氧化石墨烯包封的酵母細胞對鎘離子的吸附作用

劉 園 劉素素 李璋龍 陳嘉程 宋海紅 喻長遠 劉佳蕙 王詩卉*

(1.北京化工大學 生命科學與技術學院, 北京 100029;2.北京大學 化學與分子工程學院 分析測試中心, 北京 100871)

引 言

鎘是一種強毒性的有色稀有重金屬,作為一種重要的工業原料,被廣泛應用于各個領域。 但是由于各種原因,相當數量的鎘被排放到環境中,造成環境污染,并危害人類健康[1]。 鎘在人體內不易被排出降解,會對人體的各個系統造成損害。 流行病學數據表明,鎘的暴露與前列腺癌、結腸癌和肝細胞癌等密不可分[2],并且鎘能夠穿過血腦屏障,在大腦中積累,導致神經毒性[3]。 因此,去除環境中的鎘對于環境保護和人類健康具有十分重要的意義。 目前,鎘的去除方法主要有物理法[4]、化學法[5]和生物修復法[6]。 物理法和化學法雖然能夠在短期內降低環境中的鎘離子濃度,但是工作量過大,投資費用較高,并且一些試劑投入到環境中可能造成二次污染。 生物修復法利用生物的生命代謝活動來降低環境中重金屬離子的濃度,使被污染的環境能夠部分或完全恢復到原始狀態[7]。 與傳統的物理化學等處理方法相比,生物修復法具有處理效果好、運行費用低、操作簡單、二次污染少等優點[8]。 微生物修復法是生物修復法中重要的組成部分,該方法通過微生物吸附環境中的重金屬離子來處理環境中的鎘污染[9-10],經過篩選或改造的微生物吸附劑對金屬離子具有很強的吸附作用。

釀酒酵母是一種常見的兼性厭氧性真菌,是當前被廣泛研究和表征的一種真核生物,也是大量生物學研究的基礎之一[11-12]。 酵母細胞(Yeast)具有特殊的菌絲體結構,是一種良好的重金屬離子吸附劑[13-15],不僅吸附量較大,而且吸附后便于分離。

石墨烯是一種新型的碳材料,其氧化物——氧化石墨烯(graphene oxide,GO)具有比表面積大、尺寸小、導電性和生物相容性優異等特點[16-17],GO已被證明是水處理中具有良好發展前景的吸附劑[18]。 研究表明,將GO 包裹在Hela 細胞上,GO 不會改變Hela 細胞的活力、活性氧和膜完整性[19],并且GO 可以保護細胞免受有機溶劑(二甲基亞砜、丙酮、甘油和乙醇)的傷害,減少Hela 細胞凋亡[20]。He 等[21]將GO 包封到Yeast 表面,與包封前相比,GO 包封可以使Yeast 更好地適應環境,同時Yeast的儲存時間也有所延長。 這為GO 包封在細胞表面對鎘離子進行吸附提供了可能。

在細胞水平上的金屬含量測定對于Cd2+吸附能力的研究具有重要意義,靈敏度極高的分析方法可以精確到單個細胞,然而,目前單細胞中的金屬含量測定仍然是一個巨大的挑戰。 電感耦合等離子體-質譜法(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)是目前最先進、靈敏度最高的超微量元素分析手段之一[22],該方法以獨特的接口技術將電感耦合等離子體(ICP)的高溫電離特性與四極桿質量分析器(MS)的快速靈敏掃描的優點相結合,形成一種可用于分析元素、同位素、單顆粒和單細胞的技術[23]。 但是,在測定細胞內金屬含量時,采用這種方法無法獲得單個細胞的相關數據。 單細胞ICP-MS(single-cell ICP-MS, SC-ICP-MS)技術使用專門的單細胞進樣系統與ICP-MS 在線聯用,可以高效、準確地對單個細胞中金屬離子進行定量分析。 目前,SC-ICP-MS 技術已應用于金屬組學[24]、藥物開發[25]、細胞計數[26]、癌細胞系[27]以及其他細胞生物學領域,在單細胞水平上的定量研究中發揮著重要作用[28]。

本課題組前期采用逐層(LBL)技術在聚電解質聚苯乙烯磺酸鈉鹽(PSS)和聚谷氨酸(PGA)的輔助下,將GO 成功包封在酵母細胞表面。 所制備的Yeast@GO 相比Yeast 具有更長的存活時間和更高的活性,并可提高Yeast 對pH 值和鹽脅迫的抵抗力,延長Yeast 的儲存時間[21]。 Yeast 是一種良好的重金屬吸附劑,GO 同樣是一種有前途的水處理吸附劑,為了探究GO 包封對Yeast 吸附Cd2+的影響,本研究采用LBL 技術將GO 包封在Yeast 表面,比較了包封前后Yeast 在正常環境和Cd2+環境下的生長情況,并采用SC -ICP -MS 技術研究了單個Yeast@GO細胞對Cd2+的吸附作用。

1 實驗部分

1.1 實驗原料和儀器

1.1.1 實驗原料

酵母細胞浸取液,Oxoid 公司;YPD 培養基和磷酸鹽緩沖溶液(PBS),Solarbio 公司;PGA(平均相對分子質量＞7 × 105)、PSS(平均相對分子質量約106)和片狀GO,上海源葉生物技術有限公司;戊二醛、叔丁醇、無水乙醇,分析純,北京奧博星生物科技有限公司;五水氯化鎘(純度98%),Macklin 公司。

1.1.2 實驗儀器

恒溫培養搖床(BHWY-100C 型),寧波賽福儀器服務有限公司;掃描電子顯微鏡(SEM) (S -3400N 型),Hitachi 公司;光學顯微鏡(XD20 型),宇博舜宇儀器有限公司;離心機(Heraeus pico 17 型),Thermo Fisher 公司;超凈工作臺(SW-CJ-1D 型),蘇州凈化設備有限公司;酶標儀(K3 Plus 型),Biotrand 公司;動態光散射儀(Nano-ZS90 型),Malvern公司;電感耦合等離子體-質譜儀(NexlON 350X型),PerkinElmer 公司。

1.2 Yeast@GO 細胞的制備

取-20 ℃冰箱保藏的酵母細胞浸取液,接種環滅菌后沾取少量酵母細胞浸取液在平板上劃線。 平板長出活力較高的單菌落后,挑取一個單菌落到液體YPD 培養基中,設置恒溫培養搖床的條件為30 ℃、180 r/min,將無菌離心管稍微擰松瓶蓋后放入培養搖床中活化。 將活化后的酵母細胞以4 000 r/min 離心4 min,去除殘留的YPD 培養基,用PBS 清洗2 次,將細胞濃度調整到108個/mL。 分別配制GO、PGA 和PSS 溶液各5 mg/mL,將酵母細胞與PGA 溶液以0.3∶1的體積比混合,于渦旋振蕩儀上振蕩混合3 min,離心去除上清,然后加入PBS 清洗2 次,將PGA 包封在Yeast 表面。 按照上述操作依次在酵母細胞表面包封PSS、PGA、GO、PGA、PSS,得到GO 包封的酵母細胞(Yeast@GO),其結構為6層殼結構,如圖1 所示,由內向外依次為3 層聚電解質、GO、2 層聚電解質。

圖1 Yeast 分層包被示意圖Fig.1 Schematic illustration of the layered coating of the yeast cells

1.3 Yeast@GO 細胞的表征

每次包封后取少量酵母細胞于光學顯微鏡下觀察其形態,放大倍數為10 倍;采用動態光散射儀測定其Zeta 電位。

取100 μL 的Yeast@GO 細胞懸液于3.5 mL 的新鮮液體YPD 培養基中,加入400 μmol/L 的Cd2+溶液400 μL 處理12 h,得到Cd2+處理的Yeast@GO細胞懸液。 分別將Yeast、Yeast@GO 和Cd2+處理的Yeast@GO 細胞懸液離心,加入2.5%戊二醛固定細胞,將固定好的細胞以3 000 r/min 離心10 min,棄去上清液,用PBS 清洗3 次。 將酵母細胞過濾在微孔濾膜上,取出濾膜對折兩次并用曲別針夾好。 使用不同濃度的乙醇脫水,每次10 min。 采用叔丁醇與無水乙醇的混合溶液(二者體積比為1 ∶1)置換3次,每次30 min。 經叔丁醇結晶后,將制好的樣品放入冷凍機中冷凍以去除叔丁醇。 將待測樣品用牙簽小心地涂在樣品墊上,噴金后通過掃描電子顯微鏡觀察樣品的微觀形貌。

1.4 Yeast 和Yeast@GO 細胞生長曲線的測定

分別取活化的Yeast 和制備的Yeast@GO 細胞400 μL 于試管內,加入4 mL YPD 液體培養基,設置3 組平行,于搖床培養箱內培養,在不同時間取100 μL 酵母細胞置于96 孔板內,使用酶標儀在600 nm 波長下測定其光密度(OD600)。 以培養時間為橫坐標,OD600為縱坐標繪制酵母細胞的生長曲線。

1.5 在不同濃度Cd2+環境中Yeast 和Yeast@GO細胞活性的測定

分別取100 μL 的Yeast 和Yeast@GO 細胞懸液于3.5 mL 新鮮的液體YPD 培養基中,加入不同濃度的Cd2+溶液400 μL,使得Cd2+的終濃度為100、200、400、800、1 000 μmol/L,對照組中加入400 μL去離子水代替Cd2+溶液。 于搖床培養箱中培養,在不同時間取樣,測定OD值。 另取500 μL PBS 作為空白組,測定其OD值。 按照式(1)計算培養24 h后的細胞活力A,然后根據細胞活力計算抑制率R(式(2))。

式中:ODA為空白組的光密度值,ODB為對照組的光密度值,ODC為實驗組的光密度值。

1.6 酵母細胞對Cd2+的吸附能力測定

1.6.1 供試樣品的制備

分別取100 μL 的Yeast 和Yeast@GO 細胞懸液于3.5 mL 新鮮的液體YPD 培養基中,加入不同濃度的Cd2+溶液400 μL,使得Cd2+的終濃度為100、200、400、800、1 000 μmol/L。 將細胞培養24 h,離心去除培養基,用超純水清洗3 次以去除未吸附的Cd2+,將細胞制成濃度為104個/mL 的細胞懸液。每個樣品中加入2 mL 濃硝酸溶液,消化至200 μL后定容至5 mL,得到供試樣品。

1.6.2 單個酵母細胞中Cd2+含量測定

使用ICP-MS 檢測單個酵母細胞中Cd2+含量。測試前在準備間打開水機,點火,等待20 min,待儀器穩定后進行調諧,設置ICP -MS 的各項參數(表1),然后測定供試樣品,根據儀器導出的數據進行繪圖分析。

表1 ICP-MS 的工作參數Table 1 Operating parameters of ICP-MS

2 結果與討論

2.1 Yeast@GO 細胞的表征結果

為了驗證Yeast@GO 細胞是否制備成功,在每次包封不同的材料后,取少量樣品在光學顯微鏡下觀察細胞形態,結果如圖2 所示。 由圖2(a) ～(d)可以看出,在逐層包封前3 層聚電解質PGA/PSS/PGA 后,Yeast 的形態并無明顯變化,呈現出較為分散、無明顯聚集的狀態。 由圖2(e)可以看出,在包封GO 后Yeast 出現明顯的聚集狀態,GO 包封在細胞表面后,細胞會出現聚集或者堆疊在一起形成多層細胞狀態,這與文獻[19 -21]的報道結果一致。由圖2(f)和(g)可以看出,繼續包封聚電解質PGA/PSS 后,Yeast 的聚集狀態消失,細胞又呈現出較為分散的狀態。

圖2 Yeast 細胞分層包被的光學顯微鏡圖像Fig.2 Optical microscope images of the layered coating of the yeast cells

分別對Yeast、Yeast@GO 和Cd2+處理的Yeast@GO 進行SEM 表征,結果如圖3 所示。 可以看出,Yeast 的表面較為平滑圓潤,GO 包封后Yeast 的表面變得粗糙,說明聚電解質及GO 成功包封在Yeast 表面。 經Cd2+處理后Yeast@ GO 的表面出現不同程度的損傷,說明Cd2+破壞了酵母細胞表面的包封殼。

圖3 Yeast、Yeast@GO 和Cd2+處理的Yeast@GO 的SEM 圖像Fig.3 SEM images of Yeast, Yeast@GO and Cd2+-treated Yeast@GO

在每次包封不同的材料后,取少量酵母細胞稀釋一定倍數,測量其Zeta 電位,結果如表2 所示。酵母細胞壁含有多種帶負電的物質,因此酵母細胞本身帶負電,其電位為-11.8 mV。 由于PGA 為正電解質,PSS 為負電解質,包封不同的聚電解質后,酵母細胞的Zeta 電位會出現如表2 所示的波動,說明每層聚電解質均成功包封在酵母細胞表面。

表2 Yeast 細胞分層包封后Zeta 電位的變化Table 2 Changes in the Zeta potential of the yeast cells after layered coating

2.2 Yeast 與Yeast@GO 細胞的生長曲線

為了探究GO 包封是否會影響Yeast 的正常生長,測定了Yeast 和Yeast@GO 細胞的生長曲線,結果如圖4 所示。 可以看出,Yeast@GO 與Yeast 的生長曲線相似,均呈S 型生長。 Yeast 的延滯期為12 h,在28 h 左右達到穩定期;Yeast@GO 的延滯期為8 h,在24 h 左右達到穩定期,表明GO 包封對Yeast 的生長沒有產生不利影響,Yeast@GO 具有自主裂解性,可以突破6 層包封層進行正常的生長繁殖。 GO 包封將Yeast 細胞的延滯期縮短了1/3,可以使其更快地適應環境,迅速增殖,說明GO 包封對Yeast 的生長是有利的,這為GO 包封的酵母細胞對鎘離子進行有效吸附提供了可能。

圖4 Yeast 和Yeast@GO 細胞的生長曲線Fig.4 Growth curves of Yeast and Yeast@GO cells

2.3 Cd2+濃度對Yeast 及Yeast@GO 細胞活性的影響

考慮到Cd2+對酵母細胞具有一定的殺傷作用,本文研究了Cd2+濃度對Yeast 和Yeast@GO 細胞活性的影響,結果如圖5 所示。 可以看出,Yeast 和Yeast@GO 細胞的OD600隨培養時間的增加而增大,較低濃度的Cd2+(100 μmol/L)對兩種細胞生長的影響較小;當加入高濃度的Cd2+(800、1 000 μmol/L)時,Yeast 和Yeast@ GO 細胞的生長均受到很大抑制。培養24 h 后,當Cd2+濃度為100 μmol/L 時,Yeast和Yeast@GO 細胞的生長抑制率分別為12.01%和16.95%;當Cd2+濃度為800 μmol/L 時,Yeast 和Yeast@GO 細胞的生長抑制率分別達到68.60%和71.60%。 以上結果表明不同濃度的Cd2+對Yeast和Yeast@GO 細胞生長具有不同程度的抑制作用,低濃度Cd2+的抑制作用較小,高濃度Cd2+的抑制作用較大,抑制作用呈現濃度依賴性,GO 包封并不能保護Yeast 免受Cd2+的影響。

圖5 Cd2+濃度對Yeast 和Yeast@GO 細胞活性的影響Fig.5 Effect of Cd2+concentration on activity of Yeast and Yeast@GO cells

2.4 Yeast@GO 細胞對Cd2+的吸附能力

將Yeast 和Yeast@GO 細胞在不同濃度的Cd2+中吸附24 h,采用SC-ICP-MS 技術測定單個細胞中Cd2+的含量,結果如圖6(a) ～(j)所示,圖中曲線為擬合出的檢測信號隨單個細胞中Cd2+含量變化的曲線。 在不同濃度的Cd2+處理下,單個Yeast和Yeast@GO 細胞中Cd2+的檢測信號均呈現出符合高斯分布的信號峰,峰值的位置(橫坐標)表示單個細胞中所含Cd2+的質量。 圖6 (k) 為根據圖6(a) ～(j)得到的不同Cd2+濃度下單個細胞中Cd2+的含量。 可以看出,隨著Cd2+處理濃度的升高,單個Yeast 和Yeast@GO 細胞中Cd2+含量逐漸增大,細胞吸附的Cd2+逐漸增多。 雖然Cd2+的濃度越高,對Yeast 和Yeast@ GO 細胞的抑制作用越大,但是細胞可以吸附更多的Cd2+,這與文獻[29]的報道結果一致。 酵母細胞對Cd2+的吸附過程存在快速吸附階段和慢速吸附階段,酵母細胞對Cd2+的吸附量主要取決于快速吸附階段[29-30],這個階段僅持續十幾分鐘,此時Cd2+對酵母細胞的抑制作用并不明顯,因此可以認為酵母細胞對Cd2+的吸附不會受到影響。 由圖6(k)還可以看出,在相同的Cd2+濃度下Yeast@ GO 比Yeast 能夠吸附更多的Cd2+。 在前文的結果中可知,GO 的包封能夠促進Yeast 的生長,同時GO 是一種很好的水處理劑,因此Yeast@GO 對Cd2+的吸附量較多可能與GO 促進Yeast 生長以及GO 本身的吸附作用有關。

3 結論

(1)采用LBL 技術將GO 和聚電解質包封在Yeast 細胞的表面,GO 的包封并未對Yeast 的生長產生不利影響,同時將Yeast 細胞的延滯期縮短了1/3。

(2)不同濃度的Cd2+對Yeast 和Yeast@GO 細胞的生長具有不同程度的抑制作用,并且抑制作用呈現濃度依賴性。

(3)采用SC-ICP-MS 技術對單個酵母細胞中Cd2+含量進行檢測,結果表明,隨著Cd2+處理濃度的升高,單個Yeast 和Yeast@GO 細胞吸附的Cd2+增多;與Yeast 細胞相比,在Cd2+濃度相同的情況下Yeast@GO 細胞能夠吸附更多的Cd2+。

本研究將Yeast 和GO 兩種良好的重金屬吸附劑結合在一起,這為合成新型、高效的Cd2+吸附劑提供了參考。 在后續的工作中,還將開展吸附動力學、吸附的影響因素、吸附劑的重復使用性以及吸附機理等方面的研究。