HFPO-DA染毒對孕鼠甲狀腺內分泌功能的影響

呂娣,譚桂玲,陳國威,劉文東,韓文超

(1 青島大學兒科學專業研究生,山東 青島 266071; 2 青島市市立醫院; 3 大連醫科大學研究生院)

全氟辛酸(PFOA)和全氟辛烷磺酸(PFOS)是最常見的兩種全氟烷基化合物(PFASs)[1-2]。鑒于PFOA和PFOS對環境和人類具有不良影響,其生產和使用在全球范圍內逐漸受到限制[3]。六氟環氧丙烷二聚體羧酸(HFPO-DA,商品名為GenX)作為PFOA的一種新型替代物而逐漸受到關注。自從2010年開始生產以來,HFPO-DA作為材料制造中新型的加工助劑在世界范圍內逐漸被廣泛使用。HFPO-DA已在全球范圍內的多種物質如地表水、土壤、室內灰塵、農作物、果蔬及海洋動物等中被檢測到[4-9],其在水中難以被有效清除且具有蓄積性,這對飲用水的安全是一個巨大的挑戰[10]。目前,HFPO-DA已在人類和動物血清中被檢測到[11-12]。毒理學研究顯示,HFPO-DA可能具有與PFOA相似的毒性作用[13],對動物生長發育、代謝、肝臟以及心臟等具有毒性作用[14-18]。然而,HFPO-DA對甲狀腺毒性的研究卻鮮有報道。本研究以SD大鼠為受試對象,研究不同劑量HFPO-DA孕期染毒對SD大鼠甲狀腺組織形態、分泌功能以及子代生長發育的影響,為探討HFPO-DA是否為內分泌干擾物提供基礎資料,為評估其對人體健康的風險提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 試劑和儀器

主要試劑:HFPO-DA(純度≥97%,上海麥克林生化科技有限公司); 40 g/L多聚甲醛溶液(Sigma-Aldrich,USA);促甲狀腺激素(TSH)、總四碘甲狀腺原氨酸(TT4)、總三碘甲狀腺原氨酸(TT3) 酶聯免疫吸附試劑盒(江蘇晶美生物有限公司);內標貯備液(Sigma-Aldrich,USA);內標13C4-PFOA (Sigma-Aldrich,USA);甲醇、乙腈(Merck Drugs &Biotechnology,Germany)。 主要儀器:低溫冷凍離心機(Thermo Scientific);-80 ℃超低溫冰箱(Thermo Scientific);超聲儀(KQ3200DE,昆山超聲儀器有限公司); 高效液相色譜-串聯質譜儀(Agilent Technologies Inc,USA);SQP 電子分析天平(Sartorius, Germany);數碼照相機(Cannon,EOS R6)。

1.2 實驗動物

選擇10周齡雄性和雌性SPF級別SD大鼠各32只,體質量250～270 g,由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。SD大鼠飼養在帶有滅菌墊料的聚丙烯籠中,室內溫度為(23±1)°C,光照明暗周期為12 h-12 h。本文實驗獲得青島市市立醫院倫理委員會的批準。

1.3 實驗方法

1.3.1實驗動物分組及處理 10周齡SD大鼠適應性飼養1周后,將雄雌大鼠按照1∶1合籠交配,次日清晨6:00檢查雌鼠陰道,有陰栓者或陰道涂片顯微鏡下可觀察到精子者定義為妊娠0.5 d(GD0.5)。將GD 0.5孕鼠隨機均分為對照組(去離子水)和HFPO-DA低劑量組(1 mg/kg)、中劑量組(10 mg/kg)、高劑量組(100 mg/kg),每組8只。用去離子水和HFPO-DA配制HFPO-DA溶液,在孕鼠妊娠0.5～19.5 d期間每日固定時間段(8:00-10:00)稱體質量,然后通過經口灌胃的方式給予孕鼠HFPO-DA水溶液進行染毒。實驗期間,大鼠自由攝食、飲水。

1.3.2標本的采集與處理 孕鼠妊娠19.5 d灌胃2 h后,給予100 g/L的水合氯醛麻醉,心臟采血后斷頭處死孕鼠,4 ℃下以2 500 r/min離心15 min,取上清液,-80 ℃儲存,用于HFPO-DA血清濃度分析;取孕鼠甲狀腺稱質量,40 g/L多聚甲醛溶液固定,用于甲狀腺組織的形態學觀察;剖腹取胎鼠稱體質量,數碼相機拍照,使用Image J軟件測量胎鼠身長和尾長。

1.3.3孕鼠血清HFPO-DA濃度檢測 使用高效液相色譜-串聯質譜法檢測孕鼠血清中HFPO-DA的濃度。按照參考文獻方法[19]進行操作。

1.3.4孕鼠血清TSH、TT3、TT4的濃度測定 將-80 ℃冷凍的血清樣品解凍,應用酶聯免疫吸附試劑盒測定血清中TSH、TT4、TT3濃度,按試劑盒說明書方法進行操作。

1.3.5孕鼠甲狀腺組織形態學觀察 取40 g/L多聚甲醛固定的甲狀腺組織,乙醇脫水后,石蠟包埋,5 μm厚切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光學顯微鏡下觀察甲狀腺組織的形態學變化。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 各組胎鼠生長發育情況比較

各組胎鼠出生時均存活且無發育畸形。與對照組比較,HFPO-DA中劑量和高劑量組胎鼠的出生體質量、身長降低(F=8.26、38.64,P<0.05),高劑量組尾長降低(F=8.61,P<0.05)。孕鼠產胎鼠量各組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組胎鼠生長發育比較

2.2 各組孕鼠血清HFPO-DA濃度比較

經過孕期19.5 d的染毒,孕鼠血清中HFPO-DA的濃度與染毒劑量呈正相關關系。孕鼠血清中HFPO-DA的濃度為非正態分布,低、中和高劑量組中HFPO-DA的中位濃度(M)分別為0.15、0.57和3.92 mg/L,下四分位數(P25)濃度分別為0.14、0.53和3.74 mg/L,上四分位數(P75)濃度分別為0.18、0.59和4.12 mg/L。見圖1。

圖1 各組孕鼠血清中HFPO-DA濃度

2.3 各組孕鼠血清TSH、TT3、TT4水平和TT3/TT4比值比較

經孕期19.5 d的染毒后,與對照組比較,中劑量和高劑量組TSH濃度均顯著升高,差異有統計學意義(t=11.17、12.17,P<0.05),高劑量組血清TT3濃度和TT3/TT4比值顯著升高(t=5.07、8.65,P<0.05);各組孕鼠血清TT4濃度差異無顯著性(P>0.05)。見圖2。

A:各組TSH水平比較;B:各組TT3水平比較;C:各組TT4水平比較;D:各組TT3/TT4比值比較。與對照組比較,*P<0.05。

2.4 各組孕鼠甲狀腺組織形態比較

HE染色觀察顯示,對照組孕鼠甲狀腺濾泡大小較為均一,濾泡腔內膠質充盈、均勻(圖3A);低劑量組和中劑量組孕鼠甲狀腺組織未發生明顯的形態學改變,呈現大致正常的甲狀腺結構(圖3B和3C);高劑量組孕鼠甲狀腺濾泡出現形態學變化,部分濾泡增生活躍,濾泡腔變小,膠質減少(圖3D)。

A:對照組;B:低劑量組;C:中劑量組;D:高劑量組,孕鼠部分甲狀腺濾泡腔變小,膠質減少(黑色箭頭所示)。HE染色,200倍。

3 討 論

HFPO-DA作為PFOA的替代物已在全世界范圍內被廣泛應用,但是其環境持久性和生物蓄積性以及生態毒性應引起重視。目前,HFPO-DA已在人類和動物血清中被檢測到,孕婦及胎兒作為易感人群,HFPO-DA對其毒性作用受到了高度關注。本研究結果顯示,孕期中劑量和高劑量HFPO-DA染毒可使胎鼠出生體質量和出生身長顯著下降,而高劑量染毒可導致胎鼠尾長縮短。BLAKE等[14]研究顯示,CD-1小鼠整個孕期(0.5～17.5 d)暴露于10 mg/kg的HFPO-DA,可導致胎兒出生體質量下降。CONLEY等[18]關于SD大鼠孕期(14～18 d)HFPO-DA染毒研究顯示,暴露劑量≥30 mg/kg時胎鼠出生體質量下降,孕鼠血清中HFPO-DA的濃度≥10 mg/L胎鼠出生時的死亡率會增加。本研究結果與其一致。本研究結果顯示,高劑量組孕鼠血清中HFPO-DA濃度中位數僅為3.92 mg/L,同時也未發現胎鼠死亡率的增加。既往有研究結果顯示,宮內暴露PFASs不僅嚴重影響新生胎鼠的存活率,而且會導致存活幼鼠生長發育遲緩并伴有高甲狀腺素血癥[20]。

甲狀腺素(THs)對生長發育、生殖繁育及能量代謝等生理過程具有重要的調節與控制作用。甲狀腺受下丘腦-垂體-甲狀腺軸的調節,通過下丘腦合成促甲狀腺激素釋放激素,刺激垂體產生TSH,從而促進甲狀腺合成T4和T3。動物研究表明,PFOA染毒導致血清T3和(或)T4降低[21],并且T4降低的程度更加明顯[22]。挪威的兩項人群研究結果顯示,血清中PFOS每增加1 ng,孕婦TSH水平將增加0.8%[23-24]。有兩項研究探討了HFPO-DA染毒對THs水平的影響,其結論完全相反。其中CONLEY等[18]研究顯示,大鼠孕期HFPO-DA染毒劑量≥30 mg/kg,會顯著降低其血清中TT3的水平;而染毒劑量≥125 mg/kg時,TT4水平降低。然而,BLAKE等[14]對CD-1小鼠研究卻發現,孕期小鼠HFPO-DA染毒增加了胎盤中TT4水平。本研究結果表明,高劑量組孕鼠血清TT3和TSH水平均顯著增加,血清TT3、TT4和TSH之間未發現負反饋調節。導致不同研究結果不同的原因尚不清楚。既往關于PFASs甲狀腺毒性的機制研究也尚未得出一致的結論,認為PFASs通過以下機制發揮作用:①與TSH受體直接相互作用,對TSH依賴的信號通路產生不同的影響[25];②影響T4從肝臟攝取和排出的關鍵肝臟轉運蛋白的活性[26];③影響甲狀腺中將T4轉化為T3的碘甲腺原氨酸脫碘酶Ⅰ的濃度[27]等途徑導致T3、T4、TSH的調節紊亂。

甲狀腺組織的基本結構和功能單元是甲狀腺濾泡,濾泡的結構改變可作為甲狀腺功能的指標。本文研究結果顯示,高劑量組孕鼠的甲狀腺組織結構發生明顯的變化,其部分濾泡腔變小,腔內膠質減少,這說明甲狀腺功能相對活躍,與TT3水平增加相吻合。提示HFPO-DA對甲狀腺組織產生了損傷作用。目前有兩項細胞水平研究認為,HFPO-DA能夠導致甲狀腺細胞活性和增殖能力的降低,但其機制不一致。COPERCHINI等[28]研究結果顯示,HFPO-DA能夠促進甲狀腺細胞DNA損傷,并影響甲狀腺轉錄因子基因的表達;而另有研究則認為HFPO-DA作用主要是導致THs合成相關的基因異常表達。目前尚無體內研究探討HFPO-DA的甲狀腺毒性作用的可能機制。

綜上,高劑量(100 mg/kg)HFPO-DA染毒可以損傷孕鼠甲狀腺組織及影響機體內甲狀腺激素的水平,進而導致子代胎鼠宮內生長發育落后。有關HFPO-DA對甲狀腺內分泌功能干擾效應的機制還需進一步深入研究。