基于PI3K/Akt/NF-κB 信號通路探討高尿酸血癥合并非酒精性脂肪肝機制

龔曉紅李松偉李 桓*武上雯陸超群陳一鳴

(1.河南中醫藥大學,鄭州 450046;2.河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院),鄭州 450002;3.河南中醫藥大學第一附屬醫院,鄭州 450000;4.江蘇省泗陽康達醫院,江蘇 宿遷 223798)

高尿酸血癥(hyperuricemia,HUA)是以血液中尿酸水平增高為特征的一種代謝性疾病,是嘌呤代謝異常所致的代謝紊亂,嚴重者可發展為痛風[1]。非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是肝組織脂肪堆積導致的病理改變,可表現為肝細胞脂肪變性和脂肪性肝炎,疾病發展末期會形成肝硬化,有的發展為肝癌[2-3]。 近年來,我國人民生活水平不斷得到提高,研究發現NAFLD 和HUA 患病率都呈現增高的趨勢[1,4]。 研究發現二者不僅與血脂紊亂、肥胖、高血壓、2 型糖尿病等疾病相關,而且還是心血管等疾病的重要危險因素[5]。 HUA 與NAFLD 二者之間關系緊密[6]。 研究發現HUA 人群中NAFLD 的患病率顯著高于非HUA 人群,NAFLD 的病變程度也與血尿酸水平密切相關[7-8]。

PI3K/Akt 和NF-κB 信號通路在免疫和炎癥反應中發揮著重要作用[9-10]。 研究發現該信號通路分別與HUA 和NAFLD 發病密切相關[11-15],但尚無基于該通路探索高尿酸血癥合并非酒精性脂肪肝(hyperuricemia with nonalcoholic fatty liver disease,HUA-NAFLD)機制的相關研究。 本實驗通過PI3K/Akt/NF-κB 信號通路探討HUA、NAFLD 及HUANAFLD 之間關系,探討其發病機制,為未來研究該病藥物治療靶點提供一定理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雄性SPF 級SD 大鼠72 只,體重(200±10)g,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[SCXK(魯)2019-0003]。 在河南省中醫院(河南中醫藥大學第二附屬醫院)中心實驗室IVC 系統動物室[SYXK(豫)2016-0009]飼養。 光照為晝夜各12 h,自由飲食,濕度60%～70%,溫度20 ～25℃。 本實驗通過河南省中醫院實驗動物倫理委員會審批(AF/SC-21/01.0),遵守3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

氧嗪酸鉀(美國sigma 公司,批號STBJ5376);高酵母高脂飼料:48.5%的基礎飼料+10%糖、脂肪、酵母提取物,10.4%蛋白質,2%膽固醇和5%蛋黃粉等;高脂飼料:58.5%基礎飼料+10% 糖、脂肪,10.4%蛋白質,2%膽固醇和5%蛋黃粉等(江蘇省協同醫藥生物工程有限公司提供);羧甲基纖維素鈉(鄭州派尼化學試劑廠,批號20191107);油紅O 染液、蘇木素染液、分化液、返藍液(Servicebio 公司);HE 試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司,貨號G1076);兔抗大鼠GAPDH 抗體(CST 公司,貨號4970S);一抗兔抗大鼠PI3K(p85)、AKT、p-PI3K(pp85)、 p-Akt、 p65、 p-p65、 IκκB、 p-IκκB 抗 體(Immunoway 公司,貨號YM3503、YT0185、YP0765、YP0006、YT3108、YP0191、YT2303、YP0637);SDSPAGE 凝膠制備試劑盒(上海雅酶生物醫藥科技有限公司,貨號PG113);RIPA 組織裂解液(北京索萊寶科技有限公司,貨號R0010);BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECLPlus 超敏發光液、蛋白上樣緩沖液(北京索萊寶科技有限公司,貨號PC0020、PE0010、P1040); PVDF 膜(德 國 Millipore 公 司, 貨 號IPVH00010)。 脫水機、包埋機、病理切片機、組織攤片機(湖北惠達儀器有限公司);冰凍切片機(Thermo 公司);正置光學顯微鏡成像系統(日本尼康)。

1.3 實驗方法

1.3.1 HUA-NAFLD 模型制備、分組及給藥

將72 只SD 大鼠隨機分為空白組(Blank group)、HUA 組、NAFLD 組、HUA-NAFLD 組,每組16 只。 參照文獻[16-17]對3 個模型組進行造模:空白組予普通飼料喂養;NAFLD 組予高脂飼料喂養;HUA 組予氧嗪酸鉀乳懸液100 mg/(kg·d)皮下注射;HUA-NAFLD 組予高酵母高脂飼料喂養+氧嗪酸鉀乳懸液100 mg/(kg·d)皮下注射;空白組和NAFLD 組皮下注射等量生理鹽水。 所有大鼠均自由飲水、進食,記錄其精神狀態、體重、飲食情況。于第6 周末每組隨機處死2 只進行檢測,模型成功后繼續原飼料喂養,并分別于第8 周和第12 周末取材(每組8 只)。

1.3.2 大鼠體重、肝指數計算

大鼠麻醉后,對肝組織進行分離,生理鹽水漂洗2 遍,濾紙吸干后稱重,記錄重量并計算肝指數。大鼠肝指數(%)=肝重量/體重×100%。

1.3.3 生化指標檢測

半自動生化分析儀檢測血清中尿酸(uric acid,UA)、 肌 酐(creatinine, CREA)、 尿 素 氮(urea,UREA)、 谷 丙 轉 氨 酶(alanine aminotransferase,ALT)、 谷 草 轉 氨 酶( aspartate aminotransferase,AST)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triacylglycerol,TG)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein, HDL)、 低 密 度 脂 蛋 白( low-density lipoprotein,LDL)數值。

1.3.4 HE 和油紅O 染色法觀察肝組織病理變化

取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 大小的肝組織,固定液固定24 h,石蠟包埋,切約4 μm 厚的切片。 HE染色后,每張切片選取3 個視野在光學顯微鏡下觀察肝病理學改變。 制作肝冰凍切片,入油紅染O 液浸染8～10 min,60%異丙醇分化,蘇木素復染,返藍液返藍,然后封片,顯微鏡下鏡檢。

1.3.5 Western blot 檢測肝組織PI3K/Akt 和NF-κB 信號通路中相關蛋白

取肝組織100 mg,加入勻漿珠和裂解液進行勻漿和裂解。 裂解完全后收集上清,檢測蛋白濃度。加入5×蛋白上樣緩沖液,沸水浴15 min 變性。 經凝膠電泳分離蛋白,轉膜,封閉液封閉,加入一抗AKT、p-Akt、PI3K、p-PI3K、p65、p-p65、IκκB、p-IκκB均按照1 ∶1 000 進行稀釋,4℃孵育過夜,PBST 洗膜10 min 3 次,加入二抗(1 ∶10 000),室溫孵育2 h,PBST 洗膜10 min 3 次,洗去二抗。 加入ECL 溶液充分反應,暗室曝光,顯影。 目標條帶的灰度值采用Image J 軟件進行分析。

1.4 統計學方法

采用Graph prism 8.0.2 軟件進行統計分析,以平均數±標準差(±s)表示計量資料,若符合正態分布,則采用單因素方差進行組間比較,采用LSD 檢驗進行組內比較,以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠體重及肝指數變化

由圖1 可知,各組大鼠體重均隨時間推移而增加;在第12 周末,與空白組比較,NAFLD、HUANAFLD 組大鼠體重升高(P＜0.05,P＜0.01);與HUA 組比較,HUA-NAFLD 組大鼠體重升高(P＜0.05)。 與空白組比較,NAFLD、HUA-NAFLD 組大鼠肝指數升高(P＜0.05,P＜0.01);與HUA 組比較,NAFLD、HUA-NAFLD 組 大 鼠 肝 指 數 升 高(P＜0.01);與NAFLD 組比較,HUA-NAFLD 組大鼠肝指數升高(P＜0.01)。

注:第12 周末,與空白組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01;與HUA 組比較, *P＜0.05, **P＜0.01;與NAFLD 組比較, ▲▲P＜0.01。圖1 體重和肝指數比較Note.At the end of 12 weekends, compared with the Blank group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Compared with the HUA group, *P＜0.05,**P＜0.01.Compared with the NAFLD group, ▲▲P＜0.01.Figure 1 Comparison of body weight and liver index

2.2 各組大鼠血清生化指標比較

由圖2 可知,HDL 隨時間推移而下降,其余指標隨時間推移均升高。 由表1 可知,在第12 周末,與空白組比較,HUA 組UA、LDL 水平升高,NAFLD組HDL 水平降低,HUA-NAFLD 組UA、TC、TG、LDL水平升高,HDL 水平降低(P＜0.05,P＜0.01);與HUA 組 比 較,NAFLD 組UREA 水 平 降 低(P＜0.05);與HUA-NAFLD 組比較,HUA 組TC、TG、LDL 水平降低,NAFLD 組UA、TG、LDL 降低(P＜0.05,P＜0.01)。

表1 各組生化指標比較(±s)Table1 Comparison of biochemica lindexes in each group

表1 各組生化指標比較(±s)Table1 Comparison of biochemica lindexes in each group

注:與空白組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01;與HUA-NAFLD 組比較, *P＜0.05, **P＜0.01;與HUA 組比較, ▲P＜0.05。Note.Compared with the Blank group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Compared with the HUA-NAFLD group, *P＜0.05, **P＜0.01.Compared with the HUA group, ▲P＜0.05.

G組ro別ups UREA(mmol/L) UA(μmol/L) TC(mmol/L) TG(mmol/L) HDL(mmol/L) LDL(mmol/L)Bla空nk白g組roup 6.79±0.27 84.38±8.50 2.88±0.14 0.90±0.034 0.68±0.038 0.20±0.02 H HUUAA g r組oup 7.53±0.25 133.80±6.00## 2.97±0.18* 0.89±0.061** 0.6±0.03036 0.29±0.02#**N NAAF L FDL D g r組oup 6.13±0.28▲** 106.00±11.31** 3.38±0.16 0.85±0.053** 0.56±0.022# 0.25±0.01**H HUUAAN-N A A FL FDL D g r組oup 7.95±0.41 153.60±9.48## 3.69±0.14## 2.05±0.18## 0.51±0.02## 0.53±0.03##

圖2 生化指標比較Figure 2 Comparison of biochemical indexes

2.3 肝組織病理變化

HE 染色顯示,空白組大鼠肝細胞分布均勻,排列整齊,大小勻稱,肝竇正常,無細胞核偏移和脂肪變性;HUA-NAFLD 組大鼠肝細胞出現大量脂肪空泡,呈明顯氣球樣變,大量脂肪空泡將細胞核擠向一側,肝索結構模糊;NAFLD 組肝細胞細胞質中出現廣泛脂肪空泡,但較HUA-NAFLD 組明顯減少,細胞核未發生偏移;HUA 組肝細胞細胞質中可見少量脂肪空泡,肝索結構尚清楚(見圖3)。 油紅O 染色顯示,空白組肝油紅O 切片中未觀察到紅色脂滴;HUA 組第12 周末肝油紅O 切片中可觀察到微小的紅色脂粒;NAFLD 組肝組織可見彌漫紅色脂滴,紅色脂滴較HUA-NAFLD 組偏小;HUA-NAFLD 組可見明顯增多的較大的紅色脂滴,呈顆粒狀和彌漫性(見圖4)。

圖3 肝組織HE 染色Figure 3 HE staining of liver tissue

圖4 肝組織油紅O 染色Figure 4 Oil red O staining of liver tissue

2.4 肝組織PI3K/Akt 和NF-κB 信號通路中相關蛋白的表達水平

Western blot 結果顯示:與空白組比較,NAFLD組p-Akt/Akt、 p-p65/p65 水 平 顯 著 升 高, HUANAFLD 組p-Akt/Akt、p-PI3K/PI3K、p-p65/p65、p-IκκB/IκκB 水平顯著升高(P＜0.05,P＜0.01);與HUA-NAFLD 組比較,HUA、NAFLD 組p-Akt/Akt、pp65/p65 水平顯著下降,HUA 組p-IκκB/IκκB 水平顯著下降(P＜0.05,P＜0.01);與HUA 組比較,NAFLD 組p-p65/p65 水平顯著升高(P＜0.05)(見圖5)。

注:與空白組比較, #P＜0.05, ##P＜0.01;與HUA-NAFLD 組比較, *P＜0.05, **P＜0.01;與HUA 組比較, ▲P＜0.05。圖5 肝組織PI3K/Akt 和NF-κB 信號通路中相關蛋白的表達水平Note.Compared with the Blank group, #P＜0.05, ##P＜0.01.Compared with the HUA-NAFLD group, *P＜0.05, **P＜0.01.Compared with the HUA group, ▲P＜0.05.Figure 5 Expression levels of related proteins in PI3K/Akt and NF-κB signaling pathways in liver tissue

3 討論

HUA 和NAFLD 都屬于代謝性疾病范疇,目前臨床上主要應用降尿酸與降脂保肝等藥物聯合來治療HUA-NAFLD[1]。 由于西藥作用單一,副作用明顯,使得患者依從性降低,特別是無癥狀HUA 患者,給臨床用藥增加了難度[8]。 HUA 與NAFLD 在臨床中常相伴發生,但二者在疾病的發生和發展中是否互相影響,目前在其作用機制方面研究尚淺,應當加深其研究程度。 高尿酸血癥是脂肪性肝病和其他代謝并發癥患者的常見疾病,目前被認為是代謝功能障礙的生物標志物。 已有研究表明,高脂飲食會導致血漿甘油三酯和膽固醇顯著升高,同時增加尿酸濃度[18],精確闡明尿酸升高在NAFLD 發生的具體機制可能有助于將降尿酸治療作為預防NAFLD 的新靶點。 另一方面,若尿酸的升高其實是機體對NAFLD 所產生疾病效應的一種自我保護,對NAFLD 患者進行外源性補充尿酸也許可以變成治療NAFLD 的一種新思路。

在PI3K/Akt/NF-κB 信號通路中,AKT 作為一種絲蘇氨酸激酶,是PI3K/Akt 信號傳導通路下游的重要靶激酶,經過PI3K 磷酸化激活后可進一步使其下游信號傳導細胞因子Iκκs 磷酸化[10,19]。 Iκκ屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶復合體,一般情況下,NFκB 與IκB 結合存在于胞質中,磷酸化后的Iκκ 可通過泛素化或磷酸化激活IκB,使之與NF-κB 解離,從而使NF-κB 發生核轉位[20]。 NF-κB 是一種轉錄因子,在炎癥進展過程中發揮核心作用,其激活后可誘發機體產生C 反應蛋白、腫瘤壞死因子-α 等炎性因子,誘發炎癥反應[9,21]。 大量研究顯示,PI3K/Akt/NF-κB 信號通路與HUA 和NAFLD 的發生有密切聯系。 謝婷妃[14]研究發現高尿酸環境可使PI3K/Akt/NF-κB 信號通路相關蛋白表達水平上調,引發炎性細胞因子水平升高,導致人腎小管上皮細胞損傷。 抑制PI3K/Akt 和NF-κB 信號通路可降低HUA 模型鼠UA、CREA、UREA,改善大鼠腎組織病理形態學改變,保護HUA 模型鼠腎損傷[13,22]。抑制該通路還可以降低肝中TC、TG 含量,改善肝細胞脂肪變性和炎細胞浸潤,從而減輕NAFLD 產生的效應[12,15,21]。 因此,PI3K/Akt/NF-κB 信號通路的激活可能使肝腎功生化指標改變,加重肝腎組織病理改變,從而發揮其疾病效應。

本研究結果發現,與HUA-NAFLD 組比較,HUA組TC、TG、LDL 水平降低,NAFLD 組UA、TG、LDL降低。 HE 結果顯示,HUA-NAFLD 組大鼠肝細胞出現大量脂肪空泡,呈明顯氣球樣變,大量脂肪空泡將細胞核擠向一側,肝索結構模糊;油紅O 染色顯示,HUA-NAFLD 組可見明顯更多的大紅色脂滴,呈顆粒狀和彌漫性,病變程度較NAFLD 組和HUA 組更加嚴重。 Western blot 結果顯示,與空白組比較,NAFLD 組、HUA-NAFLD 組PI3K/Akt/NF-κB 信號通路中相關蛋白的磷酸化水平顯著升高;與HUA 組比較,NAFLD 組p65 磷酸化水平顯著升高;與HUA、NAFLD 組 比 較,HUA-NAFLD 組PI3K/Akt/NF-κB信號通路相關蛋白磷酸化水平也顯著升高。

綜上所述,通過對空白組、HUA、NAFLD 以及HUA-NAFLD 模型鼠的生化指標、肝病理及PI3K/Akt/NF-κB 信號通路進行探究,本研究發現PI3K/Akt/NF-κB 信 號 通 路 可 能 在HUA、NAFLD 以 及HUA-NAFLD 發病過程中發揮重要作用,對該病的發病機制及治療靶點可提供實驗依據。