉錄激活劑,調節大多數單增李斯特菌毒力基因的表達,也被證明能促進單增李斯特菌生物被膜的形成[59]。其中,單增李斯特菌主要的毒力決定因子actA,作為一種PrfA調節的基因產物,能夠使肌動蛋白聚合,從而促進其細胞內運動和細胞間擴散,對細菌聚集和生物被膜形成至關重要[52]。

3.2 與消毒劑耐受性相關的基因

目前在單增李斯特菌中發現的與消毒劑耐受性相關的基因包括但不僅限于lde、mdrL、bcrABC、qacH和ermC等。其中,編碼外排泵轉運蛋白的lde、mdrL基因多次在單增李斯特菌中被檢出,對苯扎氯銨的耐受性起重要作用[63]。bcrABC在1998—1999年美國李斯特菌病爆發涉及的H7550菌株的質粒(pLM80)上被首次發現[64],能介導高水平的苯扎氯銨耐受率。qacH被指出與食品加工環境中持續存在的單增李斯特菌緊密相關。M?RETR?等[44]在來自9家挪威肉類和鮭魚加工廠的101個分離菌株中發現了qacH和bcrABC的存在,并通過實驗確定了攜帶qacH和bcrABC抗性基因的單增李斯特菌在亞致死濃度的季銨鹽類消毒劑下更具有生長優勢。KROPAC等[65]發現,多藥外排泵蛋白EmrC與單增李斯特菌ST6菌株引起的苯扎氯銨耐受性增強有關,在苯扎氯銨的作用下,與EmrC和TetR轉錄調控因子基因相關的mRNAs表達增加。HURLEY等[66]對從食品加工環境中分離的單增李斯特菌持久性菌株進行全基因組測序,發現72%的菌株中存在苯扎氯銨耐受性編碼基因,其中最相關的基因是emrC,其次是bcrABC、qacH-Tn6188和qacC。

3.3 與耐酸性、耐熱性及其他表型相關的基因

單增李斯特菌與耐酸性、耐熱性等其他表型相關的基因有argR、arcA、sigB、clpL、clpB,以及應激生存島1(stress survival islet 1,SSI-1)和應激生存島2(stress survival islet 2,SSI-2)等。

許多研究發現sigB的表達是單增李斯特菌在酸性脅迫下存活的關鍵[67]。argR基因可編碼一種功能性ArgR,屬于ArgR/AhrC精氨酸抑制家族的轉錄調控因子,arcA和sigB的轉錄和表達受到ArgR的顯著抑制。CHENG等[68]證明了argR的缺失導致arcA和sigB的表達激活,提高了單增李斯特菌在pH 3.5的BHI培養基中的存活率。P?NTINEN等[69]將clpL基因導入1株天然的熱敏單增李斯特菌,顯著提高了受體菌株在55 ℃時的耐熱性,說明ClpL可以作為耐熱性升高的潛在預測因子。CHENG等[70]發現DegU可自動調節并上調hrcA-grpE-dnaK-dnaJ操縱子,導致熱休克蛋白的產生增加,從而增強單增李斯特菌的耐熱性。RINGUS等[71]通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應發現SigB調節基因inlA和gadD3以及CtsR調節基因lmo1138和clpB在鹽脅迫條件下,轉錄水平顯著增強,這說明這4個基因與菌株耐高滲能力有一定關系。

據報道,從食品加工場所分離的單增李斯特菌的毒力和持久性特征與SSI-1和SSI-2的存在有關[8]。SSI-1包含lmo0444、lmo0445、lmo0446(pva)、lmo0447(gadD1) 和lmo0448(gadT1)5個基因,在不同的李斯特氏菌中高度保守,其缺失突變體在低pH值和高鹽濃度下顯示出生長受損[72]。另外,PIERCEY等[73]發現表現出脫水抗性的菌株也含有SSI-1,這說明SSI-1與菌株的抗干燥性也有一定聯系。SSI-2由lin0464和lin0465基因構成,目前僅存在于單增李斯特菌CC121相關菌株分離物中[74]。HARTER等[75]發現在氧化應激條件下,lin0464和lin0465兩個基因的表達顯著增加,且不受SigB的影響。另外,該研究構建了Δlin0464缺失突變體,發現lin0464的缺失降低了菌株在堿性和氧化應激下的存活率,這表明SSI-2的存在有利于菌株在堿性和氧化應激下存活。

隨著相關基因研究的深入,現已有一些研究者通過藥物干擾群體感應途徑、破壞細胞外DNA、蛋白質、胞外多糖和參與各種信號通路的次級信使來抑制或降低生物被膜的形成。SHUKLA等[76]通過鑒定Bap的功能和保守區域,靶向開發了抗生物被膜策略(一種合成肽,STVTVTF)干擾Bap介導的生物被膜積累,成功抑制并分散了細菌生物被膜,預防了單增李斯特菌在環境中進一步的傳播。此外,孫奇凡[77]利用比較基因組學挖掘出了一些持久性菌株的特異性分子檢測靶標,并建立了基于特異性分子檢測靶標的單增李斯特持留型CC87和CC88菌株的多重PCR檢測體系。因此,未來還應繼續探索更多的功能基因,并借助基因層面的研究來更好地識別監測和防控單增李斯特菌持久性菌株。

4 結語與展望

食品加工環境中持續存在的單增李斯特菌大大增加了食品(再)污染的風險,對食品安全和人類健康構成了巨大挑戰。盡管我們對持久性菌株已經有了初步的了解,但還有很多問題沒有解決,如文中所述,當前對于定義持久性菌株的分型方法和重復分離次數等的界定比較寬泛,一定程度上造成了信息無法及時有效地整合;其次,大多數關于單增李斯特菌持久性菌株的研究都只圍繞一個或兩個表型,如生物被膜的形成或對消毒劑的耐受性,且這些表型與食品加工廠環境中分離的菌株的持久性之間的相關性仍不明晰,還需要更多的研究加以說明。另外,單增李斯特菌對于其他工廠環境因素(如溫度、滲透壓、pH值和干燥條件等)的表型反應的數據較少,缺乏對其表型特征的系統研究;最后,現有的關于持久性菌株的研究主要集中在表型,只有相對較少的研究關注了持久性相關的基因和遺傳特征,目前對于相關功能基因的探索還相對有限,持久性現象背后的分子機制還有待探索。因此未來的工作可從以下3方面開展:

其一,目前確定持久性菌株采用的分型方法較多,導致許多研究結論無法統一。未來可以將單增李斯特菌持久性菌株按不同的亞型進行分類整理,總結不同單增李斯特菌亞型的流行規律;其二,未來研究應充分考慮食品工廠環境的復雜性,在多種環境因素下對持久性菌株的表型進行全面的探索,并且在這些實驗中,研究者需盡可能保持實驗樣本量及相關實驗條件的一致,這有助于揭示各表型與持久性的關系;其三,持久性的形成可受到多種遺傳機制的調控,未來可利用基因組學、轉錄組學等多種技術,從分子水平繼續探究持久性菌株的功能基因和遺傳學特征,并借助基因層面的研究來更好地識別監測和防控單增李斯特菌持久性菌株,進一步為未來開發靶向治療方案提供基礎研究數據。