淋巴管生成的調節及其在心肌梗死中的作用研究進展

杜 清岳彤彤王 賀

(河南中醫藥大學第一附屬醫院,心臟中心/國家區域(中醫)心血管診療中心,鄭州 450000)

淋巴系統是液體運輸和細胞遷移的通道,淋巴網絡在調節心肌細胞外體積和免疫細胞穩態中起關鍵作用。 淋巴內皮細胞穩態是心臟生理功能正常發揮的前提,而淋巴管生成不足或功能障礙顯著影響心肌梗死(myocardial infarction, MI)后病理性心臟重塑。 VEGFC/VEGFR3 信號傳導長期以來一直被認為是淋巴管生成的主要分子驅動因素。 淋巴信號傳導的神經網絡是復雜的,目前已經發現淋巴管在腫瘤轉移和心臟修復的免疫調節中起著至關重要的作用[1]。 而心臟淋巴管生成也被提出作為預防心肌梗死后心力衰竭的治療靶點。 雖然調節功能性淋巴管的分子機制尚不完全清楚,但淋巴管生成與免疫調節之間的相互作用已被探索。 心肌梗死后,心臟淋巴管系統協調免疫反應和心臟重塑過程,尤其是巨噬細胞,通過受損心臟的淋巴管運輸調節MI 后的免疫應答和心臟修復。 針對淋巴管生成的實驗性治療策略也顯示出減少心肌炎癥、水腫、纖維化以及改善心臟功能的前景。

淋巴管與免疫系統之間密不可分,了解二者的關系能更好地理解淋巴管與心肌梗死后炎癥期之間的重要關系;了解心肌梗死后心臟及淋巴管基本的病理變化對疾病能有針對的治療方向;了解淋巴管生成的調控,以及巨噬細胞對淋巴管生成和心臟修復的影響對疾病能找到更好的治療靶點。 對以上內容進行總結,希望對淋巴管系統在心肌梗死后影響疾病的發展方向有更好的理解,為免疫細胞和淋巴管在損傷后心臟修復中的相互聯系提供了新見解,從而為臨床刺激淋巴管生成治療心臟疾病提供有效的依據。

1 淋巴管與免疫系統

淋巴系統由薄壁的初始淋巴管網絡、預收集管、集合管以及與血液循環系統平行的節點組成。初始淋巴管是由單層淋巴內皮細胞(lymphoendothelial cells,LECs)形成的,通過錨定絲與間質相連,沒有周細胞和平滑肌細胞的包裹,缺乏連續的基底膜,這一結構特征使毛細淋巴管壁具有高滲透性,能夠通過被動引流吸收多余的間質液和大分子[2]。 被初始淋巴管吸收的液體和大分子統稱為淋巴,它流入預收集淋巴管和集合淋巴管。預收集淋巴管和集合淋巴管由LECs 組成,與初始淋巴管不同,LECs 以拉鏈狀連接緊密連接,并覆蓋有平滑肌細胞和基底膜,以防止淋巴滲漏[3]。 集合淋巴管也包含管腔內閥,調節淋巴的單向流動[4]。

成人心臟的淋巴網絡密集于心室,稀疏于心房[5]。 心臟淋巴重塑(淋巴管生成)發生在許多以水腫和炎癥為特征的心血管疾病中[6],包括缺血性心臟病或晚期心力衰竭患者。 水腫或滲透壓升高刺激淋巴重塑,部分是通過巨噬細胞驅動的VEGFC產生。 除了維持間質液穩態,淋巴管系統還通過調節免疫細胞、細胞因子和抗原組織清除來調節免疫反應。 此外,淋巴管確保乳糜微粒攝取膳食脂質,并使膽固醇從組織逆向運輸到肝[7]。

淋巴管與免疫系統之間的相互作用關系復雜。許多促炎介質降低了淋巴管功能[8],但免疫細胞的組織清除仍依賴于淋巴趨化因子的活躍表達來選擇性地招募和排出不同的免疫細胞群。 同時,不同的免疫細胞群對淋巴內皮細胞的生長和生存產生刺激或抑制作用,影響淋巴重塑[9]。

2 心肌梗死后心室重構

心肌梗死后,如不加干預會進展為心室重構進而發展為心衰。 冠狀動脈阻塞導致血流中斷,心肌細胞立即死亡。 死亡的心肌細胞釋放細胞內蛋白質進入循環,并觸發炎癥反應,招募炎癥細胞浸潤組織,清除死亡的心肌細胞。 炎癥反應消失后,心肌成纖維細胞分泌的細胞外基質蛋白形成纖維化瘢痕。 心肌細胞為應對壁應力的增加引起梗死邊界區心肌細胞肥大、壁變薄和心室擴張。

在這一系列過程中,免疫細胞的浸潤是一把雙刃劍。 缺血損傷后的心臟免疫反應以免疫細胞浸潤為特征,不僅包括中性粒細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞(dendritic cells,DCs),還包括B 和T 淋巴細胞。 這些細胞共同協調死亡心肌細胞的移除,參與疤痕穩定和成熟所需的肉芽組織形成,并通過分泌促血管生成介質、抗凋亡介質和抗炎介質來調節隨后的心臟修復和炎癥消退階段[10]。 但是,由于低效炎癥反應引起的心臟慢性炎癥,通過誘導冠狀動脈內皮功能障礙和有害的心臟重塑(心肌細胞肥大和間質纖維化),加重心功能障礙,導致慢性心力衰竭的發展[11]。 因此,改善心臟炎癥是許多心血管疾病的治療目標,治療性淋巴管生成可以加速心肌梗死后心臟炎癥的消退。

3 心肌梗死后淋巴管的變化及作用

成人中,淋巴管是靜止的,但在病理條件下淋巴管生成被重新激活[12]。 MI 后淋巴管生成的增加與免疫細胞浸潤的增加有關,這是由受損細胞、細胞碎片和鄰近細胞的細胞因子釋放的促凋亡信號所吸引的[13]。 心肌梗死后,心肌內毛細淋巴管生成增多,心外膜預收集淋巴管和集合淋巴管的減少,導致心臟淋巴管的轉運能力降低,對梗死區和鄰近非梗死區的液體和炎癥排出產生負面影響,加重心功能障礙[14]。 臨床上,心肌梗死后可檢測到心肌水腫延伸到梗死區以外,這提示淋巴功能不足。 對大鼠進行實驗性的心肌梗死[14],在心臟的梗死區以及邊界區觀察到了淋巴管生成,增加的淋巴管生成可以通過促進免疫細胞清除和液體運輸來減緩或逆轉病理進展。 這一內源性淋巴管生成反應,主要由心肌缺血后VEGF-C 和VEGF-D 表達增加所驅動。雖然在梗死瘢痕處部分的毛細淋巴管擴張,但是并不能滿足心臟修復的需要。

有研究使用缺乏VEGF-C、VEGF-D 或VEGFR3的小鼠來阻斷淋巴管生成,結果顯示不會損害心肌梗死后2 周小鼠的心功能[15]。 雖然心臟淋巴管的減少不影響初始損傷后的心功能恢復,但增強淋巴管生成除了在急性恢復期外,還在慢性恢復期抑制心臟組織損傷[9]。 在小鼠中,通過激活VEGFR3 信號增強的淋巴管生成可以改善心功能并促進心肌梗死后的恢復,這表明增強淋巴管生成對心臟修復的治療潛力[16],通過淋巴管生成來維持正常的淋巴功能在長期內是必要的。

4 淋巴管生成的調控因素

在成人體內淋巴管生成主要發生在已存在的血管中。 在胚胎時期,淋巴管是在心血管系統建立并具有功能后出現的。 小鼠的遺傳實驗已經證實哺乳動物的淋巴管起源于胚胎靜脈[17]。 淋巴管向成熟淋巴網絡的發展依賴于VEGF-C、VEGFR-3、淋巴管內皮透明質酸受體(LYVE-1)、同源盒基因轉錄因子1(Prox1) 與Podoplanin(PDPN) 等的相互作用[18]。

4.1 Prox1

Prox1 啟動了LECs 的早期發育[19],是淋巴內皮發育過程中的特異性轉錄因子,影響著VEGFR-3 的表達[20]。 Prox1 已被證明可以通過Prox1-VEGFR-3反饋循環維持LECs 的表型[21]。 Prox-1 不僅編程LECs,且在細胞分化中起著重要作用[18]。 缺乏Prox1 的內皮細胞不能表達淋巴內皮標記物,而是保留其血管內皮表型。 Prox1 陽性內皮細胞從靜脈中萌發并以極化方式遷移形成淋巴囊。 Prox1 敲除胚胎缺乏淋巴囊和淋巴管,表明Prox1 不僅是LECs規范所必需的,也是淋巴管生成所必需的[18]。

4.2 VEGF 家族

VEGF 屬于血小板衍生的生長因子表基因家族,調節血管以及淋巴管生成。 VEGFR-2 在血管內皮細胞中高度表達,對血管生成至關重要。 VEGFR-3 是淋巴管發育所必需的。 在發育的早期階段,VEGFR-3 廣泛表達于內皮細胞中,隨著淋巴管系統的開始發育, VEGFR-3 的表達幾乎只局限于LECs[18]。 VEGF-C 的完全缺失會導致LEC 無法遷移出主靜脈,淋巴形成出現嚴重缺陷,從而導致水腫和產前死亡[22]。 VEGF-C 在大多數組織中通過多種細胞類型(包括心肌細胞)低水平表達。 VEGFC 水平在炎癥期間升高[5]。

在成年淋巴管系統的維持中并不需要VEGFC/VEGFR-3 信號通路[23],但過表達VEGF-C 或VEGF-D 可以誘導內皮細胞增殖、遷移和存活,刺激淋巴管生成。 心肌缺血后用VEGF-C 治療,促進了心臟淋巴管生成,可以通過增加多余蛋白質(如促炎介質)、免疫細胞和液體的淋巴引流能力,最終改善心功能[9]。 VEGF-C 及其受體VEGFR-3 通過激活淋巴管生成中的AKT/ERK1/2 和鈣調磷酸酶/NFATC1/FOXC2 通路,是缺血損傷后維持組織液平衡和心肌功能的關鍵[24]。

4.3 PDPN

Podoplanin 是一種小跨膜蛋白。 研究表明,PDPN 敲除小鼠具有淋巴/血管分離缺陷[25],并表現出淋巴管擴張和功能障礙以及淋巴水腫。 心肌梗死后PDPN 陽性細胞與免疫細胞之間的相互作用調節有助于免疫細胞的募集。 因此,PDPN 也被認為是MI 后增強心臟修復和恢復心功能的新的治療靶點[26]。

4.4 FOXC2

FOXC2 在成人發育中的淋巴管和淋巴管瓣膜中高度表達。 FOXC2 缺失會使集合淋巴管缺少瓣膜,淋巴異?；亓?毛細淋巴管被基底膜成分和平滑肌細胞異位覆蓋[27],這表明FOXC2 控制著負責淋巴管規范和集合淋巴管表型的遺傳程序。 FOXC2還在LEC 靜止過程中調節連接蛋白37(Connexin 37,Cx37) 和鈣調磷酸酶/活化T 細胞核因子(nuclear factor of activating T,NFAT)信號[28],所以FOXC2 對于淋巴管的成熟和維持是必要的。FOXC2 還被證明可以通過限制Hippo 通路轉錄共激活因子具有PDZ 結合基序的轉錄共激活因子(TAZ)介導的增殖來調節LEC 連通性的完整性,并維持LEC 細胞在受干擾流動區域的靜止,而TAZ 對維持淋巴瓣膜功能至關重要[28]。 FOXC2 也被證明與VEGFR-3 一起調節LECs 中的RAS/ERK 信號通路,這也表明它可以調節淋巴管生成[29]。

4.5 LYVE-1

LYVE-1 是最特異性的LEC 標志物,被廣泛用于評估心肌梗死后的心臟淋巴管生成,其在淋巴細胞、造血細胞和血管內皮細胞中不表達[30]。 在成人中,LYVE-1 在毛細淋巴管中保持高表達,在集合淋巴管中的表達減少[23]。

4.6 血管內皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)

VE-cadherin 是一種位于細胞連接之間的內皮粘附分子,在調節細胞增殖、凋亡、機械信號轉導和內皮生長因子受體功能中發揮重要作用。 VEcadherin 既是血管發育不可缺少的,也是淋巴組織中發展和維持心臟淋巴網絡所必需的[31]。 在LECs中,VE-cadherin 通過形成可滲透的紐扣狀連接或很大程度上不滲透的拉鏈狀連接,來調節內皮細胞的通透性,并選擇性地定位于整個淋巴血管系統,以調節淋巴管內液體的進入和運輸。 VE-cadherin 穩定質膜上的VEGFR3,為VEGF-C 的典型激活奠定了基礎,從而建立了心臟淋巴維持所需的功能性淋巴信號節點。 VE-cadherin 還通過作為內皮機械感覺復合體的中心成分,控制β-連環蛋白(β-catenin)和LECs 轉錄因子的表達, 并誘導 VEGFR2/VEGFR3-AKT 信號通路,對LECs 施加各種間接影響[32]。 研究證明VE-cadherin 的淋巴表達是胚胎期和出生后心臟淋巴系統的發育及其在成年期的維持的要求。 盡管VE-cadherin 的LEC 特異性損失小鼠會導致受傷心臟的淋巴管退化,但是在心肌梗死前后并沒有明顯損害心功能。 然而,VE-cadherin 缺乏小鼠心肌梗死后心肌梗死面積和纖維化增加,提示淋巴血管受損可能會影響心肌梗死后的長期心功能并加重心力衰竭[31]。

4.7 血管生成素(Ang)

Ang 生長因子與受體酪氨酸激酶2(Tie2)結合,并調節內皮細胞和壁細胞之間的相互作用。 Ang2敲除小鼠表現出淋巴管成熟缺陷,包括平滑肌細胞向集合管的招募受損和毛細淋巴管發育不良,表明淋巴管穩定需要Ang2[23]。

4.8 細胞外基質(ECM)

毛細淋巴管的LECs 不是附著在像血管一樣的基底膜上,而是通過由纖維蛋白和人彈性蛋白微纖維界面蛋白1(emilin-1)組成的彈性錨定絲附著在周圍的ECM 如I 型膠原蛋白和纖維連接蛋白上。水腫期間,扭曲的ECM 成分對錨定絲的拉力增加,使毛細淋巴管保持開放,增加組織液吸收[12]。 對犬的研究表明,心臟淋巴轉運的大幅增加是心臟對心肌缺血或心臟停搏引起的急性心肌水腫的反應的代償機制[33]。 然而在炎癥期間,浸潤的中性粒細胞釋放中性粒細胞彈性蛋白酶,降解emilin-1 錨定絲,導致細胞間連接減弱和淋巴管崩潰,結果淋巴運輸不良水腫形成。 組織水腫可能通過ECM 釋放介質進一步誘導淋巴管生成,糖胺聚糖透明質酸被透明質酸酶降解為具有生物活性的促淋巴管生成片段,作用于LYVE-1,與VEGF-C 協同刺激LEC 增殖和遷移[34]。 此外,ECM-整合素信號也在調節淋巴重構中的發揮重要作用。 間質液壓力(IFP)增大時,ECM 中纖維連接蛋白通過β1 整合素直接與VEGFR3 結合向LECs 發出信號,放大VEGF-C 信號[35]。 然而功能性淋巴管生成是一復雜的過程,受局部微環境的影響,由于水腫通常伴有炎癥,會對LEC 連接和屏障功能產生不利影響[36]。

5 免疫細胞對淋巴管生成和心臟修復的影響

5.1 巨噬細胞對淋巴管生成和心臟修復的影響

巨噬細胞可以分為兩個亞類:M1 為經典激活的巨噬細胞[37],由脂多糖(LPS)和干擾素(IFN)-C誘導,產生高水平的促炎細胞因子介導組織損傷并損害傷口愈合。 M2 為交替激活的巨噬細胞,可進一步極化為M2a、M2b 和M2c 巨噬細胞[38]。 M2a和M2c 巨噬細胞分泌大量促纖維化轉化生長因子(TGF)-β,誘導組織纖維化。 M2b 巨噬細胞也稱為調控巨噬細胞,維持促炎和抗炎功能之間的平衡,研究表明M2b 巨噬細胞可以減輕心肌缺血再灌注損傷(myocardial Ischemia reperfusion injury,MI/RI)的影響[39]。

心肌梗死后,尤其是巨噬細胞的聚集及其對死亡細胞的吞噬清除,即胞葬作用,是心臟修復的必要的初始步驟。 以往研究表明,胞葬作用缺陷會加速心力衰竭[40]。 心肌梗死誘導促淋巴管生成因子VEGFC 的表達,觸發心臟淋巴管生成,緩解炎癥,從而改善心臟功能[16]。 巨噬細胞炎癥期間分泌VEGFC 并促進淋巴管生成[41]。

Tammela 等[23]報道實驗性心肌梗死后巨噬細胞胞葬作用缺陷導致心臟淋巴管生成和VEGFC 表達減少。 以及在培養的原代巨噬細胞中添加凋亡細胞后,發現胞葬作用誘導VEGFC 的細胞內證據。心肌梗死小鼠模型中觀察到,心臟巨噬細胞升高了VEGFC 表達水平,髓系VEGFC 缺乏的小鼠表現出急性梗死面積的增加、心室收縮能力受損、不良組織重塑和淋巴管生成減少[23]。 同時細胞實驗分析顯示髓系VEGFC 缺乏也以炎癥反應缺陷為特征,巨噬細胞產生的VEGFC 有直接抑制促炎巨噬細胞激活的作用。 因此,這些結果表明,心臟巨噬細胞通過胞葬作用產生VEGFC 除了促進心臟淋巴管生成和進行抗原清除,還能直接抑制巨噬細胞過度分泌促炎細胞因子改善心臟修復,促進心臟愈合。

Wang 等[42]在大鼠體內的研究表明,M2b 巨噬細胞促進淋巴管生成,減少心肌纖維化,改善心臟功能,減少心臟重構。 M2b 巨噬細胞移植后VEGFC和VEGFR3 表達上調。 體外實驗表明,M2b 巨噬細胞可刺激LECs 的增殖、遷移和管狀形成。 此外,與未分化(M0) 巨噬細胞相比,M2b 巨噬細胞中VEGFC 的表達上調。 且M2b 巨噬細胞上清培養的LECs 中VEGFR3 的表達也上調。 因此,M2b 巨噬細胞可以被運用到心肌保護療法中。

5.2 T 淋巴細胞對淋巴管生成和心臟修復的影響

Houssari 等[9]對心肌梗死后心臟招募T 細胞在淋巴重塑中的作用進行研究,發現使用VEGF-C/VEGF-D trap(可溶性VEGFR3)治療限制T 細胞招募到梗死區,導致左心室壁變薄減少延遲瘢痕重塑,并減少心肌梗死后的心功能障礙。 進一步研究證實心臟浸潤T 細胞(包括CD4+和CD8+亞群)在心肌梗死后對心臟淋巴系統產生有害影響,并在一定程度上通過IFN-γ 導致心肌梗死后急性期淋巴毛細血管和預收集器的稀疏。

6 治療性淋巴管生成

有研究通過抑制VEGF-C 和VEGFR3 對心肌缺血模型小鼠進行研究[43],結果發現,抑制內源性淋巴管生成增加了梗死瘢痕大小,增加了心室肥厚,增加了左心室擴張,并降低了左心室功能。 相反,有選擇性地刺激心臟淋巴管生成,改善預收集淋巴管和集合淋巴管的重構,使心臟淋巴管運輸能力加快,足以減輕大鼠心肌梗死后的心肌水腫、炎癥和纖維化,從而減少病理性重構,改善心功能,部分預防心衰發展。 另外LEC 分泌的細胞因子可以促進心肌細胞增殖存活,減少心肌細胞凋亡,為心肌梗死后心臟提供保護[44]。

Hartikainen 等[45]在對小鼠心梗模型的研究中發現,通過腺相關病毒載體實現持續的VEGFCC156 S 治療,才能有效增加心臟淋巴管生成,并減少心肌梗死后3 周心臟炎癥和功能障礙。 在一項隨訪1 年研究中,促進淋巴管生成和血管生成的基因治療增加了難治性心絞痛患者的心肌灌注儲備[46]。因此淋巴管生成療法可能是治療心血管疾病的一種有前途的方法。

7 小結

心血管疾病的心肌改變包括心肌細胞和非心肌細胞的細胞群以及ECM 的改變。 對于心肌梗死以及其他心臟疾病的治療要考慮多種細胞及ECM中的靶點。 淋巴管生成不足或功能障礙在MI 和非缺血性心臟病的心肌重塑和心功能障礙中起著病理生理作用。 心臟淋巴功能受損導致心肌水腫和免疫炎癥延遲消退,而慢性水腫和炎癥都可以誘導心肌間質纖維化。 為了改善心肌梗死后的心功能,減少心肌水腫、炎癥和纖維化,治療性淋巴管生成已經成為一種有前途的新方法。 其中與淋巴管密切相關的免疫巨噬細胞在急慢性炎癥、組織穩態和重塑等多種生理和病理過程中發揮重要作用。VEGFC-VEGFR3 是主要的淋巴管生成通路,巨噬細胞通過胞葬作用產生的VEGFC 可以促進心臟淋巴管生成,不僅能清除抗原,同時抑制促炎細胞因子的過度分泌,改善心臟修復(見圖1)。 但考慮到,VEGF-C 可以與內皮細胞上的VEGFR2 受體結合刺激血管生成,同時也刺激血管滲漏[12],VEGFR3 也在心肌細胞和肌成纖維細胞上表達,VEGF-C 治療可能直接影響心肌細胞和重塑期成纖維細胞的信號轉導。 因此未來的研究仍需充分了解不同類型細胞中的VEGF-C 和VEGFR3 信號如何影響MI 后淋巴管生成及心肌生理病理變化。

注:LEC:淋巴內皮細胞;VEGF-C:血管內皮生長因子C;VEGF-D:血管內皮生長因子D;VEGFR-3:血管內皮生長因子受體3;HA:透明質酸;LYVE-1:淋巴管內皮透明質酸受體;Podoplanin:膜黏蛋白;NFATC1:活化T-細胞核因子1;FOXC2:叉頭框C2;PROX-1:同源盒基因轉錄因子1;Erk:細胞外調節蛋白激酶。圖1 淋巴管生成的調節及其在心肌梗死中的作用Note.LEC, Lymphoendothelial cell.VEGF-C, Vascular endothelial growth factor C.VEGF-D, Vascular endothelial growth factor D.VEGFR-3, Vascular endothelial growth factor receptor 3.HA, Hyaluronic acid.LYVE-1, Lymphatic endothelial hyaluronic acid receptor.Podoplanin,Membrane mucin.NFATC1, Activated T-nuclear factor 1.FOXC2, Forkhead frame C2.PROX-1, Homeobox gene transcription factor 1.Erk,Extracellular regulated protein kinase.Figure 1 Regulation of lymphangiogenesis and its role in myocardial infarction