基于近紅外光譜法的定量分析模型快速預測蕨菜中總黃酮的含量

劉孝全 ,郝經文 ,陳乃東,3,4* ,張 莉 ,秦朝鳳

(1.安徽中醫藥大學 藥學院,合肥 230031;2.皖西學院 生物與制藥工程學院,六安 237012;3.安徽省中藥資源保護與持續利用工程實驗室,六安 237012;4.安徽省中藥質量評價與品質提升重點實驗室,六安 237012)

蕨菜(Pteridiumaquilinum)為蕨科蕨屬植物蕨的幼嫩葉和莖[1],生長于山林野地,口感鮮美脆爽,是深受人們喜愛的山野菜。蕨菜含有萜類、黃酮類和多糖類等生物活性物質,其根莖或全草均可入藥,具有較高的藥用和食用價值[2]。黃酮類化合物是蕨菜的主要有效成分,具有降血脂、降血糖、抗過敏、抗氧化、提高機體免疫力等多種藥用保健功能,利用價值很高[3-5]。蕨菜中總黃酮的傳統測定方法主要為比色法[6],但該方法耗時較長、操作復雜、耗費試劑多,無法滿足蕨菜產業化生產過程的質量控制需要,因此亟需構建一種快速、綠色、簡單地測定蕨菜中總黃酮含量的方法。

近紅外光譜法具有分析快速、成本低、重現性好、測量方便等特點,可以利用全譜段或多波段組合數據進行定性或定量分析[7],在中藥鑒別、摻偽檢測、成分定量分析、產地判別等方面有廣泛應用[8-12],但是還未見該方法在蕨菜相關成分定量分析中的應用。鑒于此,本工作采用近紅外光譜法結合偏最小二乘法(PLS)建立了可預測蕨菜中總黃酮含量的定量分析模型,并采用完全外部驗證法考察了模型的預測準確度,可為蕨菜產品質量控制提供技術支持,也可為天然產物或合成食品中主成分的快速無損檢測提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

TANGO 型傅里葉變換近紅外光譜儀,包括厚度約1 mm 的標準樣品杯,OPUS 7.5采集及分析軟件;YGH-500S/BS 型遠紅外快速恒溫干燥箱;AE124型電子天平;UV-5200 型紫外-可見分光光度計;HH-M6型數顯恒溫水浴鍋;AQ-180E型多用途磨粉機;SZ-93型自動雙重純水蒸餾器。

蘆丁標準儲備溶液:100 mg·L－1,取經105 ℃烘干至恒重的蘆丁標準品10 mg,用70%(體積分數)乙醇溶液溶解并定容,搖勻備用。

蘆丁標準品的純度為98%;亞硝酸鈉、乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁均為分析純;試驗用水為雙蒸水。

140份蕨菜樣品(編號S1～S140)采集于2021年2～6月,來源于安徽省六安市的霍山縣、金寨縣、岳西縣,經皖西學院陳乃富教授鑒定為蕨菜[Pteridiumaquilinum(L.)Kuhn var.latiusculum(Desv.)Underw.]的幼嫩葉和莖。選擇其中20份樣品作為完全外部驗證集樣品,供完全外部驗證法,即紫外-可見分光光度法分析;采用MATLAB軟件中的肯納德-斯通(Kennard-Stone)算法將剩余120份樣品按照數量比2:1 劃分為校正集樣品(80份)和驗證集樣品(40 份),供近紅外光譜法分析,用于構建定量分析模型。

1.2 試驗方法

140份新鮮蕨菜樣品于60 ℃烘干,粉碎后過0.25 mm(60目)篩,干粉裝袋并密封,于干燥器中保存待用。分取干粉樣品0.5 g,置于標準樣品杯中,設置掃描方式為漫反射,光譜掃描范圍為4 000～11 500 cm－1,掃描次數為32 次,掃描頻率為7.5 kHz,分辨率為8 cm－1,吸收光譜圖縱坐標為logR－1(R為反射率),參比為空氣。每個樣品重復檢測6次,取其平均光譜作為原始光譜進行后續建模。

打開OPUS 7.5軟件中QUANT-2近紅外定量分析軟件包,選擇PLS構建定量分析模型,其中原始光譜預處理方法選擇一階導數(FD),建模波段選擇6 100～7 500 cm－1、5 400～6 000 cm－1,主因子數選擇10。建模時以內部交叉驗證決定系數(R2)、交叉驗證均方根誤差(RMSECV)等指數評價模型性能。

1.3 完全外部驗證法

1.3.1 方法學考察

參照文獻[3]采用紫外-可見分光光度法進行方法學考察。取蘆丁標準儲備溶液0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0 mL,分別置于6支具塞試管中,用水定容至5.0 mL,加入50 g·L－1亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min。加入100 g·L－1硝酸鋁溶液0.3 mL,搖勻,放置6 min。加入40 g·L－1氫氧化鈉溶液4.0 mL和水0.4 mL,搖勻,放置15 min,以水為參比,于510 nm 處測量顯色體系的吸光度,此時顯色體系中蘆丁的質量濃度分別為0,0.01,0.02,0.03,0.04,0.05 g·L－1。以顯色體系中蘆丁的質量濃度為橫坐標,其對應的吸光度為縱坐標繪制標準曲線,所得線性回歸方程為y＝6.850×10－2x－3.000×10－4,線性范圍為0.01～0.05 g·L－1,相關系數為0.998 1,檢出限為0.01 g·L－1,精密度和準確度均符合要求。

1.3.2 實際樣品檢測

取蕨菜干粉樣品2.0 g,加入80%(體積分數)乙醇溶液30 mL,于80℃冷凝回流提取2 h,冷凝液用中速濾紙過濾。重復提取2 次,合并濾液,分取1 mL,用水定容至5.0 mL,后續顯色及測定步驟同1.3.1節,所得總黃酮測定結果用于1.2節所建模型的完全外部驗證。

2 結果與討論

2.1 完全外部驗證法的測定結果

按照1.3節紫外-可見分光光度法分析140 份蕨菜樣品,所得結果見表1。

表1 蕨菜樣品中總黃酮的測定結果Tab.1 The determined results of total flavonoids in Pteridium aquilinum samples

由表1可知,蕨菜中總黃酮的測定值分布范圍較大,滿足建立近紅外定量分析模型的要求。

2.2 原始近紅外光譜的分析

采集S1～S140樣品在4 000～11 500 cm－1波段內的近紅外光譜,結果見圖1。

圖1 蕨菜樣品的原始近紅外光譜Fig.1 The raw near infrared spectra of Pteridium aquilinum samples

由表1可知:140份樣品的近紅外光譜圖走向基本一致,但是響應信號存在一定差異,說明樣品中各成分的含量存在差異,這為蕨菜中總黃酮含量的定量分析提供了光譜數據;波數大于9 000 cm－1的高倍頻區吸收較弱,而波數4 000～9 000 cm－1內的合頻區、一倍頻區、部分高頻區有強烈吸收,這和蕨菜中大量含氫基團振動有關,但是這段譜區的光譜圖有大量重疊,且包括基線漂移(主要由樣品粉碎粒度、樣品顏色、儀器狀態等引入)、噪聲等無效信息。因此,需選擇合適方法進行光譜預處理,以提高預測模型的準確度和可靠性。

2.3 光譜預處理方法的選擇

常用的光譜預處理方法有消除常數偏移量(COE)、多元信號校正(MSC)、矢量歸一化(SNV)、最大-最小歸一化(MMN)、FD、二階導數(SD)等。試驗以上述6種方法以及FD＋MSC、SD＋SNV 處理和不處理原始近紅外光譜,并以R2、RMSECV 評價模型性能。R2越接近1,RMSECV 越小,說明所建模型越穩定,預測準確度越高,所得結果見表2。

表2 光譜預處理方法對模型性能的影響Tab.2 Effect of spectral pretreatment method on the performance of model

由表2 可知,采用FD 處理時,R2較大,RMSECV較小,模型性能優于不處理和其他預處理方法的,因此試驗選擇的光譜預處理方法為FD。

2.4 建模波段的選擇

近紅外全譜中存在一些信噪比較高但光譜強度較低或與待測成分化學特征相關性較弱的光譜區域,這些光譜區域對預測模型貢獻較小,應被剔除。黃酮類化合物結構中包括2個苯環,大多數還包括酚羥基等,將這一特征與相關文獻[13-14]研究結果相結合,總結蕨菜近紅外光譜中黃酮類化合物的特征吸收峰歸屬:C－H伸縮振動的合頻吸收帶及C－H、C－C、C－O－C 伸縮振動的組合頻吸收帶位于4 100～4 200 cm－1、5 400～6 000 cm－1處,CC伸縮振動的合頻吸收帶位于4 300～4 700 cm－1處,C＝O 伸縮振動的二級倍頻吸收帶以及O－H與O－H 伸縮和彎曲振動的組合頻吸收帶位于4 700～5 250 cm－1、9 500～11 050 cm－1處,酚羥基的一級倍頻吸收帶、C－H 伸縮振動的一級倍頻吸收帶與酚羥基伸縮振動的二級倍頻吸收帶位于6 100～7 500 cm－1處,C－H 伸縮振動的二級倍頻吸收帶位于7 800～9 000 cm－1處。利用以上近紅外光譜中黃酮類化合物特征吸收峰歸屬的分配結果(近紅外光譜歸屬分配結果)、全譜和OPUS 7.5軟件模擬結果,選擇10種可能的波段進行建模,以R2和RMSECV 評價不同建模波段所建模型的性能,結果見表3。

表3 建模波段對模型性能的影響Tab.3 Effect of modeling waveband on the performance of model

由表3 可知:在6 100～7 500 cm－1、5 400～6 000 cm－1波段內建模時,所得模型的R2高達0.986 3,RMSECV 低至0.102,比其他建模波段所得模型性能更優。因此,試驗選擇的建模波段為6 100～7 500 cm－1、5 400～6 000 cm－1。

2.5 主因子數的選擇

主因子數是影響模型預測準確度的重要因素之一。試驗考察了主因子數分別為1～15(間隔為1)時對模型性能指數RMSECV 的影響。結果顯示:RMSECV 隨著主因子數的增大而減小,當主因子數不小于10時,RMSECV 減小趨勢趨于平緩?？紤]到主因子數越大,模型計算量越大,模型穩定性越弱,因此試驗選擇的主因子數為10。

2.6 預測模型的建立

利用OPUS 7.5軟件構建校正集模型與驗證集模型,所得預測值與測定值的相關性見圖2。

圖2 蕨菜樣品中總黃酮含量的預測值與測定值的相關性Fig.2 Relationship between the predictive values and determined values of total flavonoids in Pteridium aquilinum samples

結果顯示,預測值和測定值擬合曲線為y＝0.952 4x＋0.171 5,斜率趨近于1,截距較小,說明二者結果較接近。校正集模型所得R2為0.991 9,校正均方根誤差(RMSEC)為0.078;驗證集模型所得R2為0.984 1,預測均方根誤差(RMSEP)為0.125,RMSEP與RMSEC差值僅為0.047。以上結果說明,構建的模型預測性能良好,準確度較高。

2.7 模型的完全外部驗證與評價

為進一步驗證模型的預測精度,使用該預測模型對完全外部驗證集樣品中的總黃酮含量進行預測,并與測定值進行比較,以二者比值的百分數計算預測回收率,結果見表4。

表4 完全外部驗證集樣品中總黃酮測定值與預測值的比較Tab.4 Comparison between the determined values and the predictive values of total flavonoids in completely external validation set samples

由表4 可知:預測值與測定值的偏差為－0.107%～0.162%,預測回收率為97.4%～104%,接近100%,說明預測模型的準確度較高。

本工作利用近紅外光譜法建立了可以預測蕨菜中總黃酮含量的定量分析模型,該模型分析快速、可靠性強、準確度高,不需要進行樣品預處理,不需要添加化學試劑,節省了大量人力物力,提高了分析效率,可為蕨菜的質量評價體系的建立提供數據參考。