基于CuB(C6 H5)4 締合物微粒體系的共振散射光譜法測定異煙肼藥片中異煙肼的含量

孫雙姣,唐雅婷

(邵陽學院 藥學院,邵陽 422000)

結核病是伴隨人類歷史最久,造成人類死亡最多的慢性傳染病。盡管我國結核病防治工作取得了很好的成效,但結核病感染形勢還較為嚴峻,結核病仍然是威脅人民群眾健康的重大傳染性疾病[1]。異煙肼(INH)是治療結核病的首選藥物,能抑制結核桿菌生長,抗菌作用強[2]。因此,進行INH 質量監控及用藥安全監測具有重要的意義。目前,已報道的INH 檢測方法主要有高效液相色譜法[3-5]、分光光度法[6-7]、熒光法[8]、氣相色譜法[9-10]、毛細管電泳法[11]、化學發光法[12-15]、電化學法[16-17]等。這些方法有的操作繁瑣費時,有的儀器昂貴,有的儀器靈敏度不高。共振散射光譜法具有儀器簡單、操作方便、靈敏度高的特點,已廣泛應用于無機[18-19]、生化[20-21]、藥物[22-24]等領域。

INH 結構中的酰肼基具有較強的還原性,可與氧化物發生反應。本工作利用INH 將Cu(Ⅱ)還原為Cu(Ⅰ),Cu(Ⅰ)繼續與NaB(C6H5)4作用生成CuB(C6H5)4締合物,并進一步聚集成締合微粒,產生固液界面,引起體系共振光散射信號強度顯著增大,在397 nm 處形成強共振散射峰,該共振散射峰信號強度與INH 質量濃度在一定范圍內成正比,由此建立了共振散射光譜法測定INH 藥片中INH 含量的方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

F97pro型熒光分光光度計;VM-210 型混合器;H2-16KR 型臺式高速冷凍離心機;FA2004 型電子天平。

INH 標準溶液:1.00 g·L－1,批號為100578-201502。

INH 標準中間液:20 mg·L－1,取適量INH 標準溶液,用水稀釋,搖勻備用。

INH 標準溶液系列:取適量INH 標準中間液,用水逐級稀釋,配制成INH 質量濃度分別為0.010,0.050,0.100,0.500,1.00,1.50,2.00 mg·L－1的INH 標準溶液系列。

所用試劑均為分析純;試驗用水為二次蒸餾水。

INH 藥片分別來自天津的一家制藥公司(批號1803010)和山西的兩家制藥公司(批號分別為G171106和180201)。

1.2 試驗方法

取10片INH 藥片,研細,混勻,分取含2.00 mg INH 藥粉,加入20 mL水,玻璃棒攪拌2 min,所得溶液用水定容至100.0 mL。分取5.00 mL 上述溶液置于10.0 mL離心管中,以10 000 r·min－1轉速離心2 min,分取上清液1.00 mL,用水定容至10.0 mL,即制得INH 樣品溶液。取1.00 mL 0.20 mol·L－1乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(pH 4.6)、1.50 mL 0.50 g·L－1NaB(C6H5)4溶 液、2.00 mL 1.00 g·L－1CuSO4溶液至10.0 mL 比色管中,混勻后加入1.00 mL INH 樣品溶液,用水定容至10.0 mL,振蕩0.5 min,靜置反應10 min。取適量上述溶液置于熒光分光光度計中,在200～700 nm內同步掃描激發(λex)、發射(λem)波長(λem＝λex),讀取397 nm 處共振散射峰的信號強度IRSS。同步測試試劑空白,得到I0RSS,以ΔIRSS(ΔIRSS＝IRSSI0RSS)進行定量。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

當反應體系中含有0,0.010,0.500,1.00,2.00 mg·L－1INH 時的共振散射光譜見圖1。

圖1 添加了不同量INH 后反應體系的共振散射光譜Fig.1 Resonance scattering spectra of reaction systems after adding INH with different amounts

由圖1可知:當反應體系中不含INH 時,共振散射信號強度很弱(曲線1);加入INH 后,共振散射信號強度顯著增強,且隨著INH 質量濃度的增加而增強(曲線2～曲線5),強度較大的兩個共振散射峰出現在397,467 nm 處?？紤]到397 nm 處的共振散射峰信號強度最大,因此試驗選擇采用397 nm處的共振散射峰進行后續分析。

2.2 緩沖溶液酸度及用量的選擇

反應體系酸度會直接影響INH 對Cu(Ⅱ)的還原及CuB(C6H5)4締合物的生成,從而影響INH 的測定,試驗選擇采用緩沖溶液控制反應體系的酸度?？紤]到Cu(Ⅱ)在堿性環境中會發生水解,試驗選擇采用酸性的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液,并優化了其酸度和用量,結果見圖2。

圖2 不同酸度和用量的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液下反應體系的ΔIRSSFig.2 ΔIRSS of reaction systems with different acidity and amounts of acetic acid-sodium acetate buffer solutions

由圖2可知,反應體系的ΔIRSS在乙酸-乙酸鈉緩沖溶液酸度達到pH 4.6以及用量達到1.00 mL時較大,因此試驗選擇在此條件下進行后續分析。

2.3 CuSO4 與NaB(C6 H5)4 溶液用量的選擇

CuSO4與NaB(C6H5)4溶液用量直接影響CuB(C6H5)4締合物的生成,從而影響方法的靈敏度,因此試驗優化了CuSO4與NaB(C6H5)4溶液用量,結果見圖3。

圖3 不同用量CuSO4 和NaB(C6 H5)4 溶液下反應體系的ΔIRSSFig.3 ΔIRSS of reaction systems with different amounts of CuSO4 solution and NaB(C6 H5)4 solution

當由圖3可知,反應體系的ΔIRSS在CuSO4溶液用量達到2.00 mL 以及NaB(C6H5)4溶液用量達到1.50 mL 時較大,因此試驗選擇在此條件下進行后續分析。

2.4 試劑加入順序的影響

改變乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、CuSO4溶液、NaB(C6H5)4溶液以及INH 樣品溶液(INH 標準溶液)的加入順序,發現上述試劑的加入順序對反應體系ΔIRSS的影響不大。綜合考慮,試驗選擇按照1.2節順序加入上述試劑。

2.5 靜置反應時間的選擇

添加一定量INH 標準溶液,使反應體系中INH 的加標量達到0.200,1.00 mg·L－1,按照試驗方法分別測定,考察了靜置反應時間分別為2,5,8,10,12,15,20,25,30 min時對INH 回收率的影響。結果顯示:當靜置反應時間不大于10 min時,兩種加標量下INH的回收率均隨著靜置反應時間的延長而增加;當靜置反應時間為10～30 min時,兩種加標量下INH 的回收率均較大(97.8%～102%)且趨于穩定。綜合考慮,試驗選擇的靜置反應時間為10 min。

2.6 共存物質的影響

添加一定量INH 標準溶液,使反應體系中INH 的質量濃度達到1.00 mg·L－1,添加不同INH 量倍數的常見藥物輔劑淀粉、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖以及干擾離子NO3－、Cl－、K＋、Zn2＋,考察了這些物質對INH 測定的影響。結果顯示,在測定值相對誤差絕對值不大于5.0%條件下,100倍淀粉、120倍葡萄糖、150 倍麥芽糖、200 倍蔗糖、600 倍NO3－,800倍Cl－、1 000倍K＋、800倍Zn2＋不干擾INH 的測定。

2.7 標準曲線和檢出限

按照試驗方法測定INH 標準溶液系列,以INH 的質量濃度為橫坐標,對應的反應體系ΔIRSS為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示:INH 標準曲線的線性范圍為0.010～2.00 mg·L－1,線性回歸方程為y＝419.9x＋247.6,相關系數為0.999 3。

按照試驗方法平行測定11次試劑空白,以3倍標準偏差(s)和標準曲線斜率(k)的比值計算檢出限(3s/k),結果為0.004 mg·L－1。

2.8 樣品分析

按照試驗方法分析3個實際樣品,每個樣品平行測定5次,計算測定值的相對標準偏差(RSD),并對其進行加標回收試驗,計算回收率;參考《中華人民共和國藥典》(2020 年版)中高效液相色譜法(HPLC)分析這3 個樣品。上述試驗所得結果見表1。

表1 樣品分析結果(n＝5)Tab.1 Analytical results of the samples(n＝5)

由表1可知:本方法所得INH 的測定值和藥典方法的基本一致,均和標簽值吻合;測定值的RSD為1.8%～2.6%,回收率為97.0%～99.0%,表明本方法的準確度、精密度好,能用于異煙肼藥片中INH 含量的測定。

基于INH 的還原能力建立了共振散射反應體系,利用熒光分光光度計進行定量,實現了INH 藥片中INH 含量的測定。方法具有簡單、快速、靈敏度高、操作方便、抗干擾能力強等特點,具有一定的應用推廣價值。