分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定土壤中新煙堿類農藥及其代謝物的殘留量

平 華 ,趙天宇 ,馬智宏 ,孔紅玲 ,李 楊 ,李 成*

(1.北京市農林科學院質量標準與檢測技術研究所,北京 100097;2.農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室(北京),北京 100097)

新煙堿類農藥是世界范圍內廣泛使用的第一大殺蟲劑[1-3]。新煙堿類農藥在給農業增產的同時,還會對蜜蜂以及土壤中蚯蚓等非靶標生物產生毒性[4-5],對人類等哺乳動物產生遺傳毒性、免疫毒性和生殖毒性等[6]。為保障新煙堿類農藥使用安全,歐盟在2018年就已禁止新煙堿類農藥噻蟲嗪、噻蟲胺和吡蟲啉在農業中的施用[7],我國也在2022 年開始研討制定新煙堿類農藥安全使用技術規范等相關標準。新煙堿類農藥施用后,通常有超過90%進入土壤,并在土壤中累積,目前該類農藥已在全球各地農田土壤樣品中被不同程度地檢出[2,8-11]。土壤中殘留的新煙堿類農藥會被作物進一步吸收,并殘留在糧食作物、蔬菜和水果中[12-13],被生物食用后,將進入生物體內部,產生上述健康風險[14-15]。目前新煙堿類農藥及其代謝物在食品和人體尿液中殘留檢測的文獻已有報道[16-17]。新煙堿類農藥代謝物與其母體毒性相似,但是具有更強的移動性和持久性[16,18],因此有必要加強對土壤中新煙堿類農藥及其代謝物的監測。

目前文獻報道的新煙堿類農藥的檢測方法多為液相色譜法[19]和液相色譜-質譜法[2,20-21],其中液相色譜-質譜法因具有快速、高效、靈敏度高等優點而被廣泛使用,但檢測對象未涉及代謝物。常用的前處理方法有固相萃取法[2]、分散固相萃取法[11,21]、分子印跡法[22]等,其中分散固相萃取法具有操作簡便、快速高效的特點,是目前使用較多的前處理方法。但是,新煙堿類農藥種類多、水溶性強,不同農藥間溶解度差異較大,同時提取時存在烯啶蟲胺等農藥回收率低的問題[20]。鑒于此,本工作優化了分散固相萃取條件、色譜條件和質譜條件,提出分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)同時檢測土壤中呋蟲胺、啶蟲脒、氟啶蟲酰胺、噻蟲胺、噻蟲啉、吡蟲啉、氯噻啉、烯啶蟲胺、氟吡呋喃酮、噻蟲嗪等10種新煙堿類農藥及N-去甲基啶蟲脒(啶蟲脒代謝物)、酰胺噻蟲啉(噻蟲啉代謝物)、吡蟲啉-羥基(吡蟲啉代謝物)、吡蟲啉-5-羥基(吡蟲啉代謝物)等4種代謝物的方法,方法快速、準確、靈敏度高,在5 min 內即可完成10種新煙堿類農藥及4種代謝物的檢測,可為土壤中新煙堿類農藥污染狀況及環境行為的研究提供技術支持。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY 型超高效液相色譜儀;Xevo TQ 型三重四極桿質譜儀;3K30 型高速冷凍離心機;R-200型旋轉蒸發儀;HZQ-C 型空氣浴振蕩器;Milli-Q 型純水機。

單標準溶液:呋蟲胺、啶蟲脒、氟啶蟲酰胺、噻蟲胺、噻蟲啉、吡蟲啉、氯噻啉、烯啶蟲胺、氟吡呋喃酮、噻蟲嗪、N-去甲基啶蟲脒、吡蟲啉-羥基、吡蟲啉-5-羥基、酰胺噻蟲啉等14 種目標物的質量濃度均為100 mg·L－1。

混合標準儲備溶液:10 mg·L－1,取適量各單標準溶液,用乙腈稀釋而成。其他標準溶液均由此溶液用乙腈稀釋而成。

基質匹配混合標準溶液系列:取適量混合標準儲備溶液,用空白樣品(土壤pH 7.1,有機質質量分數為2.60%,全氮質量分數為0.155%,陽離子交換量為12.0 cmol·kg－1)溶液逐級稀釋,配制成0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,200.0μg·L－1的基質匹配混合標準溶液系列。

乙腈、甲醇為色譜純;乙酸為優級純;無水硫酸鎂、氯化鈉為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫40 ℃;樣品室溫度10 ℃;進樣體積5μL;流動相A 為含5 mmol·L－1甲酸銨的甲醇溶液,B 為含5 mmol·L－1甲酸銨的0.1% (體積分數,下同)甲酸溶液;流量0.3 mL·min－1。梯度洗脫程序:0～0.5 min時,A為5%;0.5～2.0 min時,A 由5%升至40%;2.0～7.0 min時,A 由40%升 至95%,保 持0.5 min;7.5～10.0 min時,A 由95%降至5%。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)模式;多反應監測(MRM)模式;毛細管電壓3.5 kV;霧化氣溫度400 ℃;去溶劑氣流量800 L·h－1,碰撞氣流量0.15 mL·min－1;離子源溫度150 ℃。其他質譜參數見表1,其中“*”代表定量離子。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的采集

采集離地表20 cm 以內的土壤樣品,在陰涼通風處風干,去除石子、植物殘體等雜質,過40 目(0.45 mm)篩。

表2 線性參數、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

1.3.2 樣品的提取

取過篩后的土壤樣品5 g(精確至0.01 g),加入3.0 mL水,搖勻后靜置10 min,加入10 mL含1.0%(體積分數,下同)乙酸的乙腈溶液,振蕩30 min。加入5.0 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉,劇烈振蕩1 min,于4 ℃以10 000 r·min－1轉速離心5 min,待凈化。

1.3.3 樣品的凈化和測定

取0.15 g無水硫酸鎂、0.05 gN-丙基乙二胺(PSA),置于5 mL 具塞離心管中,再加入2.0 mL樣品提取液,渦旋振蕩1 min,于4 ℃以8 000 r·min－1轉速離心3 min。取0.5 mL 上清液,加入0.5 mL水,混勻后過0.2μm 濾膜,收集濾液,供UHPLC-MS/MS測定。

空白樣品的處理方法同上。

2 結果與討論

2.1 儀器工作條件的選擇

在考察柱溫、流量、流動相及梯度洗脫程序對目標物峰形、分離效果和響應值影響時發現流動相體系的影響較大,因此試驗進一步考察了分別以甲醇-水和乙腈-水為流動相體系時對14種目標物色譜峰形、分離度及響應值的影響。結果顯示,相較乙腈-水體系,甲醇-水體系對目標物的分離效果更好,但是目標物峰形較寬。進一步優化流動相組成,結果顯示,在水中加入5 mmol·L－1甲酸銨和0.1%甲酸,在甲醇中加入5 mmol·L－1甲酸銨時,14種目標物分離效果較好、峰形尖銳、離子化效率高、靈敏度高,在5 min內能全部被檢測到。因此,試驗選擇該流動相體系進行色譜分析。

在質譜分析時,分別對錐孔電壓、碰撞能量和毛細管電壓等條件進行優化,使每種目標物的母離子與特征碎片離子強度達到最大,選擇響應最、次強的碎片離子分別作為定量、定性離子,優化的質譜參數見1.2.2節。

優化的儀器工作條件下14種目標物的MRM色譜圖見圖1。

圖1 14種目標物的MRM 色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the 14 targets

2.2 提取溶劑的選擇

處理土壤樣品時,乙腈類溶劑提取的雜質少,基質效應小,因此常用的提取溶劑有乙腈-二氯甲烷混合溶液、乙腈溶液、含1.0%乙酸的乙腈溶液等。以乙腈-二氯甲烷混合溶液提取時,烯啶蟲胺回收效果較差,回收率僅為27.66%～32.08%[20],這是由于烯啶蟲胺的水溶性(590 g·L－1)遠遠高于其他13種目標物的(0.18～39.83 g·L－1),而該提取溶劑極性相對較低,對烯啶蟲胺的提取效果較差。因此,試驗僅比較了后二者的提取效果,在提取前,先加入適量水潤濕和分散土壤樣品,有利于提高水溶性較高的目標物的回收率。結果顯示,相較乙腈溶液,以含1.0%乙酸的乙腈溶液提取時,烯啶蟲胺的回收效果較好(回收率75.2%～77.6%),其他13種目標物的回收率也滿足要求,推測乙酸的加入增加了烯啶蟲胺在提取溶液中的溶解度。經過反復試驗優化,試驗選擇的提取溶劑為3.0 mL 水＋10 mL含1.0%乙酸的乙腈溶液。

2.3 凈化填料及其用量的選擇

常用的分散固相萃取填料有C18、PSA 等,其中C18主要用于吸附脂肪等非極性化合物,PSA 主要用于吸附色素、有機酸等極性雜質。試驗對比了0.05 g PSA、0.05 g C18和0.05 g PSA＋0.05 g C18對樣品的凈化效果,結果見圖2。

圖2 凈化填料對14種目標物回收率的影響Fig.2 Effect of purification filler on the recovery of the 14 targets

由圖2可知,3種凈化填料所得14種目標物的回收率均能滿足要求,但是以PSA 凈化時所得的回收率整體較高,這與文獻[20]報道的結果一致,因此試驗選擇的凈化填料為PSA。

試驗進一步考察了PSA 用量(0.01,0.02,0.05,0.10,0.20 g)對樣品凈化效果的影響,結果見圖3。

圖3 PSA 用量對14種目標物回收率的影響Fig.3 Effect of PSA amount on the recovery of the 14 targets

由圖3 可知,大部分目標物在PSA 用量為0.05 g時回收率較高(75.2%～118%),因此試驗選擇的PSA 用量為0.05 g。

2.4 基質效應

樣品中存在的其他干擾成分在離子化過程中會與目標物進行競爭,進而產生基質增強或抑制效應,造成目標物定量結果不準確?；|效應(ME)可利用基質匹配混合標準溶液和混合標準溶液中各目標物峰面積比與1差值的百分比來評價[23-24]。當ME值小于0時表現為基質抑制效應,大于0時表現為基質增強效應;ME值的絕對值不大于20%時表現為弱基質效應,在＞20%～50%內時表現為中等基質效應,大于50% 時表現為強基質效應。以0.05 mg·L－1基質匹配混合標準溶液和混合標準溶液為待測對象,按照儀器工作條件各平行測定6次。結果顯示,各目標物的ME值均小于0,表現為基質抑制效應。其中:呋蟲胺ME 值的絕對值不大于20%,表現為弱基質效應;氯噻啉和噻蟲啉ME值的絕對值大于50%,表現為強基質效應;其他11種目標物ME 值的絕對值為25.4%～48.6%,表現為中等基質效應。以上結果說明,目標物的基質效應不能忽略。為降低其影響,試驗采用基質匹配法進行定量。

2.5 工作曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定基質匹配混合標準溶液系列,以各目標物的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制工作曲線,所得線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表2。

以3,10倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果見表2。

由表2 可知,14 種目標物的檢出限為0.36～2.49μg·kg－1,測定下限為1.20～8.30μg·kg－1,和檢測土壤中烯啶蟲胺、噻蟲嗪、吡蟲啉、噻蟲啉等4種新煙堿類農藥的加壓流體萃取-液相色譜法[19]的檢出限(3～5μg·kg－1)相比,本方法的檢出限更低。

2.6 精密度和回收試驗

按照試驗方法對空白土壤樣品進行0.01,0.05,0.50 mg·kg－1等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平重復測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表3可知,14種目標物的回收率為75.4%～112%,測定值的RSD 為2.4%～8.6%。

2.7 樣品分析

按照試驗方法分析在當地采集的16份果園土壤樣品,以驗證該方法的適用性。結果顯示:有13份土壤樣品檢出了新煙堿類農藥的殘留,檢出的農藥分別為吡蟲啉、噻蟲嗪和噻蟲胺,檢出率分別為81.3%,50.0%和6.25%,其中吡蟲啉的檢出量為0.007～0.31 mg·kg－1(檢出平均量為0.039μg·kg－1),噻蟲嗪的檢出量為0.005～0.28 mg·kg－1,噻蟲胺的檢出量為0.009 mg·kg－1。上述結果和文獻[9]的基本一致,但是吡蟲啉的平均檢出量高于文獻[9]的(0.56μg·kg－1),說明新煙堿類農藥在當地土壤的殘留問題需要引起一定的關注。

本工作以分散固相萃取-UHPLC-MS/MS測定土壤中新煙堿類農藥及其代謝物的殘留量,該方法靈敏度高,精密度和準確度均符合要求,適用于大批量土壤樣品中新煙堿類農藥及其代謝物的快速同時檢測,具有一定應用價值。