基于信息熵理論的超高效液相色譜-串聯質譜法測定淡水魚肉中4種硝基呋喃類代謝物的殘留量

李青青 ,羅秋水,2 ,周 強 ,徐 芊 ,張建軍 ,梁 棋 ,熊建華,2*

(1.江西農業大學 食品科學與工程學院,南昌 330045;2.南昌市農產品加工與質量控制重點實驗室,南昌 330045)

硝基呋喃類藥物可抑制乙酰輔酶A,干擾微生物糖代謝[1],具有較強的殺菌能力,以前常作為抗菌藥物用于水產養殖業。硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮、呋喃妥因、呋喃它酮和呋喃西林,該類藥物穩定性差,在動物體內可被迅速代謝,其代謝物5-嗎啉甲基-3-氨基-2-口惡唑烷基酮(AMOZ)、3-氨基-2-口惡唑烷基酮(AOZ)、1-氨基-2-乙內酰(AHD)和氨基脲(SEM)與組織蛋白結合形成穩定的化合物后,會長時間停留在生物組織中,使動物產生慢性毒性癥狀,甚至誘導基因突變,致癌和致畸[2-5]。目前,硝基呋喃類藥物已被大多數國家禁止在食用性動物飼養中使用。我國農業農村部第193號公告將硝基呋喃類藥物列為禁用藥物;2003年,水產品中硝基呋喃類代謝物被納入(農牧發[2003]6號《2003年度動物性產品中獸藥殘留監控計劃》)殘留監控計劃名單[1]。因此,建立淡水魚中硝基呋喃類代謝物殘留快速準確檢測的方法至關重要。

目前,硝基呋喃類代謝物的檢測方法主要有熒光免疫分析法、免疫層析法、液相色譜法、液相色譜-串聯質譜法等[6-12]。免疫分析法操作簡便,但是檢測靈敏度低,容易出現假陽性結果,一般僅作為初級篩選方法[13]。高效液相色譜-串聯質譜法是最常用的方法,該方法需要對樣品進行衍生化處理,靈敏度和準確度均較高,是國際上檢測和確認硝基呋喃類代謝物的主要方法[14]。在采用該方法檢測魚肉中硝基呋喃類代謝物時,存在以下3個方面的問題:①魚肉樣品基質復雜,含有豐富的蛋白質和脂肪[15],樣品前處理過程繁瑣、耗時;②硝基呋喃類藥物由于相對分子質量小、電離性差、極性高[16-17],在反向色譜柱上保留效果差,質譜檢測時離子化效率低,導致檢測靈敏度較低[18-19];③不同硝基呋喃類代謝物性質存在差異,導致其回收率差異較大。以上問題說明前處理條件的選擇很關鍵,可綜合利用多指標評價系統來指導完成。信息熵是對信息進行量化分析,從而解決不確定性問題的工具。它可以對實際發生的資料進行整理、計算和分析,得出各指標客觀權重系數,用于多指標評價系統的綜合評價[20-21]?；谛畔㈧乩碚撘?種硝基呋喃類代謝物回收率綜合評分M為指標優化魚肉樣品前處理條件的研究還未見報道。因此,本工作在單因素試驗的基礎上,對衍生條件進行優化,并采用超高效液相色譜-串聯質譜法(UHPLC-MS/MS)測定淡水魚中4種硝基呋喃類代謝物的殘留量,以期為淡水魚中的硝基呋喃類代謝物的監控提供更靈敏、準確的檢測方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1260 prime-Ultivo型超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用系統;G6465B-Ultivo型液相色譜儀;HC-2518R 型高速冷凍離心機;WD-12 型氮氣吹干儀;TS-2102C 型恒溫水浴振蕩器;R20900010型均質機;ME204E 型電子天平;Vortex3型渦旋混勻器。

4種硝基呋喃類代謝物(AOZ、AMOZ、AHD、SEM)混合標準溶液:100 mg·L－1。

4種硝基呋喃類代謝物混合內標[AOZ-d4、AMOZ-d5、13C3-AHD、呋喃西林代謝物13C,15N2-SCA·HCl(CAS 號 為1173020-16-0,SEM 的 內標)]溶液:10 mg·L－1。

混合標準儲備溶液:5 mg·L－1,取適量4種硝基呋喃類代謝物混合標準溶液,用甲醇稀釋而成。

混合內標儲備溶液:1 mg·L－1,取適量4種硝基呋喃類代謝物混合內標溶液,用甲醇稀釋而成。

混合標準溶液系列:取適量4種硝基呋喃類代謝物及其內標的混合標準儲備溶液,用甲醇稀釋,配制成4 種硝基呋喃類代謝物的質量濃度為0.02,0.20,2.00,5.00,10.00,20.00,50.00μg·L－1,內 標質量濃度為100μg·L－1的混合標準溶液系列。

二甲基亞砜純度為99.5%;鄰硝基苯甲醛純度為99%;乙酸乙酯、甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純;鹽酸為優級純;氫氧化鈉、三水合磷酸氫二鉀均為分析純。

55份淡水魚樣品,采樣于江西省贛州市、上饒市、南昌市、九江市、宜春市,包括草魚、鯽魚、白鰱、花鰱、鳙魚、青魚、黃丫頭等品種,其中草魚、鯽魚和白鰱包括魚苗和成魚,其他品種均為成魚,單因素和響應面試驗對象均為草魚成魚。

1.2 儀器工作條件

1)色譜條件 Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫25 ℃;流動相為體積比1∶1的0.1%(體積分數)甲酸溶液和乙腈的混合溶液,等度洗脫,時間3.5 min;流量0.2 mL·min－1;進樣量2μL。

2)質譜條件 大氣壓電噴霧離子(API-ESI)源,正離子模式;多反應監測(MRM)模式;毛細管電壓4 000 V;干燥氣流量7.0 L·min－1,溫度300 ℃;霧化氣壓力103.42 kPa。其他質譜參數見表1,其中“*”為定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

取淡水魚樣品,剔除魚頭和魚刺,將魚肉切成小塊,充分均質后,于－20 ℃保存備用。分取淡水魚樣品1.000 0 g置于50 mL 離心管中,加入10 mL水和0.5 mL 1.0 mol·L－1鹽酸溶液,渦旋混勻。加入100μg·L－1混合內標溶液0.1 mL,渦旋混勻。加入350μL 0.05 mol·L－1鄰硝基苯甲醛(衍生試劑)溶液(介質為甲醇),渦旋混勻,于46℃水浴中避光振蕩衍生2.5 h。冷卻至室溫,加入5 mL 1.0 mol·L－1磷酸氫二鉀溶液,用1.0 mol·L－1氫氧化鈉溶液調節溶液酸度至pH 7.4±0.2,渦旋混勻。加入8 mL 乙酸乙酯,渦旋振蕩50 s,以4 000 r·min－1轉速離心5 min。取上清液,加入8 mL乙酸乙酯重復提取一次,合并上清液,氮氣吹干。加入1 mL 正己烷用于除雜,渦旋5 s后加入1 mL 50%(體積分數,下同)乙腈溶液(復溶溶劑),渦旋溶解殘渣,于4 ℃以10 000 r·min－1轉速離心15 min。取下層相過0.22μm 濾膜,將濾液轉移至進樣瓶中,用于UHPLC-MS/MS 測定。每個樣品平行測定3次,計算平均值。

1.4 回收率綜合評分計算

為了彌補多指標優化方法在確定權重系數時主觀賦值能力的不足,將信息熵理論引入優化過程,可使權重系數的確定更具客觀性[22]。參考文獻[23]進行計算:以4種硝基呋喃類代謝物的回收率為評價指標,建立原始評價指標矩陣X[X＝(xij)mn],并按照公式(1)將原始評價指標矩陣X轉化為概率指標矩陣P[P＝(pij)mn];按照公式(2)計算信息熵(H),按照公式(3)計算權重系數(W);根據各評價指標的權重,按照公式(4)計算多指標回收率綜合評分M。

式(1)中:m,n分別表示該評價指標系統中有m種硝基呋喃類代謝物(m＝4)和n次試驗;xij表示第j次試驗中第i種硝基呋喃類代謝物的回收率;pij表示第i種硝基呋喃類代謝物在第j次試驗中回收率的概率。

式(2)中:Hi為第i種硝基呋喃類代謝物的信息熵;k表示待定常數,k＝1/lnn。

式(3)中:Wi為第i種硝基呋喃類代謝物的權重系數。

式(4)中:xi為第i種硝基呋喃類代謝物的平均回收率,%;xi,max為第i種硝基呋喃類代謝物的最高回收率,%。

1.5 軟件選擇

通過Agilent Mass Hunter Acquisition 10.0軟件進行數據采集,Agilent Mass Hunter Qualitative 10.0和Agilent Mass Hunter Quantitative 10.0軟件進行數據處理,IBM SPSS Statistics 24軟件進行單因素方差分析(結果以平均值±標準偏差表示),Excel 2007 進行回收率綜合評分M計算,Design Expert.V.8.0.6.1軟件進行Box-Behnken響應面試驗設計和分析,Originpro 9.1軟件進行作圖。

2 結果與討論

2.1 衍生條件的優化

2.1.1 單因素試驗

硝基呋喃類藥物在動物體內穩定性差、半衰期短,會迅速轉化為相對分子質量較小的代謝物[5],為提高這些代謝物的檢測靈敏度,需進行衍生化反應增大其相對分子質量,提高其離子化效率。試驗首先考察了衍生試劑溶液介質分別為二甲亞砜和甲醇時對加標草魚樣品中4種硝基呋喃類代謝物回收率綜合評分M的影響。結果顯示,二者所得的回收率綜合評分M分別為0.779 8和0.855 2,說明以甲醇溶解鄰硝基苯甲醛時衍生效果更好,推測在酸性條件下,甲醇不僅可作為蛋白質沉淀劑顯著降低基質干擾,還有利于硝基呋喃類代謝物的釋放[7,19,24]。

試驗進一步考察了水浴衍生、超聲衍生、烘箱衍生和振蕩衍生等4種衍生方式對上述加標草魚樣品中4種硝基呋喃類代謝物回收率綜合評分M的影響。結果顯示,4種衍生方式所得回收率綜合評分M分別為0.886 2,0.884 7,0.868 6和0.901 0,其中振蕩衍生所得回收率綜合評分M和其他3種衍生方式的存在極顯著性差異(P＜0.01),說明振蕩衍生效果較好,推測恒溫振蕩方式可以防止魚肉蛋白質聚集,使魚肉與衍生試劑充分接觸[25],促進硝基呋喃類代謝物的釋放。

衍生條件對衍生化效率及檢測靈敏度均有顯著影響[26],試驗分別考察了衍生試劑體積(100,200,300,400,500μL)、衍生溫度(20,37,55,75,95 ℃)、衍生時間(1,2,3,4,5 h)對加標草魚樣品中4種硝基呋喃類代謝物回收率綜合評分M的影響。結果顯示:4種硝基呋喃類代謝物回收率綜合評分M隨著衍生試劑體積的增加先升高后降低,當衍生試劑體積為300μL 時回收率綜合評分M較高;4種硝基呋喃類代謝物回收率綜合評分M隨著衍生溫度的升高先升高后降低,當衍生溫度為37℃時回收率綜合評分M較高,這是由于更高的衍生溫度會加速硝基呋喃類代謝物分解[27],而衍生溫度低于37 ℃時,衍生不夠充分,硝基呋喃類代謝物未完全釋放;4種硝基呋喃類代謝物回收率綜合評分M隨著衍生時間的延長先升高后降低,當衍生時間為2 h時,回收率綜合評分M較高,但是衍生時間為1,2,3 h時回收率綜合評分M的差異不顯著(P＞0.05)。以上結果與文獻[28]在優化河蝦中4種硝基呋喃類代謝物前處理條件時的結果相一致。綜合上述結果,試驗選擇衍生試劑體積200,300,400μL,衍生溫度20,37,55 ℃,衍生時間1,2,3 h進行后續響應面試驗。

2.1.2 響應面試驗

依據Box-Behnken響應面法設計原理,以衍生試劑體積(A)、衍生溫度(B)、衍生時間(C)為因變量,4種硝基呋喃類代謝物回收率綜合評分M為自變量進行響應面分析,因素和水平設計見表2。

表2 響應面試驗因素水平設計表Tab.2 Design table of factor level for response surface test

按照1.3節方法進行上述3因素3水平試驗,每種條件均進行3次平行試驗,所得回收率結果見表3。按1.4節公式對表3中回收率進行處理,得到AOZ、AMOZ、AHD、SEM 的信息熵H＝{0.998 5,0.999 1,0.999 6,0.988 2},權重系 數W＝{0.100 1,0.061 2,0.025 1,0.813 1},回收率綜合評分M見表3。

表3 響應面試驗設計與結果Tab.3 The design and results of response surface test

對上述回收率綜合評分M和各因素進行回歸擬合,得到二次多項式回歸模型,見公式(5)。

方差分析結果見表4,其中“**”表示差異極顯著(P＜0.01)。

表4 方差分析結果Tab.4 Analytical results of variance

結果顯示:該模型顯著水平P值小于0.000 1,失擬項顯著水平P值為0.240 4,說明該模型可以把各因素和M的關系函數化,且預測準確率較高;模型確定系數R2為0.990 0,校正確定系數R2Adj為0.977 1,說明預測值和試驗值非常吻合,模型的可靠性高;模型的差異系數為3.16%,說明該模型的精密度較高。綜上,說明該模型可以很好地用來預測4種硝基呋喃類代謝物的衍生條件。因素A、B、C、A2、B2、C2及交互項AB對M存在極顯著影響(P＜0.01),交互項AC、BC對M無顯著影響(P＞0.05)。C因素在單因素試驗中差異不顯著(P＞0.05),在響應面分析中差異極顯著(P＜0.01),說明C因素與其他因素可能存在一定關聯,而響應面試驗的多因素分析消除了其他因素的影響,致使C 因素顯示出了獨立作用。為了更直觀地研究交互變量AB、AC、BC間的相互作用,構建其等高線圖與響應面圖,見圖1。

圖1 衍生試劑體積與衍生溫度、衍生試劑體積和衍生時間、衍生溫度和衍生時間的交互作用的等高線圖與響應面圖Fig.1 Contour plots and response surface plots of the interaction of derivatization reagent volume and derivatization temperature,derivatization reagent volume and derivatization time as well as derivatization temperature and derivatization time

由圖1可知:對于等高線圖,衍生試劑體積(A)和衍生溫度(B)的交互作用的等高線為橢圓形,說明二者間存在較強的交互作用;其他兩對因素相互作用的等高線接近圓形,說明這兩對因素的交互作用不強。對于響應面圖,衍生試劑體積(A)和衍生溫度(B)的交互作用的響應面很陡峭,說明二者間存在較強的交互作用;其他兩對因素交互作用的響應面較平緩,說明這兩對因素間的交互作用不強。綜合分析發現,上述結果與表4方差分析的一致。

采用Design-expert.V.8.0.6.1軟件預測3因素的最優值,結果為衍生體積352.15μL、衍生溫度45.71 ℃、衍生時間2.50 h,回收率綜合評分M為1.020 2。為了便于操作,選擇衍生體積350μL、衍生溫度46 ℃、衍生時間2.5 h,并在此條件下進行3次平行試驗驗證,所得AMOZ、AHD、AOZ、SEM 回收率分別為107%,107%,106%,99.8%,回收率綜合評分M為0.999 2,與預測值(1.020 4)接近,說明所建模型準確可靠。

2.2 復溶溶劑的選擇

試驗考察了復溶溶劑分別為甲醇、體積比為1∶1的0.1%(體積分數)甲酸溶液-乙腈混合溶液和50%乙腈溶液時對4種硝基呋喃類代謝物峰面積的影響。結果顯示,復溶溶劑為50%乙腈溶液時,4種硝基呋喃類代謝物峰面積較高,這是由于將水與乙腈混合后,溶液黏度下降,霧化效果變好,有且于噴霧電壓的穩定[26]。因此,試驗選擇的復溶溶劑為50%乙腈溶液。

2.3 儀器工作條件優化

2.3.1 質譜條件

三重四極桿質譜儀可根據化合物保留時間的差異區分各化合物,從而有效避免假陽性離子的干擾[17,29]。API-ESI可在霧化針尖端使攜帶待測物的流動相發生霧化,霧化形成的液滴在電極和毛細管的電場作用下帶電,液滴中的溶劑被干燥氮氣的反向流動帶走,液滴收縮。當液滴表面的靜電排斥力超過表面張力時,發生庫侖爆炸,待測物離子被靜電作用吸附飛入毛細管,從而被三重四極桿質譜儀檢測。為了提高待測物的離子化效率和靈敏度,試驗還優化了碎裂電壓、碰撞能量和駐留時間等參數,優化后的質譜參數見表1。

2.3.2 色譜條件

考慮到色譜柱、流動相等色譜條件會影響4種待測物的峰形、響應值、駐留時間等,試驗首先考察了Alltech Alltima C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)和Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm)對這4種待測物分離效果的影響。結果顯示,以后者分離時,4種待測物具有更好的分離度和峰形。試驗還比較了流動相分別為0.1%甲酸溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-乙腈、0.1%甲酸溶液-體積比為1∶1 000的甲酸溶液和乙腈的混合溶液等體系時對4種待測物分離效果的影響。結果顯示:以0.1%甲酸溶液-甲醇體系為流動相時,4種待測物峰形尖銳、對稱性好,但響應值低;以0.1%甲酸溶液-體積比為1∶1 000的甲酸溶液和乙腈的混合溶液體系為流動相時,總離子流會聚集在一起,除AMOZ峰形完整,其他3種待測物色譜峰均會分叉;以0.1%甲酸溶液-乙腈體系為流動相,且二者體積比達到1∶1時,4種待測物峰形尖銳、對稱性好,半峰寬窄,響應值高,這是由于以乙腈作為有機相時靈敏度較甲醇的更高[28],且在水相中添加適量甲酸有利于提高正離子模式下待測物的離子化效率。綜上,試驗采用的分離柱為Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18色譜柱,流動相為體積比為1∶1 的0.1%甲酸溶液-乙腈的混合溶液。在優化的儀器工作條件下,4種硝基呋喃類代謝物的色譜圖見圖2。

圖2 4種硝基呋喃類代謝物衍生物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 4 nitrofuran metabolite derivatives

2.4 基質效應

前處理過程不能將樣品中的蛋白質、脂肪等內源性干擾物質完全去除,而本方法所用色譜柱長度較短,色譜分離時間短,無法進一步將殘留的內源性干擾物質與待測物完全分離。在進行質譜分析時,電離過程中這些干擾物質容易產生基質效應,從而影響待測物結果的準確度[30]。本工作參考文獻[16],以空白草魚樣品溶液作為基質溶液配制基質匹配混合標準溶液,按照試樣方法處理和測定該溶液和等濃度水平的混合標準溶液,采用前后二者中各待測物衍生物峰面積的比值評價基質效應。結果顯示,4種待測物的基質效應值為0.88～0.96,說明存在不同程度的基質抑制效應,但是基質干擾不明顯。

考慮到歐盟第2005/34/EC 號條例已廢除[31],2019/18717號新條例將硝基呋喃類代謝物參考行動點設置為0.5μg·kg－1。為滿足歐盟新要求,試驗參考文獻[29,32]優化了質譜參數,采用MRM 模式檢測,同時以基質匹配法和內標法定量,將基質效應值優化至0.94～1.07,有效地降低了基質干擾(尤其是基質效應對AOZ 的干擾)和提高了方法的靈敏度。

2.5 工作曲線、檢出限和測定下限

在陰性草魚的魚肉樣品中分別加入1 mL 0.02,0.20,2.00,5.00,10.00,20.00,50.00μg·L－1的混合標準溶液,按照試驗方法測定,以各待測物的質量濃度為橫坐標,對應的衍生物峰面積與內標衍生物峰面積之比為縱坐標繪制工作曲線。結果顯示,4種硝基呋喃類代謝物的工作曲線的線性范圍均為0.02～50.00μg·L－1,其他線性參數見表5。在陰性草魚魚肉樣品中加入低濃度水平的混合標準溶液,按照試驗方法處理和測定,以3,10倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果見表5。

表5 線性參數、檢出限和測定下限Tab.5 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

由表5可知,AOZ、AHD、SEM 和AMOZ的檢出限為0.02～0.19μg·kg－1,測定下限為0.07～0.50μg·kg－1,檢出限小于歐盟第2019/18717 號條例設定的參考行動點。

2.6 精密度和回收試驗

按照試驗方法對陰性魚肉樣品進行0.2,2.0,10.0μg·kg－1等3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平平行測定5次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。結果顯示,AOZ、AHD、AMOZ 和SEM 回收率分別為107%～116%,106%～112%,101%～104%和85.1%～92.8%,測定值的RSD 為0.64%～9.8%,方法的回收率和精密度滿足GB 31656.13－2021《水產品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》的要求。

2.7 樣品分析

按照試驗方法分析55 份淡水魚樣品,結果顯示,AOZ、AMOZ 和SEM 檢出率分別為1.82%,1.82%,3.64%,其中AOZ和AMOZ的最高檢出量分別為0.24,0.13μg·kg－1,SEM 的檢出量在測定下限以下,AHD 未檢出,說明該方法適用于淡水魚中4 種硝基呋喃類代謝物的檢測。與 GB 31656.13－2021相比,本方法避免了固相萃取柱的活化、上樣、淋洗和洗脫等煩瑣步驟,將衍生時間從16 h縮短至2.5 h,色譜分離時間從7 min縮短至3.5 min,檢出限降低至0.20μg·kg－1以下,具有更高的靈敏度。

本工作通過優化前處理條件、儀器工作條件以及采用基質匹配法和內標法定量,縮短了樣品前處理時間,降低了基質效應,提高了方法的準確度和精密度,并將4種硝基呋喃類代謝物的檢出限控制在歐盟設定的參考行動點以下,可為淡水魚樣品中硝基呋喃類代謝物的快速檢測和多指標評價體系應用提供一定參考。