非人靈長類帕金森動物模型中的行為學評估

劉書一王正波

(1.昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院,省部共建非人靈長類生物醫學國家重點實驗室,昆明 650500;2.云南中科靈長類生物醫學重點實驗室,昆明 650500)

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是世界第二大神經退行性疾病,主要的病理表現為中腦黑質致密部的多巴胺能神經元的丟失和腦中路易小體的形成,從而引起病人出現靜息性震顫、運動遲緩、僵硬、步態障礙和姿勢不穩等運動癥狀,以及睡眠障礙、癡呆、焦慮、抑郁和便秘等非運動癥狀[1]。 目前針對PD 的藥物治療和手術治療雖然能夠在一定程度上緩解癥狀,但是無法阻止病情的進展[2],動物模型對于研究帕金森病的發病機制以及治療策略至關重要[3-5],非人靈長類(non-human priroate,NHP)帕金森動物模型可以較好的模擬該疾病,特別是在疾病早期階段的非運動癥狀的描述,以及疾病后期的運動障礙表型呈現。 針對運動障礙表型的行為學評估有助于PD 發病機制和治療的研究。本文針對非人靈長類帕金森動物模型中涉及的行為學評估方式的研究進展進行綜述,為將來PD 行為學研究提供參考。

1 非人靈長類帕金森動物模型的行為學優勢

嚙齒類動物是目前應用最廣泛的PD 動物模型,嚙齒類PD 模型可以重現PD 的部分行為癥狀,在此動物模型上開展的經典的行為學實驗包括自發旋轉實驗、阿撲嗎啡誘導的旋轉實驗、開放場實驗、滾軸實驗和水迷宮實驗等[6],對PD 的發病機制和治療的研究起到了一定的促進作用,但由于嚙齒類動物在大腦結構及行為表現等方面與人類相差很大,在嚙齒類PD 模型上獲得的研究結果很難進行臨床轉化[7]。 相比之下非人靈長類動物與人類在基因相似度和生理機能等方面有著更密切的關系,在大腦結構上和行為表現上與人高度近似。 尤其是獼猴、食蟹猴等猴模型,是典型的非人靈長類動物模型[8],它們具有精細的手部動作,可以抓取食物和操作物體。 此外具有和人類類似的面部表情,以及直立姿勢等進化優勢,因此利用非人靈長類帕金森模型研究PD 相關的行為癥狀會比嚙齒類動物更加有助于效果評估和臨床轉化[9]。 例如結合患者的臨床表現而衍生出的非人靈長類PD 評分量表,該量表主要涉及對模型動物的總體運動能力的評估[10],能夠用來評估模型動物的疾病的嚴重程度。 在PD 患者中,患者的精細運動,包括抓握、書寫等會隨疾病進展受到損傷,嚙齒類動物無法模擬這類手部的精細運動,非人靈長類動物具有與人類相似的手指,能夠進行一些更高級的手部精細運動,可以對非人靈長類PD 模型的精細運動進行測試,這一類測試則包含布林克曼板、走廊測試以及抽屜抓取實驗,可以綜合評估模型動物的總體和精細運動能力的變化[11]。

PD 患者中除了運動癥狀還存在非運動癥狀,這些癥狀不但包括從輕度認知障礙到癡呆以及精神癥狀和情緒障礙,而且大多都早于運動癥狀的出現,這些非運動癥狀也是導致患者生活質量差的關鍵因素,可以作為早期PD 診斷的標準之一。 非人靈長類有更好的社會化行為、情感表現以及睡眠節律,且具有更高級的認知能力,能夠進行較為復雜的測試,從而能夠進行非運動癥狀的評估。

認知功能障礙屬于PD 非運動癥狀中的一種,主要包括注意力、識別能力、工作記憶以及解決問題和執行能力下降,并且隨著疾病的進程,癥狀逐漸加重,非人靈長類動物相對于嚙齒類動物可以更好模擬PD 患者中的認知癥狀,可以用于研究與該病理表現相關的病理變化和內在機制,先前研究建立了一些認知檢測的測試,包括物體繞道檢索任務(object detour retrieval task, ODRT),延遲反應任務以及注意力轉移測試等,這些檢測項目不僅可以測試模型動物記憶能力的變化,還可以對注意力以及應變能力進行測試,以評估造模和治療對動物認知能力的影響。

隨著人們對于精神疾病的認識的深入,PD 患者的精神癥狀也得到了更多的關注,近年來研究發現有多達60%的PD 患者可以出現多種形式的精神癥狀,其較高的發病率和較低的診斷率使其成為診斷和治療中的挑戰性難題,目前PD 中精神病樣癥狀的發病機制仍然不清楚[12],非人靈長類相比嚙齒類動物具有更高級的情感,并擁有類似于人類社會的社會屬性和階級屬性,因此使用非人靈長類PD模型評估PD 中的精神病樣行為,對于研究PD 中精神病樣行為的發病機制及其中的分子通路等研究都具有重要的現實意義,因此也建立了針對精神病樣行為和認知障礙的評估包括評分量表和相關行為實驗[13]。

此外,在過去的幾十年中有大量的研究對PD中的睡眠障礙進行了調查,PD 中睡眠障礙的患病率高達90%,這些問題主要包括:失眠、白天過度嗜睡以及夜間睡眠覺醒等問題,非人靈長類動物具有和人類相似的睡眠節律,故非人靈長類PD 模型能夠更好的重現這些睡眠改變,例如在睡眠開始后覺醒次數增加,白天嗜睡以及快速眼動期睡眠的抑制等[14]。

非人靈長類具有的這些優勢,使量化與患者相似的運動障礙和非運動障礙特征成為可能,簡化了從實驗室的研究到臨床的轉化。 因此,建立合理客觀的行為學量化方式十分重要。

2 非人靈長類帕金森動物模型中的運動癥狀評估

2.1 帕金森病評分量表

PD 患者最為顯著的運動癥狀包括靜息性震顫、肌肉強直、運動遲緩以及姿勢步態異常等。 目前臨床上對于PD 患者的診斷評分量表也主要針對這些運動癥狀。 如前所述,非人靈長類PD 模型可以復制這些運動癥狀,針對特異性PD 癥狀,PD 評分量表是一種有力的評價工具。 目前,針對非人靈長類PD 模型的評分量表大多是由臨床患者評分量表為基礎改變而來,用來衡量非人靈長類PD 模型的造模情況和治療效果。

評分開始前,被測試的動物需要先熟悉錄像籠子,正式開始錄像的30 min 內,測試者分別在籠子的底部和頂部給予食物,用于評估動物如何站起,站起時是否搖晃以及支撐情況;隨后在籠子的中間將食物分別向左右移動,用于評估雙手的使用和震顫;測試者離開前將大塊的食物放在籠子里,以評估動物對物體的操控能力。 錄像結束后,由不同的測試者根據錄像和評分量表對猴子的行為進行評分,并消除不同測試者之間的誤差。 目前常用的評分量表主要有8 種,這8 種量表雖然都是針對PD中的主要癥狀,但是在評分的細節上會有一些不同之處,表1 將這8 種經典評分量表進行了總結概述,并對比了其優缺點[15-22]。

表1 8 種評分量表內容差異比較Table 1 Comparison of content differences of eight rating scales

在對比了不同量表的優缺點后可以發現,PD Kurlan 量表[19]對于運動和非運動癥狀的評價更為全面,得分描述也更為準確,從而降低了評分者之間的客觀差異性和難度,但仍缺乏對于攀爬能力的評估。 PD 評分量表的設計應該更加考慮向猴子行為的轉化,例如對攀爬能力和對刺激反應等,同時需要更準確的分數實例標準,可用于標準化不同測試者的評分。 針對這些問題,在實際應用中,可根據需要將不同量表結合使用,開發統一標準的培訓練習,以縮小測試者的主觀差異,這可以更好地幫助測試者定義PD 非人靈長類動物模型癥狀的嚴重程度。

2.2 手指精細運動評價

對非人靈長類PD 模型中精細運動的評估能夠指示活動的靈巧性,針對精細運動的評估方法包括FMS 測試、布林克曼板、手抓抽屜任務、走廊任務等。

不同的測試方法能夠評估不同水平的精細運動,FMS 測試在幾種測試方法中最為簡單可行,常被作為非人靈長類帕金森動物模型的造?；蛘咧委熝芯恐械闹匾袨閷W檢測項目之一,可以描述模型猴抓取食物的能力,實驗需要區分模型猴的左右手,并利用攝像機對過程進行錄像,在規定的時間內進行規定次數的測試,隨后對錄像進行分析,記錄不同的數據,例如反應時間、拿取時間和總時間等,這些指標能客觀量化猴子手部整體的抓取能力,但是FMS 測試只能評價相對較簡單的抓取運動,對更精細的手部運動的檢測較不敏感[23]。

相較于FMS 測試,布林克曼板能夠測試更精細的手部運動,該方法是1973 年Brikman 等[24]在研究恒河猴中左右手大腦控制的研究中建立的,該實驗中的食物顆粒,例如糖球或花生等會被放置在帶有小孔的板子中(圖1),考驗模型猴取食時的手部靈巧性,同時借助猴椅的幫助,可以區分左右手的靈巧程度,對于單側PD 猴模型的檢測十分有利,布林克曼板在后期還進行了改良,出現了旋轉的布林克曼板,錄像記錄被測試猴子取食的數量和接觸時間后,通過錄像數據分析可以評估實驗猴左右手的精細運動和靈活性,從而量化造?；蛑委熁謴颓闆r。

圖1 靜止和旋轉的布林克曼板示意圖Figure 1 Schematic of a Brinkmann plate at rest and rotating

除了這兩種經典的精細運動檢測方法之外,手抓抽屜任務[25]和走廊任務[26]也可以評估猴子手部力量和綜合運動能力,但是這兩種測試方法由于訓練難度高,硬件要求高等因素,實際應用相對較少。

在實際的實驗中,FMS 測試和布林克曼板與PD 評分量表通常結合使用,從而在一定程度上評估出實驗猴在PD 相關運動癥狀上的嚴重程度,達到互補的效果。

2.3 整體運動量變化的評價

除了PD 評分量表和手部精細測試之外,研究者根據猴子生性好動的特性,延伸出對整體運動量變化的一套評價體系,包括針對小體型狨猴的塔式測試[27],以及自主運動水平測試[28],該測試應用最廣泛,測試在有機玻璃建造的透明觀察籠子里進行,錄像機被設立在籠子的不同側邊,錄像的時間一般為20～40 min,錄像完畢后將視頻導入軟件中對猴子活動范圍和四肢活動進行圈定,以便于計算機算法可以對其活動進行計算,在分析完畢后,計算機可以自動生成猴子一定時間內在觀察籠中的運動距離,以及不同運動方式所占的時間和距離。整體的運動量能夠反映猴子的運動能動性和自主運動能力,隨著疾病的進展,猴子運動的能動性降低,并伴隨著運動能力的下降。

此外,利用不同的藥物例如阿撲嗎啡和左旋多巴也可以檢測整體運動的變化,該方法只能用于單側PD 模型,因為單側造模后猴子會向損毀側自發旋轉,使用一定量的多巴胺受體激動劑后,猴子會向健側進行旋轉,這種藥物的處理方式也可以證明造模的程度和治療的效果[29]。 該測試一般是對比給藥前后30 min 的轉圈次數,從而指示疾病的嚴重程度。

上述三類測試方法可以對PD 猴模型的運動癥狀進行評價,包括粗運動和精細運動以及總體運動量,測試者需要將以上評價方式結合使用,才能得到客觀準確、全面細致的數據,這對實驗的可信性至關重要,單一的評價方式會導致實驗結果主觀性過強,失去評價的意義。

3 非人靈長類帕金森模型中的抑郁水平評價

3.1 情感和社會行為相關的抑郁評價

近期有很多臨床前研究常聚焦于PD 中的抑郁癥狀[30],快感缺失被認為是抑郁癥的核心癥狀之一,研究者們利用非人靈長類動物對于糖水的天然偏好性,設計出了糖水偏好實驗,以評估快感缺失情況[31],實驗時同時給被測試猴一瓶糖水和一瓶純凈水,對比其對于糖水和純凈水的攝取量,通過對比不同時間的糖水飲用量的變化,評估其抑郁表型,糖水偏好實驗在很多的研究中被用于評估抑郁中的快感缺失,也證明了其可靠性。

對非人靈長類PD 模型的情緒障礙和社會行為相關的抑郁表現的評價主要是對比自身的一些典型行為,例如情緒障礙中典型的焦慮起搏、自損行為、刻板行為、擁擠姿勢等[32],這類行為以有/無來量化,通常以造模前為參照,抗抑郁藥處理后以上行為的變化,也可以反映PD 猴模型抑郁癥狀的存在[33]。

此外,非人靈長類動物與人類一樣具有社會屬性,它們有社會組織機制,并且有明確穩定的等級制度,研究表明等級較低的猴子在種群中具有更強的警惕性,獨處的時間更多,壓力相對更大,這類動物更容易觀察到抑郁相關的社會行為,且這類行為通常先于運動癥狀出現[34-35],因此研究抑郁行為時,動物的選擇也是重要的一環。

3.2 睡眠障礙評價

先前的研究表明,臨床PD 病人中的睡眠障礙的患病率高達90%,包括失眠、白天過度嗜睡、快速眼動期睡眠障礙、夜間睡眠驚醒行為,通常與抑郁并存[36]。 非人靈長類和人類具有相似的睡眠節律,例如晚上睡眠穩定,白天會有一些小睡等,適合用于研究PD 中的睡眠障礙[37]。 對睡眠的監測方式包括腦電圖、肌電圖以及眼電圖等侵入性策略,以及佩戴項圈,錄像后人工分析等非侵入性策略[38],需要關注的睡眠變化包括:

(1)在睡眠開始后醒來的頻率增加;

(2)白天更容易進行長時間的睡眠;

(3)快速眼動期睡眠被急性抑制[39]。

4 非人靈長類帕金森模型中的精神障礙和認知障礙

4.1 精神病樣行為評分

使用非人靈長類帕金森精神病樣行為評分量表(表2)可以對非人靈長類動物的精神狀態進行評估,在實驗的過程中對實驗動物進行2 h 的錄像,錄像后由測試人員對于視頻進行分析量化[40]。

表2 非人靈長類帕金森精神病樣行為評分量表Table 2 Nonhuman primate psychopathic-like behavior scale

對精神病樣行為的評估有利于尋找可能的分子機制和通路,為尋找PD 的早期發病機制提供有力的幫助。

4.2 帕金森相關的認知障礙

導致認知障礙的細胞和分子機制是未知的,有研究認為這種障礙可能與線粒體功能障礙相關[41],但仍需要進一步驗證,相關的行為學研究方式包括一些演化而來的檢索任務和視覺任務[42]。

在檢索任務中,ODRT 能夠檢測動物對執行任務的應變能力[43],其類似于嚙齒類動物行為檢測中的水迷宮或Y 迷宮實驗,該實驗中的任務在獎勵信息和錯誤信息之間存在沖突性,動物需要依靠繞道來獲取食物,這種能力是衡量其推理能力、積極能動性和解決問題能力的指標,所以可以用于衡量認知能力。

與之類似的是可變延遲反應任務(variable delay response task, VDR)[44]和修改延遲反應任務(modify the delayed response task, MDR)[45],VDR任務主要可以測試猴子的短期記憶的能力,短期記憶能力也是認知能力中很重要的一部分,該任務是由針對患者的經典測試威斯康辛卡片分類測試(wisconsin card sorting test, WCST)演變而來[46],在這項任務中包含有幾個不同的子測試,使得刺激的特征不斷發生改變,這就要求動物始終保持適當的反應策略,從而衡量動物的執行力和變通力。

PD 中的非運動癥狀雖然不如運動癥狀那樣典型,但是患者上的研究顯示其能夠指征早期的PD癥狀,目前有很多PD 動物模型在嘗試從病因角度造模,從而模擬早期的PD 進程,因此使用相關的行為評估策略,對在非人靈長類PD 模型中的早期的疾病診斷、生物標志物的篩選,早期神經保護藥物的開發,基因治療策略的檢測等都是不可缺少的工具。

5 非人靈長類帕金森模型中行為學相關深層指標

對于非人靈長類PD 模型的評估,除了以上介紹的行為學指標,還可以結合一些深層指標一起進行分析,包括影像學檢查、代謝物分析和病理學分析等。 影像學檢查主要包括核磁共振成像(magnetic resonance imaging, MRI)[47]、單光子發射計算機斷層掃描(single photon emission computed tomography, SPECT)[48]和正電子發射斷層掃描(positron emission tomography, PET)等,可以對腦結構、功能和分子變化等進行成像,結合行為學結果,可以評估出腦內結構等變化與行為之間的聯系[49]。此外,腦脊液或血液中的一些物質的變化,也被認為可以作為生物標記物來確認PD 的存在,其中包括在腦脊液(CSF)、血液中的α-突觸核蛋白(α-syn)總量及寡聚體量[50],相關外泌體[51]、microRNA[52]和炎癥相關標志物[53]等。 其中一些生物標志物結合影像學檢查以及行為學檢測,可以對PD 有較高的診斷性和預測價值。

以上的檢測方法可以在活體動物上實現對PD的診斷,病理學檢測則可以在組織學層面對PD 的一些指標進行檢測,經典的病理學檢測包括:黑質和紋狀體位置的多巴胺能神經元數量;腦中尤其是黑質和紋狀體的病理性α-syn 炎癥反應等[54]。 病理學檢測的指標來源于患者尸檢的結果,能夠對于疾病進程進行更準確的預測,同時結合行為檢測結果,可以幫助挖掘一些非運動癥狀背后的病理機制[55]。

6 結語

本綜述總結了在非人靈長類PD 模型中,針對運動癥狀和非運動癥狀被廣泛應用的測試方式,選擇不同的測試方法,能夠幫助研究者對不同方向進行表型和機理結合的測試,這對于在非人靈長類動物模型上進行PD 研究的研究者是十分有力的工具。