枯草芽胞桿菌重組表達的Pantoea dispersa UQ68J蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的研究

趙文沖,吳敬,張康*,陳晟*

1(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

異麥芽酮糖(isomaltulose),俗稱帕拉金糖,分子式為C12H22O11,由葡萄糖分子和果糖分子以α-1,6鍵連接而成,是蔗糖(α-1,2鍵)的同分異構體[1]。異麥芽酮糖有著與蔗糖相似的外觀和口感,甜度只有蔗糖的一半[2]。異麥芽酮糖不被大多數微生物分解利用,因此它能夠防治齲齒;異麥芽酮糖被食用后,不會在口腔和胃中被分解消化,而是在小腸內被蔗糖酶和異麥芽糖酶緩慢水解為單糖,然后被吸收利用,因而它具有提神抗疲勞、不致腹瀉、不刺激血糖迅速升高、加速脂肪代謝等優點[3]。美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)將異麥芽酮糖列為公認安全食品(generally recognized as safe,GRAS),在歐洲日本等地區異麥芽酮糖也已被用作蔗糖代替品而廣泛使用[4]。作為一種新型的功能糖,異麥芽酮糖在食品領域有著廣闊的應用前景。

異麥芽酮糖天然存在于蜂蜜、甘蔗等食物中,但含量較低,提取困難,不能滿足異麥芽酮糖龐大的市場需求量。因此,如何高效制備異麥芽酮糖成為了研究的熱點內容。目前異麥芽酮糖的制備方法有化學合成法、植物轉基因法、微生物轉化法、酶轉化法?；瘜W合成法制備異麥芽酮糖反應困難且成本較高,植物轉基因法制備異麥芽酮糖會嚴重影響植物自身生長發育[5],微生物轉化法制備異麥芽酮糖受到微生物細胞活力以及底物濃度的限制,酶轉化法一般沒有上述問題,因而是制備異麥芽酮糖的主要方法。蔗糖異構酶(sucrose isomerase,SIase,SI,EC.5.4.99.11)是酶法制備異麥芽酮糖所使用的酶,主要來源于微生物,它可以將蔗糖異構為異麥芽酮糖,同時水解生成一定量的單糖[6]。吳琦等[7]將Klebsiellasp.LX3蔗糖異構酶在解脂耶氏酵母中進行表面展示,其轉化蔗糖時異麥芽酮糖產率為77%;LI等[8]將ErwiniarhaponticiNX-5來源的蔗糖異構酶在大腸桿菌中表達后制備異麥芽酮糖,其產率可達87%;程勝等[9]將SerratiaplymuthicaAS9蔗糖異構酶在大腸桿菌中重組表達后制備異麥芽酮糖,異麥芽酮糖產率最高可達87.9%;WU等[10]將PantoeadispersaUQ68J來源的蔗糖異構酶在大腸桿菌中表達后制備異麥芽酮糖,產率可達91%。

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)是一種革蘭氏陽性菌,遺傳背景清晰,不含內毒素,無致病性,FDA將其列為公認安全微生物?？莶菅挎邨U菌有著優秀的胞外分泌蛋白能力,它可以將目的蛋白釋放到胞外上清液中,便于產物的分離純化,降低生產成本[11]?？莶菅挎邨U菌是工業酶制劑生產的常用宿主,多種外源蛋白如α-淀粉酶[12]、脂肪酶[13]、普魯蘭酶[14]、β-葡萄糖苷酶[15]等都已成功地在枯草芽孢桿菌中實現了重組表達。異麥芽酮糖作為一種食品甜味劑,有必要在食品安全級微生物中表達,因此本研究將P.dispersaUQ68J蔗糖異構酶在枯草芽孢桿菌中重組表達,對重組蔗糖異構酶進行純化并測定了酶學性質,最后用重組酶制備異麥芽酮糖并對酶法制備異麥芽酮糖的轉化條件進行了優化。本研究為工業生產異麥芽酮糖提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與質粒

穿梭質粒pHY300PLK,大連寶生物工程有限公司;克隆宿主BacillussubtilisSCK6[16]、表達宿主BacillussubtilisWS9[17]、帶有PantoeadispersaUQ68J蔗糖異構酶基因sim的重組質粒pET-24a (+)-sim為本實驗室保存;重組質粒pHY300PLK-sim和重組菌株WS9/pHY300PLK-sim為本研究構建。

1.1.2 主要試劑

DP209普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DP103質粒小提試劑盒,北京天根生化科技有限公司;2×Phanta Max Master Mix,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;SDS-PAGE凝膠配制試劑盒,上海碧云天生物技術有限公司;DNA Maker、標準分子質量蛋白Maker,大連寶生物工程有限公司;異麥芽酮糖、海藻酮糖標準品,Sigma公司;其他常見試劑,上海國藥集團有限公司。

1.1.3 主要培養基

LB液體培養基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10。

LB固體培養基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,瓊脂粉15～20。

TB培養基(g/L):蛋白胨12,酵母粉24,甘油5,K2HPO4·3H2O 16.43,KH2PO42.31。

以上培養基均在121 ℃,滅菌20 min后使用。

1.1.4 儀器與設備

PCR儀、Mini Protein 3蛋白膠電泳儀,美國Bio-Rad公司;DYY-6C型核酸電泳儀,北京六一電泳儀廠;臺式離心機,德國Eppendorf公司;Waters高效液相色譜,美國沃特世科技有限公司;空氣搖床、水浴搖床、恒溫培養箱,上海知楚儀器有限公司;Agilent Polaris 3 NH2柱,美國安捷倫公司;紫外可見分光光度計,上海美譜達儀器有限公司;分析天平、pH計,瑞士梅特勒托利多有限公司;恒溫水浴鍋,上海森信儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌WS9/pHY300PLK-sim的構建

以重組質粒pET-24a (+)-sim和穿梭載體pHY300PLK為模板,設計引物,將蔗糖異構酶基因sim連接到穿梭質粒pHY300PLK上,引物序列如表1所示。

表1 引物序列

重組質粒pHY300PLK-sim的構建方法為:以SI-F、SI-R為上下游引物,在重組質粒pET-24a (+)-sim上擴增出蔗糖異構酶基因sim;以ZAI-F、ZAI-R為上下游引物將穿梭載體pHY300PLK線性化;將擴增出的sim基因和線性化的載體片段膠回收后,用POE-PCR法[18]進行連接,連接產物轉化克隆宿主B.subtilisSCK6,涂布于含有四環素(20 μg/L)抗性的固體平板上,在37 ℃培養箱中培養10 h,挑取重組子到LB培養基培養10～12 h后保菌提質粒,將重組質粒進行酶切和測序驗證,驗證正確的重組質粒即為pHY300PLK-sim。

將重組質粒pHY300PLK-sim電轉B.subtilisWS9感受態,涂布于含有四環素(20 μg/L)抗性的平板上,37 ℃恒溫培養箱培養10～12 h后,挑取轉化子進行酶切驗證,驗證正確的轉化子即為重組菌WS9/pHY300PLK-sim,同時將驗證正確的重組菌保存在-80 ℃冰箱中。

1.2.2 重組菌的搖瓶發酵以及重組蔗糖異構酶的制備

從超低溫冰箱中取出重組菌甘油管,解凍后將重組菌以0.2%(體積分數)的接種量接種到LB液體培養基中,同時在LB培養基加入0.1%(體積分數)的四環素,在37 ℃、200 r/min搖床中培養10～12 h;將培養好的LB種子液以5%(體積分數)的接種量接種到TB培養基中,同時加入0.1%(體積分數)的四環素,在37 ℃、200 r/min搖床培養2 h后,換到33 ℃、200 r/min搖床中培養48 h。培養完成的發酵菌液8 000 r/min離心20 min,離心后的發酵上清液即為蔗糖異構酶酶液。

1.2.3 蔗糖異構酶酶活力的測定方法

本研究采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid,DNS)法[19]測定蔗糖異構酶的酶活力:用50 mmol/L、pH 6.0的檸檬酸-Na2HPO4緩沖液配制200 g/L的蔗糖溶液,吸取1.8 mL到15 mL的具塞試管中,在30 ℃水浴鍋中溫浴10～15 min。將酶液用緩沖液稀釋一定的倍數,吸取200 μL,加入到蔗糖底物中準確反應15 min;反應結束后立刻加入3 mL的DNS溶液,沸水煮沸10 min,放在冰水上待其溫度降至常溫后,加入10 mL去離子水,并在540 nm波長下測定反應液的吸光度。

將DNS溶液加入不同濃度的異麥芽酮糖標準品中,煮沸顯色,在540 nm波長下測定吸光值并制作標準曲線,用標準曲線將吸光值換算為異麥芽酮糖濃度。

酶活力定義:在30 ℃、pH 6.0條件下,1 min內生成1 μmol異麥芽酮糖所需要的酶量定義為1個酶活力單位(1 U)。

1.2.4 重組蔗糖異構酶的純化

首先在蔗糖異構酶C末端加6個連續的組氨酸(His標簽),然后用鎳離子親和層析柱對重組蔗糖異構酶進行純化。

A液(mol/L):NaCl 0.5,Tris-HCl 0.025,調節pH值至7.4。

B液(mol/L):NaCl 0.5,Tris-HCl 0.025,咪唑0.3,調節pH值至7.4。

首先用100 mL的A液平衡鎳柱,然后將粗酶液緩慢流過鎳柱,之后用0%、5%、10%、20%、30%、50%、100%體積分數的B液(50～100 mL)依次流過鎳柱,收集流出液,將流出液進行SDS-PAGE分析,確定重組酶的最適洗脫濃度。使用30 kDa的超濾管對最適濃度洗脫液進行超濾,濃縮至洗脫液剩余800 μL左右時,繼續加入10～15 mL的50 mmol/L、pH 6.0的檸檬酸- Na2HPO4緩沖液置換洗脫液中的咪唑,用緩沖液反復超濾3～4次,最后得到的酶液即為純化后的蔗糖異構酶。

1.2.5 重組蔗糖異構酶的酶學性質測定

最適pH:配制50 mmol/L,pH值分別為4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的檸檬酸- Na2HPO4緩沖液,用不同pH的緩沖液配制200 g/L的蔗糖溶液,并用不同pH的緩沖液將蔗糖異構酶稀釋一定倍數后測定酶活力。

pH穩定性:用50 mmol/L,pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的檸檬酸- Na2HPO4緩沖液將蔗糖異構酶稀釋合適的倍數后置于25 ℃水浴鍋中,放置24 h后測定其剩余酶活力。

最適溫度:以pH 6.0、200 g/L的蔗糖溶液為底物,將底物分別放在20、25、30、35、40、45 ℃的水浴鍋中溫浴10 min,然后將酶液加入不同溫度的底物溶液中測定酶活力。

溫度穩定性:將重組蔗糖異構酶置于45 ℃的水浴鍋中,定時取樣,并測定酶活力,研究蔗糖異構酶的溫度穩定性并確定半衰期。半衰期為酶活力降為最高酶活力一半時所用時間。

以上酶學性質均設定最高酶活力為100%,其余酶活力與最高酶活力的比值即為相對酶活力。

1.2.6 重組蔗糖異構酶制備異麥芽酮糖的反應條件優化

加酶量優化:將重組蔗糖異構酶分別以5～30 U/g(每5 U/g設置一個梯度)的加酶量加入到pH 6.0、200 g/L的蔗糖溶液中,在30 ℃、150 r/min的水浴搖床中反應10 h,HPLC法檢測各糖含量并計算異麥芽酮糖產率。

溫度優化:配制pH 6.0、200 g/L的蔗糖底物,加酶量為20 U/g,將反應體系在25～45 ℃(每5 ℃設置一個梯度)、150 r/min反應10 h,HPLC法檢測各糖含量并計算異麥芽酮糖產率。

底物蔗糖濃度優化:以pH 6.0的檸檬酸- Na2HPO4溶液配制終質量濃度分別100～700 g/L(每100 g/L設置一個梯度)的蔗糖溶液,加酶量為20 U/g,將反應體系在30 ℃、150 r/min條件下反應10 h,HPLC法檢測各糖含量并計算異麥芽酮糖產率。

1.2.7 異麥芽酮糖含量的檢測

將酶轉化結束的樣品高溫煮沸20 min,12 000 r/min離心3 min,取離心后的上清液稀釋一定倍數,之后用0.22 μm的水相濾頭過濾,最后用Waters高效液相色譜儀檢測樣品中各組分含量。

采用示差折光檢測器(refractive index detector,RID),色譜柱為Agilent公司、Polaris 3 NH2(150 mm×4.6 mm),流動相為80%(體積分數)的乙腈,柱溫40 ℃,流速0.8 mL/min,進樣量10 μL。

異麥芽酮糖產率的計算如公式(1)所示:

(1)

2 結果與分析

2.1 蔗糖異構酶在B.subtilis中的表達與純化

按1.2.1節所示方法,獲得重組菌B.subtilisWS9/pHY300PLK-sim,將重組菌搖瓶發酵48 h,測得發酵上清液中蔗糖異構酶的酶活力為9.51 U/mL,然后按1.2.4節所示方法,將重組蔗糖異構酶純化,將純化后的蔗糖異構酶、重組菌發酵上清液和對照菌發酵上清液進行SDS-PAGE分析。蔗糖異構酶理論分子質量為65.7 kDa[10],如圖1所示,泳道1和2都在理論分子質量附近有清晰的蛋白條帶,對照菌在理論分子質量附近沒有相應的條帶,表明蔗糖異構酶成功在B.subtilis中重組表達,且重組蔗糖異構酶達到電泳純級別。

M-蛋白質低分子質量標準Marker;泳道1、2、3分別為純化后的蔗糖異構酶、重組菌發酵上清液、對照菌發酵上清液

2.2 重組蔗糖異構酶的酶學性質

2.2.1 重組蔗糖異構酶的最適pH

pH是影響酶活力的重要因素之一。一方面pH通過影響酶活性中心相關基團的解離狀態影響酶的催化活性;另一方面pH會影響底物的解離狀態,繼而影響酶與底物的結合與催化能力。將蔗糖異構酶放在pH值為4.0～8.0的條件下測定酶活力,如圖2所示,當pH 4.0時酶活力只有10.50%,隨著pH的增加酶活力逐漸提高,pH 6.0時,蔗糖異構酶的酶活力達到最高,pH>6.0之后,酶活力開始下降,pH值在5.5～7.0,蔗糖異構酶能保留80%以上的酶活力;pH偏酸或偏堿酶活性損失較大。

圖2 重組蔗糖異構酶的最適pH值

2.2.2 重組蔗糖異構酶的pH穩定性

pH穩定性用酶分子在某一pH條件下放置一段時間后的剩余酶活力來衡量。將重組蔗糖異構酶用不同pH的緩沖液稀釋一定倍數,在25 ℃水浴鍋中靜置24 h后,測其剩余酶活力。如圖3所示,重組蔗糖異構酶在pH 4.0的緩沖液中放置24 h后酶活力只剩16.36%,在pH 6.0的緩沖液放置24 h酶活力基本不變,說明該蔗糖異構酶在pH 6.0的條件下穩定性最好;在pH 5.0～8.0的環境中放置24 h后酶活性皆能保留80%以上,說明該酶在較寬pH范圍內穩定性良好。

圖3 重組蔗糖異構酶的pH穩定性

2.2.3 重組蔗糖異構酶的最適溫度

溫度對酶活力有著顯著的影響。一方面溫度升高,底物中活化分子數量增加,加快酶反應速率;另一方面,溫度升高伴隨著酶逐漸變性,2種因素共同影響了酶的反應速率。將重組蔗糖異構酶在20～45 ℃下測定酶活力,結果如圖4所示。隨著溫度的升高,酶活力逐漸提高,30 ℃時,酶活力達到最高,隨著溫度的繼續升高,蛋白變性對酶活力的影響超過了反應速率對酶活力的影響,酶活力開始下降。因此重組蔗糖異構酶的最適溫度為30 ℃。

圖4 重組蔗糖異構酶的最適溫度

2.2.4 重組蔗糖異構酶的溫度穩定性

將重組蔗糖異構酶置于45 ℃的水浴鍋中靜置處理,每隔20 min取1次樣并測定酶活力。如圖5所示,隨著處理時間的增加,重組酶的酶活力逐漸下降,在60 min時,重組酶的酶活力保留率為60.53%,在80 min時酶活力僅剩37.56%,重組酶在45 ℃下的半衰期為68 min。

圖5 重組蔗糖異構酶的溫度穩定性

2.3 酶轉化制備異麥芽酮糖的轉化條件優化

2.3.1 加酶量對異麥芽酮糖產率的影響

將重組蔗糖異構酶按不同加酶量(5～30 U/g)加入pH 6.0、200 g/L的蔗糖底物中,在30 ℃下轉化10 h。結果如圖6所示,隨著加酶量的增加,異麥芽酮糖產率逐漸升高,加酶量為20 U/g時,異麥芽酮糖產率達到最高83.17%,隨著加酶量的進一步提高,異麥芽酮糖產率反而下降,推測原因與蔗糖異構酶的催化特性有關:蔗糖異構酶除了將蔗糖異構為異麥芽酮糖,同時還將蔗糖水解為葡萄糖和果糖,當加酶量超過20 U/g時,生成異麥芽酮糖的異構反應基本到達平衡狀態,而蔗糖異構酶的水解反應會繼續消耗蔗糖導致用于異構為異麥芽酮糖的蔗糖量減少,所以異麥芽酮糖產率下降。因此制備異麥芽酮糖的最適加酶量為20 U/g。

圖6 加酶量對異麥芽酮糖產率的影響

2.3.2 反應溫度對異麥芽酮糖產率的影響

反應溫度對異麥芽酮糖產率的影響體現在2個方面:一是溫度會顯著影響酶的催化活力和穩定性;二是溫度影響著蔗糖異構酶異構反應和水解反應的平衡性,溫度較低時蔗糖異構酶的水解反應較弱,但有利于海藻酮糖生成,溫度較高時,海藻酮糖的生成受到抑制,但蔗糖異構酶的水解能力會增強[10,20]。因此,合適的溫度有利于異麥芽酮糖的生產。以pH 6.0、200 g/L的蔗糖溶液為底物,加酶量為20 U/g,將反應體系分別在20～45 ℃條件下反應10 h,結果如圖7所示。隨著溫度的升高,異麥芽酮糖產率逐漸升高,到30 ℃時,異麥芽酮糖產率最高為83.17%,雖然在20 ℃和25 ℃下異麥芽酮糖產率與30 ℃時產率相近,但低溫更有利于海藻酮糖的產生,而35 ℃下異麥芽酮糖產率下降到80.32%,綜上制備異麥芽酮糖的最適溫度為30 ℃。

圖7 反應溫度對異麥芽酮糖產率的影響

2.3.3 底物濃度對異麥芽酮糖產率的影響

以pH 6.0、100～700 g/L(梯度為100 g/L)的蔗糖溶液為底物,加酶量為20 U/g,在30 ℃下轉化10 h,結果如圖8所示。隨著蔗糖濃度的升高,異麥芽酮糖產率逐漸升高,當蔗糖質量濃度為400 g/L時,產率最高可到90.61%,當繼續采用更高質量濃度的蔗糖(500、600、700 g/L)進行酶轉化時,異麥芽酮糖產率基本持平且可以維持在89.20%左右。因此,雖然底物質量濃度為400 g/L時異麥芽酮糖產率最高,但采用700 g/L的蔗糖進行酶轉化能獲得異麥芽酮糖產量更高,且此時幾乎沒有蔗糖殘留,能更好地降低生產成本,因此更適合工業化制備異麥芽酮糖的蔗糖質量濃度為700 g/L。

圖8 底物濃度對異麥芽酮糖產率的影響

3 結論與討論

本研究將P.dispersaUQ68J蔗糖異構酶在B.subtilis中重組表達,對重組蔗糖異構酶進行純化并研究其酶學性質,結果表明,該重組酶在30 ℃、pH 6.0的條件下酶活力最高,在pH 5.0～8.0的條件下穩定性良好。用該重組酶制備異麥芽酮糖,以pH 6.0、400 g/L的蔗糖為底物,加酶量為20 U/g,在30 ℃下轉化10 h時,異麥芽酮糖產率最高可達90.61%,采用更高質量濃度的蔗糖(700 g/L)轉化時異麥芽酮糖產率仍可達89.20%,實現了酶法制備異麥芽酮糖高產率。

LI等[8]將E.rhaponticiNX-5蔗糖異構酶在大腸桿菌中重組表達后制備異麥芽酮糖,蔗糖質量濃度為550 g/L時,異麥芽酮糖產率為87%;程勝等[9]將S.plymuthicaAS9蔗糖異構酶在大腸桿菌中重組表達后制備異麥芽酮糖,蔗糖質量濃度400 g/L時異麥芽酮糖產率達到最大(87.9%),而蔗糖質量濃度提高到500 g/L時異麥芽酮糖產率下降到83.2%;耿夢華等[21]將短小芽胞桿菌表達的重組蔗糖異構酶固定化后制備異麥芽酮糖,在600 g/L蔗糖質量濃度下異麥芽酮糖產率可達87.8%;相較于其他微生物來源的蔗糖異構酶,本研究得到的重組蔗糖異構酶安全性好,在高底物濃度下高異麥芽酮糖產率更高,工業應用潛力巨大。綜上所述,本研究提供了一種優秀的重組蔗糖異構酶和簡單高效的酶轉化工藝,為異麥芽酮糖的工業化生產奠定了堅實的基礎。