lncRNA SNHG16 通過調控miR-570 對肝癌細胞索拉非尼耐藥的機制研究

柳 揚范 偉*丁 潔

(1.貴州省人民醫院肝膽外科二部,貴陽 550002;2.貴州省人民醫院腫瘤科,貴陽 550002)

原發性肝癌的死亡率在全世界排名第三,患病率位居第五,有約70%的肝癌患者在確診時已處于晚期,生存時長低于1 年[1-2]。 索拉非尼屬于在肝癌治療指南中主要推薦的診治晚期肝癌的重要方案,有效率約40%,但其長時間服用會出現耐藥性,最后導致治療效果相對較差[3-4]。 且有越來越多的學者研究顯示,腫瘤中的上皮-間質的轉化為影響藥物耐藥的因素之一,但耐藥機制尚不清晰,因而探究索拉非尼的耐藥機制對于晚期肝細胞肝癌臨床效果的改善及預后有著積極作用。 lncRNA 為一類特異性的非編碼RNA,在修飾組蛋白、重塑基因構造、轉錄及遺傳后基因的表達等過程中起到了一定的作用,SNHG16 屬于lncRNA 家族中的其中一員,且在miRNA 分子的作用下能夠對細胞的分化及增殖有效調節,并在腫瘤的化療耐藥及發展中有所參與[5]。 miR-570 是腫瘤抑制因子的一種,在減緩肝癌細胞增殖、血管的生長中有著重要的作用,且在血清及肝癌組織內其表達呈低水平[6]。 基于此,本文探究了lncRNA SNHG16 通過靶向調控miR-570 可有效改善肝癌細胞HepG2 對于索拉非尼的耐藥性,效果顯著。

1 材料和方法

1.1 細胞

人肝癌細胞HepG2 購自于(澳睿賽生物技術(上海)有限公司;貨號:ORC0088)。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI-1640 培養基(上海百賽生物技術股份有限公司,貨號:10-040-CM);MTT 試劑(艾美捷科技有限公司,貨號:MBS843090-C);Lipofectamine TM 2000 轉染試劑(11668019)購自于北京百奧創新科技有限公司;BCA 蛋白試劑盒(賽默飛世爾科技,貨號:23221-23230);CyclinD1、P21、MMP9、MMP2 抗體分別購自于上海撫生實業有限公司、北京澤平科技有限責任公司、北京義翹神州科技股份有限公司。 酶標儀(美谷分子儀器(上海)有限公司,型號:SpectraMax iD5);流式細胞儀(上海頂儀科技有限公司,型號:FACSCalibur)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

通過濃度遞增方法對肝癌細胞HepG2 實施長期的培養,創建索拉非尼耐藥HepG2 細胞株模型,即為HepG2-R。 使用HepG2 作親本細胞,通過在37℃、5% CO2的環境中培育,待細胞的狀態平穩后,在培養液中置入1、2、4、8 及16 μmol/L 索拉非尼,行1 周培育后,索拉非尼換為更高的含量,直到在索拉非尼(16 μmol/L)的培養液中細胞能穩定生長,說明誘導HepG2-R 細胞成功。 后續在培養基中對HepG2-R 細胞中低濃度的索拉非尼施以常規培育,維持耐藥性,且將HepG2 的正常細胞標記成HepG2-P。

1.3.2 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌細胞中表達水平檢測

提取肝癌細胞、正常肝細胞中總RNA,逆轉錄為cDNA,選取實時熒光定量法予以檢測lncRNA SNHG16、miR-570 表達量,采用Primer 5.0 軟件設計引物序列,PCR 反應體系:0.5 μL 的上下游引物、模板為2 μL cDNA、8 μL 的SYBR Green,放蒸餾水至30 μL。 反應條件:96℃ 6 min、92℃ 30 s、75℃45 s,80℃ 10 min,共行45 個循環,以GAPDH 為內參,采取2-△△Ct方法計算出lncRNA SNHG16、miR-570 的表達量。 (見表1)

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.3 細胞轉染

通過對SNHG16 的siRNA 進行合成,HepG2-R細胞按密度為2×105/孔置于6 個孔板內,待細胞開始貼壁后,放入含10%胎牛血清的RPMI-1640。 培養箱內培育24 h,細胞融合程度為35%～55%,后將完成稀釋的HepG2 siRNA 混合于LipofectamineTM2000 試劑中,產生HepG2 siRNA/LipofectamineTM2000 復合物,接著在細胞培養板孔中加HepG2 siRNA 轉染載體予以融合,后置入5% CO237℃的培養箱實施培育,6 h 之后換為RPMI-1640 培養液(含10% 胎牛血清),20 h 恢復生長,使用熒光顯微鏡檢測細胞熒光蛋白的表達量,使用qRT-PCR 法檢測轉染率,確認成功轉染后,分別將其記作HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 組、HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC 組、HepG2-R+anti-miR-570 組、HepG2-R + anti-miR-NC 組、 HepG2-R + pcDNA SNHG16 組和HepG2-R+pcDNA 組,用于后續的試驗。 接著將si-NC、si-SNHG16、miR-NC、miR-570 通過類似的操作在HepG2 細胞內實施轉染,分別記si-NC 組、si-SNHG16 組、miRNC 組和miR-570 組。

1.3.4 MTT 法測定細胞增殖抑制率

集取細胞,調至5×105/mL,于96 孔板內進行接種,加MTT 溶液(5 g/L 25 μL),培育4 h,去除清液,放入二甲基亞砜(DMSO)(120 μL),搖勻,直到結晶紫開始融化,后將酶標儀調到470 nm 波長,以此對細胞吸光(A)值進行測定。 細胞增殖抑制率=(對照組A 值-試驗組A 值)/對照組A 值×100%。并根據藥物的濃度及抑制率分別記作橫軸與縱軸,描繪出濃度對應的曲線,算出半數的抑制濃度IC50。

1.3.5 流式細胞儀檢測細胞的凋亡

按照上述的形式收集每組的HepG2-R 細胞通過PBS 洗滌后制出單細胞的懸浮液(2×105/mL),接著將100 mL 細胞懸浮液放入96 孔板中,后滴加Annexin V-FITC 6 mL,在5℃環境中培育約30 min,接著加4 mL 的碘化丙啶,均勻混合后于室溫下培育10 min,并采用流式細胞儀測試細胞的凋亡。

1.3.6 Transwell 測定細胞遷移

首先將細胞在無血清的培養基中培育24 h,集取細胞,調節至5×106/mL,取150 μL 的細胞放于Transwell 小室的上室中,取550 μL 含有清液的培養基放于Transwell 小室的下室中,后將Transwell 小室放置于培養箱內培育48 h,接著預備結晶紫染色液與甲醛固定液予以備用,后將Transwell 小室取出,利用棉簽緩慢地擦拭掉聚碳酸酯膜表面上的細胞,后將膜移置固定液內,30 ～35 min,接著將膜放入染色液內15 min 進行染色,后通過鑷子緩慢將膜的下方朝上置于載玻片予以固定,使用光鏡檢測細胞數目,取其平均數值。

1.3.7 CyclinD1、P21、MMP9、MMP2 檢測

選用Western blot 法測定細胞內的細胞周期蛋白(CyclinD1、P21、MMP9、MMP2)表達,首先在含甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液內使細胞發生裂解反應,取蛋白后經BCA 法對蛋白進行定量測定,接著在沸水內進行約15 min 的浸泡處理,使其變性,加樣本,調節60 V 電壓實施電泳處理,40 min 左右,調電壓到120 V 后繼續電泳,90 ～120 min 后停止,將蛋白經轉膜儀換至PVDF 膜上,在低溫環境下轉膜,完成后通過5%的脫脂奶粉進行1 h 封閉處理,培養一抗(抗體P21、CyclinD1、MMP2、MMP9)、二抗(經過氧化酶所標記后的LgG 抗體),并在暗室放置膜,加ECL 試劑,用凝膠檢測軟件觀察條帶的灰度數值,內參為GAPDH。

1.3.8 雙熒光素酶報告試驗

集取細胞,取裂解液裂解細胞,加熒光素酶底物(5 μL)、緩沖液,混勻,測定熒光強度,放入緩沖液及底物,混勻,對熒光的強度進行檢測。 實驗重復5 次,分別對各個樣本作復孔3 個,最后對熒光素酶強度比較分析,檢測SNHG16 聯合miR-570 在細胞中的影響。

1.4 統計學方法

采用SPSS19.0 軟件分析,shapiro-wilk 檢驗符合正態分布,以平均數±標準差(±s)表示,采用重讀測量方差分析,同一時間點兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,多組間進行比較采用F檢驗,以率(%)表示計數資料采用x2檢驗,P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌細胞組織及正常肝組織中的表達

如表2 所示,與人體正常肝組織相比,肝癌細胞組織的lncRNA SNHG16 表達升高,miR-570 表達下降,具有顯著性差異(P＜0.05)。

表2 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌細胞組織組及正常肝組織組中的表達(±s)Table 2 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cell tissue group and normal liver tissue group

表2 lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌細胞組織組及正常肝組織組中的表達(±s)Table 2 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cell tissue group and normal liver tissue group

注:與人體正常肝組織組相比, aP＜0.05。Note.Compared with human normal liver tissue group, aP＜0.05.

組別Groups宿主基因16 SNHG16 miR-570人體正常肝組織組Human normal liver tissue group 1.13±0.14 1.08±0.20肝癌細胞組織組Liver cancer cell tissue group 2.10±0.27a 0.61±0.15a t 12.350 7.281 P＜0.001 ＜0.001

2.2 lncRNA SNHG16 和miR-570 在肝癌細胞及肝癌不同濃度的索拉非尼耐藥細胞中的表達

如表3 所示,與HepG2-P 組相比,HepG2-R 組LncRNA SNHG16 表達上升,miR-570 表達水平下降(P＜0.05),表明與HepG2-P 組對比,HepG2-R 組細胞在索拉非尼濃度為1、2、4、8、16 μmol/L 中的抑制率均下降,IC50值上升,具有顯著性差異(P＜0.05)。

表3 lncRNA SNHG16 和miR-570 在肝癌細胞及肝癌不同濃度的索拉非尼耐藥細胞中的表達(±s)Table 3 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cells and Sorafenib resistant cells with different concentrations of liver cancer

表3 lncRNA SNHG16 和miR-570 在肝癌細胞及肝癌不同濃度的索拉非尼耐藥細胞中的表達(±s)Table 3 Expression of lncRNA SNHG16 and miR-570 in liver cancer cells and Sorafenib resistant cells with different concentrations of liver cancer

注:與HepG2-P 組相比, aP＜0.05。Note.Compared with HepG2-P group, aP＜0.05.

組別Groups宿主基因16 SNHG16 miR-570 半抑制濃度(μmol/L)IC50索拉非尼(μmol/L)Sorafenib 1 2 4 8 16 HepG2-P 組HepG2-P group 1.12±0.16 1.05±0.1 8 30.28±2.11 6.97±0.71 20.95±2.77 38.86±3.18 69.34±6.06 86.24±9.05 HepG2-R 組HepG2-R group 2.08±0.22a 0.59±0.10a 200.46±12.07a 5.06±0.57a 16.57±2.03a 24.43±2.26a 37.41±2.58a 40.57±5.69a t 13.670 8.652 53.790 8.125 4.940 14.330 18.780 16.550 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 lncRNA SNHG16 過表達聯合索拉非尼對HepG2-R 細胞增殖、凋亡、遷移的影響

如表4,圖1、圖2 所示,HepG2-R+pcDNA SNHG16 作為過表達組,其lncRNA SNHG16 表達明顯升高(P＜0.05),表明lncRNA SNHG16 過表達的HepG2-R 細胞株構建成功,與HepG2-R+pcDNA 組相比,HepG2-R+pcDNA SNHG16 組的遷移細胞個數及CyclinD1、P21、MMP-9、MMP-2 的表達水平降低,抑制率、凋亡率及P21 的表達水平上升,具有顯著性差異(P＜0.05)。

圖1 增殖、凋亡、遷移相關蛋白表達Figure 1 Expression of proteins related to proliferation,apoptosis and migration

圖2 細胞凋亡圖Figure 2 Cell apoptosis

表4 lncRNA SNHG16 過表達聯合索拉非尼對HepG2-R 細胞增殖、凋亡、遷移的影響(±s)Table 4 Effects of lncRNA SNHG16 overexpression combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

表4 lncRNA SNHG16 過表達聯合索拉非尼對HepG2-R 細胞增殖、凋亡、遷移的影響(±s)Table 4 Effects of lncRNA SNHG16 overexpression combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

注:與HepG2-R+pcDNA 組相比, aP＜0.05。Note.Compared with HepG2-R+pcDNA group, aP＜0.05.

組別Groups HepG2-R+pcDNA 組HepG2-R+pcDNA group H H ep e Gp G 2-2 R-R+p+cp Dc D NN AA S N SN H H GG 1 6 1 6 g r組oup t P宿S主N基H G因16 1 6 1.17±0.15 2.12±0.24a 13.000 ＜0.001 I抑nh制ibi率tio(n%ra)te 11.72±1.10 42.29±2.44a 44.240 ＜0.001 A凋po亡pt率osi(s%ra)te 17.87±2.09 22.41±3.24a 4.560 ＜0.001遷移的細胞個數(n)Number of migrated cells 138.51±10.16 83.28±7.55a 16.900 ＜0.001周Cy期cl素inD D 11 0.95±0.13 0.51±0.07a 11.540 ＜0.001 p21 蛋P2白1抗體0.35±0.09 0.73±0.14a 8.843 ＜0.001基質金M屬MP蛋-9白酶90.67±0.08 0.35±0.05a 13.140 ＜0.001基質金M屬MP蛋-2白酶20.83±0.09 0.49±0.06a 12.170 ＜0.001

2.4 抑制miR-570 表達聯合索拉非尼對HepG2-R細胞增殖、凋亡、遷移的影響

如表5,圖3、圖4 所示,與HepG2-R+anti-miRNC 組相比,HepG2-R+anti-miR-570 組miR-570 表達水平降低(P＜0.05),表明抑制miR-570 的HepG2-R細胞株構建成功,與HepG2-R+anti-miR-NC 組比較,HepG2-R+anti-miR-570 組CyclinD1、MMP-9、MMP-2表達水平降低,抑制率、凋亡率及P21 表達水平升高,差異具有統計學意義(P＜0.05)。

圖3 增殖、凋亡、遷移相關蛋白表達Figure 3 Expression of proteins related to proliferation,apoptosis and migration

圖4 細胞凋亡圖Figure 4 Cell apoptosis

表5 抑制miR-570 表達聯合索拉非尼對HepG2-R 細胞增殖、凋亡、遷移的影響(±s)Table 5 Effects of miR-570 inhibition combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

表5 抑制miR-570 表達聯合索拉非尼對HepG2-R 細胞增殖、凋亡、遷移的影響(±s)Table 5 Effects of miR-570 inhibition combined with Sorafenib on proliferation, apoptosis and migration of HepG2-R cells

注:與HepG2-R+anti-miR-NC 組相比, aP＜0.05。Note.Compared with HepG2-R+anti-miR-NC group, aP＜0.05.

組別Groups HepG2-R+anti-miR-NC 組HepG2-R+anti-miR-NC group H H ep e Gp G 2-2 R-R+a+na tn i-t mi-m iR iR-5-75 07 0 g r組oup t P微小mi R R N-5 A 7-05 701.11±0.12 0.52±0.09a 15.230 ＜0.001 I抑nh制ibi率tio(n%ra)te 12.36±2.25 41.61±3.18a 29.080 ＜0.001 A凋po亡pt率osi(s%ra)te 18.32±2.11 24.46±3.47a 5.856 ＜0.001 N遷um移be的r o細f m胞ig個ra數ted(c n e)lls 76.86±8.10 40.43±6.06a 13.950 ＜0.001周Cy期cl素inD D 11 0.76±0.09 0.39±0.06a 13.250 ＜0.001 p21 蛋P2白1抗體0.33±0.04 0.79±0.09a 18.090 ＜0.001基質金M屬MP蛋-9白酶90.68±0.07 0.25±0.04a 20.660 ＜0.001基質金M屬MP蛋-2白酶20.79±0.08 0.36±0.05a 17.650 ＜0.001

2.5 雙熒光素酶報告試驗

如表6 所示,雙熒光素酶報告試驗顯示,miRNC 組WT-SNHG16、miR-570 組WT-SNHG16、miRNC 組MUT-SNHG16、miR-570 組MUT-SNHG16 細胞相對熒光素酶表達活性分別為(1.16±0.14)、(0.50±0.10)、(1.02±0.08)、(0.98±0.07),且相較于miR-NC 組WT-SNHG16,miR-570 組WT-SNHG16 表達活性較低,說明lncRNA SNHG16 靶向調控miR-570。

表6 雙熒光素酶報告試驗(±s)Table 6 Double luciferase reporting tests

表6 雙熒光素酶報告試驗(±s)Table 6 Double luciferase reporting tests

注:與miR-NC 組相比, aP＜0.05。Note.Compared with miR-NC group, aP＜0.05.

組別Groups野生型宿主基因16 WT-SNHG16變異型宿主基因1 MUT-SNHG16 miR-NC 組miR-NC group 1.16±0.14 1.02±0.08 miR-570 組miR-570 group 0.50±0.10a 0.98±0.07 t 14.860 1.457 P＜0.001 0.156

2.6 過表達miR-570 干擾lncRNA SNHG16 對HepG2-R 細胞耐藥性的影響

如表7,圖5 所示,過表達lncRNASNHG16 可使HepG2-R 細胞中miR-570 表達下降(P＜0.05),與HepG2-R+pcDNA SNHG16 +miR-NC 組相比,HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 組的遷移細胞個數及CyclinD1、MMP-9、MMP-2 的表達水平升高,抑制率、凋亡率及P21 的表達水平降低,具有顯著性差異(P＜0.05)。

圖5 CyclinD1、P21、MMP-9、MMP-2 表達Western blot 圖Figure 5 Western blot expression of CyclinD1, P21,MMP-9 and MMP-2

表7 過表達miR-570 干擾lncRNA SNHG16 對HepG2-R 細胞耐藥性的影響(±s)Table 7 Effect of overexpression of miR-570 interfering lncRNA SNHG16 on drug resistance of HepG2-R cells

表7 過表達miR-570 干擾lncRNA SNHG16 對HepG2-R 細胞耐藥性的影響(±s)Table 7 Effect of overexpression of miR-570 interfering lncRNA SNHG16 on drug resistance of HepG2-R cells

注:與HepG2-R+pcDNA 組相比, aP＜0.05;與HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC 組相比, bP＜0.05。Note.Compared with HepG2-R+pcDNA group, aP＜0.05.Compared with HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC group, bP＜0.05.

組別Groups HepG2-R+pcDNA 組HepG2-R+pcDNA group HepG2-R+pcDNA SNHG16 組HepG2-R+pcDNA SNHG16 group HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC 組HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-NC group HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 組HepG2-R+pcDNA SNHG16+miR-570 group F P miR-570 0.93±0.13 0.44±0.07a 0.38±0.06 0.79±0.11b 14.880 ＜0.001 I抑nh制ibi率tio(n%ra)te 13.29±1.12 45.35±3.76a 47.30±3.13 18.68±2.09b 39.620 ＜0.001凋亡率(%)Apoptosis rate 17.95±2.11 20.46±2.87a 29.40±3.06 17.75±2.09b 11.930 ＜0.001 N遷um移be的r o細f m胞ig個ra數ted(c n e)lls 90.48±8.29 50.21±6.75a 47.37±5.42 80.54±7.67b 16.860 ＜0.001周Cy期cl素inD D 11 0.71±0.07 0.25±0.03a 0.24±0.04 0.62±0.06b 22.580 ＜0.001 p21 蛋P2白1抗體0.31±0.03 0.72±0.08a 0.76±0.09 0.45±0.05b 18.370 ＜0.001基質金M屬MP蛋-9白酶90.68±0.07 0.29±0.04a 0.25±0.03 0.54±0.05b 21.870 ＜0.001基質金M屬MP蛋-2白酶20.80±0.09 0.36±0.05a 0.32±0.03 0.60±0.07b 19.600 ＜0.001

3 討論

肝癌在每個年齡段都有可能會出現,各種類型肝炎病毒引起的慢性感染可致使機體發生慢性肝炎,伴隨疾病的進展發展為肝癌,且肝內脂肪的積累、肝硬化或長時間進食霉變的食物等均與肝癌疾病發生有著緊密聯系[7-8]。

化療是臨床治療癌癥最基本的方案之一,臨床救治失敗主要因為化療藥物的耐藥性產生、DNA 受損修復、藥物的排外、細胞凋亡等因素互相作用,使耐藥病理機制相對復雜[9]。 索拉非尼通過靶向多項相關靶點,可減緩腫瘤細胞的增殖及新生血管的產生,發揮對肝癌抑制的效果,并且該藥物為首要診治晚期肝癌的靶向藥物,能有效改善預后[10-11]。研究發現,上皮間質的轉化、腫瘤的微環境及信號通路等可能會與索拉非尼的耐藥有關[12-13]。 本文研究發現肝癌細胞HepG2 與lncRNA SNHG16 對索拉非尼耐藥有一定的關聯性,說明lncRNA SNHG16對miR-570 進行調控可有助于緩輕肝癌細胞對索拉非尼耐藥的預后。

研究顯示,lncRNA 在腫瘤出現及進展中有一定的參與,lncRNA 也可對肝癌的轉移起到調節作用[14-15]。 SNHG16 在乳腺癌、肝癌、結直腸癌等腫瘤組織及細胞中表達異常,與腫瘤細胞的侵襲、遷移及增殖相關[16-17]。 隨著臨床對miRNA 的研究不斷加深,可知其能對多類腫瘤發揮出明顯的調節作用,且在惡性腫瘤中表達異常,其主要的特異性常表現為對惡性腫瘤細胞增殖、分化的調控[18]。 研究顯示,miR-570 可在腫瘤產生及進展中有所參與,且可有效調節腫瘤免疫有關的靶向基因,進而對肝癌細胞的侵襲、轉移、增殖及凋亡的過程發揮一定的干預效果,同時可經調節B7-H1 基因進行靶向調控,抑制肝癌細胞的侵襲、增殖[19]。 研究發現,與人體正常的肝組織比較,肝癌細胞組織中的lncRNA SNHG16 表達升高,miR-570 呈低表達,且在HepG2-R+pcDNA SNHG16 組及HepG2-R+anti-miR-570 組中遷移細胞的個數及CyclinD1、P21、MMP-9、MMP-2、miR-570 的表達水平降低,lncRNA SNHG16、抑制率、凋亡率及P21 的表達水平升高;CyclinD1、MMP-9、MMP-2 的表達水平降低,抑制率、凋亡率及P21的表達水平升高,促進肝癌細胞的發展,經對lncRNA SNHG16 水平進行調控可有效改善HepG2-R 細胞耐藥性,與其他學者研究較相似[20-21]。 表明lncRNA SNHG16 經調控miR-570 水平表達,可有效改善HepG2 細胞對索拉非尼耐藥。

綜上所述, 在肝癌細胞中分析 lncRNA SNHG16、miR-570 的作用,探究lncRNA SNHG16、miR-570 在肝癌病癥中的病理機制,結果顯示lncRNA SNHG16 在肝癌索拉非尼耐藥細胞中呈高水平表達,經靶向調控miR-570 表達可有效促進索拉非尼的耐藥性,為臨床進一步分析肝癌索拉非尼耐藥病理機制指明了方向。