谷氨酸棒桿菌人工核糖體結合位點(RBS)文庫的建立與應用

張悅,張繼偉,吳碩,徐寧,劉君,魏亮*

1(天津科技大學 生物工程學院,天津,300457)2(中國科學院天津工業生物技術研究所,天津,300308)3(天津科技大學 食品科學與工程學院,天津,300457)

合成生物學是在工程學的指導下,通過生物元器件的標準化設計和構建,對生物體進行有目標的重設計和改造,以解決醫藥、環境、材料和能源等國計民生的重大問題[1-2]。在生物體重設計過程中,基因的精細表達調控是影響合成生物體構建的關鍵因素。因此,開發設計有效的生物控制元件是合成生物學研究的重要內容。核糖體結合位點(ribosome binding site, RBS)是指起始密碼子ATG上游的一段富含嘌呤的非翻譯區[3],又叫SD(Shine-Dalgarno)序列,是控制翻譯起始和蛋白質表達的關鍵區域。隨著合成生物學的發展,利用RBS工程對目標基因的表達進行精細調控,優化目標產物合成途徑通量,構建具有高效生產能力的細胞工廠,已經逐漸成為合成生物學研究的熱點。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是一種從土壤中分離的形態為短桿棒狀,無芽孢的兼性好氧型的革蘭氏陽性細菌,是公認的安全食品級菌株[4]。隨著對谷氨酸棒桿菌研究的不斷深入,谷氨酸棒狀桿菌已經發展成為重要的工業底盤菌,廣泛用于L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸等氨基酸[5],以及有機酸[6]、高級醇[7]和多聚物[8]的工業化生產中,其中L-谷氨酸和L-賴氨酸年產超過200萬t[9]。近年來,谷氨酸棒桿菌也被開發用于蝦青素等天然產物[10]合成過程中。在構建細胞工廠的過程中,往往需要對代謝途徑進行精細和定量調控,以提高目的產物的合成效率,因此關于谷氨酸棒桿菌基因表達調控工具的研究也越來越受到關注。在前期研究中,本實驗室通過設計人工隨機序列,構建了合成啟動子文庫,并應用于L-蘇氨酸合成途徑的表達調控[11]。然而目前,關于谷氨酸棒桿菌RBS元件文庫的報道仍然較少。WEI等[12]利用RBS元件文庫優化策略,在谷氨酸棒桿菌中重建和優化了甘油利用途徑,顯著提升了工程菌株的甘油利用能力。WANG等[13]利用基于CRISPR/Cas系統的堿基編輯技術,在谷氨酸棒桿菌中建立了RBS原位調控方法,并先后對木糖代謝途徑和番茄紅素合成途徑的基因表達進行調控,大幅提升了木糖的攝取速率和番茄紅素產量。ZHANG等[14]以谷氨酸棒桿菌通用的SD序列構建了RBS文庫,優化了莽草酸合成途徑aroGBDE基因的表達水平,提升了莽草酸的產量。然而該研究采用低通量平板篩選方法,構建的RBS文庫調控范圍較窄,調節豐度較低,不利于谷氨酸棒桿菌基因的精細表達調控。因此,本研究設計構建了人工RBS文庫,通過偶聯流式細胞分選(fluorescence-activated cell sorting,FACS)技術對RBS文庫進行高通量篩選,獲得了一個調控范圍寬,覆蓋范圍均勻的人工RBS文庫。利用人工RBS文庫對L-高絲氨酸合成途徑的基因進行精細調控,提高了L-高絲氨酸的合成能力,為谷氨酸棒桿菌中基因的表達調控提供了重要研究工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α用于質粒構建,由中國科學院天津工業生物技術研究所保藏。C.glutamicumATCC 13032菌株由中國科學院天津工業生物技術研究所保藏。谷氨酸棒桿菌穿梭質粒pEC-XK99E用于RBS評價和篩選,由本實驗室保藏。本研究所用菌株與質粒見表1。

表1 本研究所用質粒與菌株

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L):酵母粉5.0,胰蛋白胨10.0,NaCl 10.0[固體培養基加2%(質量分數,下同)的瓊脂粉];硫酸卡那霉素(kanamycin)終質量濃度為100 μg/mL。主要用于大腸桿菌的培養。

LBHIS培養基(g/L):酵母粉2.5,胰蛋白胨5.0,NaCl 5.0,腦心浸液1.85,山梨醇9.1(固體培養基加2%的瓊脂粉);Kanamycin終質量濃度為50 μg/mL。主要用于谷氨酸棒桿菌的培養。

種子培養基(g/L):玉米漿30,尿素5,(NH4)2SO45,KH2PO41,MgSO40.5,葡萄糖25,蘇氨酸0.4。

發酵培養基(g/L):玉米漿60,FeSO4-檸檬酸鹽溶液0.55 mL/L(FeSO4·7H2O 20 g/L,檸檬酸18.14 g/L),(NH4)2SO440,KH2PO40.25,MgSO40.5,H3PO4(85%) 0.225 mL/L,維生素溶液7 mL/L(生物素300 mg/L,維生素B1500 mg/L,泛酸鈣鹽2 g/L,煙酰胺600 mg/L),乙酸鉀0.5,葡萄糖70,蘇氨酸0.4,CaCO320。

1.1.3 試劑

Phusion DNA聚合酶、限制性內切酶DpnI、限制性內切酶FastDigestEco31 I、T4 DNA連接酶、蛋白Marker,Thermo Fisher公司;0.1% BSA,NEB公司;質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒,天根生物公司;卡那霉素,索萊寶生物科技有限公司;其他試劑如3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、可溶性淀粉、NaOH、苯酚、Na2SO3、葡萄糖、冰醋酸、鹽酸等均為國產分析純。

1.1.4 儀器與設備

Synergy NEO2多功能酶標儀,美國Biotek公司;搖床,美國精騏公司;Scientz-IID超聲破碎儀,寧波新芝公司;高速冷凍離心機,德國Eppendoff公司;MoFlo XDP貝克曼分選型流式細胞儀,美國Beckman公司;Agilent 1260高效液相色譜儀,美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 谷氨酸棒桿菌人工RBS文庫的構建

本研究根據文獻報道的谷氨酸棒桿菌通用的SD序列AAAGGA,設計了AAAGGA(N)7-8的RBS隨機序列,使SD序列距離起始密碼子7或8 bp。設計隨機引物,該引物包含BsaI限制性內切酶識別位點、RBS隨機序列以及報告基因gfp(green fluorescent protein, GFP)上游引物序列。引物序列具體為CCAGGTCTCAGAGCAAAGGANNNNNNN(N)ATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAG。采用Phusion DNA聚合酶,以gfp基因為模板,通過PCR方法獲得含有人工RBS序列的gfp基因片段,利用Golden Gate DNA組裝方法,將gfp基因片段整合連接至質粒pEC-XK99E上,轉化到E.coliDH5α感受態中,涂布于含100 μg/mL kanamycin的LB平板上,37 ℃靜置培養12 h。收集平板上的所有菌落,提取質粒,構建谷氨酸棒桿菌人工RBS序列文庫。

1.2.2 RBS文庫的高通量篩選

將構建的RBS文庫質粒電轉到C.glutamicumATCC 13032感受態細胞中,涂布到含50 μg/mL kanamycin LBHIS的平板上,在30 ℃下培養24 h。用PBS(pH 7.5)沖洗平板上的細胞,取2 mL的菌液,按照1%(體積分數,下同)的接種量轉接到LBHIS液體培養基中,30 ℃振蕩培養12 h。隨后收取2 mL菌液,用PBS洗滌菌體,重復2次,將菌液濃度稀釋至OD600=0.1。將制備的樣品振蕩混勻5 min,使用MoFlo XDP流式細胞儀對樣品細胞進行篩選,激發波長488 nm,發射波長530 nm,檢測GFP熒光變化強度。為保證細胞陽性率,本研究采用純化模式對RBS文庫細胞進行流式細胞分選。將FACS技術分選出的細胞置于LBHIS的平板上,30 ℃搖床培養24 h。挑取平板上的細胞到含有600 μL LBHIS培養基的96深孔板中,采用多功能酶標儀檢測GFP熒光強度變化,激發波長488 nm,發射波長520 nm。相對熒光強度(relative fluorescence unit, RFU)的計算如公式(1)所示:

(1)

隨后將分離的含有不同強度的GFP熒光的菌株,置于含有5 mL LBHIS培養基的試管中,進一步評價細胞的熒光強度。

1.2.3 人工RBS文庫調控強度表征

1.2.3.1 質粒構建

本研究利用α-淀粉酶(1,4-α-D-glucan-glucanohydrolase, α-amyE)進一步測試人工RBS文庫的調控強度。從人工RBS文庫中挑選不同強度的RBS元件,嵌入到α-淀粉酶基因amyE上游引物上,采用Phusion DNA聚合酶,以枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)基因組為模板,通過PCR方法獲得包含不同RBS元件的amyE基因片段。利用Golden Gate方法,將含有不同RBS序列的amyE基因片段連接至載體pEC-XK99E上。將構建的載體轉入C.glutamicumATCC 13032感受態細胞中,構建含有不同強度的RBS序列的α-淀粉酶菌株。

1.2.3.2 α-淀粉酶的酶活測定

本研究采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-dinitro-2-hydroxybenzoic acid, DNS)比色法測定還原糖含量來反映α-淀粉酶的酶活力[15]。挑取上述構建的含有不同強度的RBS序列的α-淀粉酶菌株,接種到含有50 μg/mL kanamycin的5 mL的LBHIS液體培養基中,過夜活化培養。按照1%的接種量轉接到LBHIS液體培養基中,30 ℃、200 r/min振蕩培養24 h。收集菌液,加入裂解緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4,200 mmol/L NaCl,pH 7.5)重懸,調節OD600至10,冰水浴超聲破碎處理20 min,隨后在4 ℃、6 000 r/min離心10 min,收集上清液。

反應混合液包括:50 μL粗酶液,450 μL 20 mmol/L醋酸鈉Buffer B(0.02 mol/L NaAC固體,0.2 mL/L冰醋酸,pH 5.5),500 μL 10 g/L可溶性淀粉(溶于醋酸鈉Buffer B,現配現用)。將裝有反應混合液的試管放置在60 ℃的水浴鍋,準確反應5 min后,加入3滴0.5 mol/L HCl,中斷反應,然后加入1.0 mL DNS試劑(0.87 mol/L酒石酸鉀鈉,0.03 mol/L DNS,0.52 mol/L NaOH,0.06 mol/L苯酚,0.04 mol/L Na2SO3),在90 ℃水浴鍋中反應5 min,冰浴后冷卻至室溫,測定540 nm處的吸光值。α-淀粉酶的酶活單位定義為:在60 ℃條件下,1 min釋放1 μmol葡萄糖所需要的酶量。

1.2.4 利用人工RBS文庫精細調控L-高絲氨酸生物合成途徑

本研究基于人工RBS文庫對L-高絲氨酸生物合成途徑的關鍵模塊進行精細調控。天冬氨酸激酶(aspartate kinase, LysC)和高絲氨酸脫氫酶(homoserine dehydrogenase, Hom)是L-高絲氨酸生物合成途徑的2個關鍵酶。為移除關鍵酶LysC和Hom的反饋抑制,本研究分別引入點突變LysCT311I和HomG378E,并從人工RBS文庫中挑選3個不同強度的RBS元件,分別調控LysCr和Homr的表達。將RBS元件序列分別嵌合到lysC和hom基因上游引物上,以C.glutamicum基因組為模板,通過PCR方法獲得含有不同RBS元件序列的lysC和hom基因DNA片段。通過用Golden Gate方法,將lysC和hom基因片段兩兩組合,連接到載體pEC-XK99E上,將上述構建的質粒轉化至菌株CgH1中,構建L-高絲氨酸合成菌株。

1.2.5L-高絲氨酸的發酵

挑取上述構建的高絲氨酸合成菌株,于LBHIS液體培養基中,30 ℃過夜活化培養。按照1%的接種量,接種到種子培養基中,30 ℃、200 r/min培養12 h。隨后以初始OD600=10,接種到含有20 mL發酵培養基的250 mL搖瓶中,30 ℃、200 r/min進行發酵培養,每24 h取樣,使用分光光度計測定菌株的生長情況OD600,使用HPLC測定發酵液中L-高絲氨酸的含量[16]。

2 結果與分析

2.1 谷氨酸棒桿菌人工RBS文庫的設計與構建

研究表明,谷氨酸棒桿菌16S rRNA 3′末端的anti-Shine-Dalgarno序列為AAAGGAGG,被認為是通用RBS的保守序列。在谷氨酸棒桿菌中,RBS元件和起始密碼子之間的距離大概是5～10 bp[17]。而ZHANG等[14]通過對RBS序列隨機篩選,發現有效RBS元件的保守序列AAAGG與起始密碼子之間的距離大多數為7～8 bp?；谏鲜鼋Y果,本研究設計了谷氨酸棒桿菌人工RBS隨機序列為AAAGGA(N)7-8,其中AAAGGA為RBS元件的保守序列,為保證篩選效率,AAAGGA與起始密碼子的距離設定為7～8 bp,如圖1-a所示。將設計的人工RBS序列嵌合到報告基因gfp上游引物上,設計隨機引物。以gfp基因為模板,通過使用設計的隨機引物進行PCR擴增,獲得含有隨機RBS元件的gfp序列,采用Golden Gate的方法,將gfp片段插入到載體pEC-XK99E上,構建質粒文庫(圖1-b)。將質粒文庫電轉至C.glutamicumATCC 13032感受態細胞中,建立谷氨酸棒桿菌人工RBS文庫。通過隨機引物設計,人工RBS文庫的理論庫容量為6.6×104。因此,本研究共挑選了大約105個克隆,保證RBS文庫的100%覆蓋。

a-人工RBS文庫設計策略;b-人工RBS文庫的構建;c-高通量篩選方法的建立

2.2 人工RBS文庫的高通量篩選

本研究利用兩步篩選法對人工RBS文庫進行高通量篩選(圖1-c)。流式細胞技術是比較先進的單細胞定量分析和分選技術,能夠根據細胞形態和熒光信號,快速準確地完成細胞性狀分析和分選工作,大大加快了菌株篩選進程。因此,本研究為加快篩選效率,首先利用流式細胞技術對人工RBS文庫進行評價和分選。以谷氨酸棒桿菌常用的RBS元件AAAGGAGGTTGTC(CK1)和AAAGGAGGACAACC(CK2)為陽性對照,分別選擇RBS文庫中細胞熒光強度前1%和前0.04%的細胞(圖2-a)。經過多輪篩選,共篩選獲得10 000個克隆,置于LBHIS瓊脂平板上30 ℃培養48 h。為了驗證高通量篩選效率,從平板上挑選3個具有不同熒光強度的菌株,利用流式細胞儀對菌株熒光強度進行評價。結果如圖2-b所示,篩選的菌株熒光強度均顯著高于對照組CK1,說明基于流式細胞技術的高通量篩選方法具有較好的篩選效率。隨后本研究利用96孔板篩選法對RBS文庫進行再次篩選和評價。挑取篩選的平板菌落,置于含有LBHIS培養基的96孔板中,30 ℃培養18 h,采用多功能酶標儀對培養細胞的熒光強度進行分析。結果表明,通過兩步篩選方法構建的人工RBS文庫,調控范圍廣,調控強度分布均勻,熒光強度從3×103～105a.u.,具有較好的調節強度多樣性(圖2-c)。

a-利用流式細胞技術高通量篩選人工RBS文庫(R1為流式細胞分選框);b-流式細胞分析驗證高通量篩選結果的可靠性;c-利用96孔篩選技術對人工RBS文庫進行復篩

2.3 人工RBS文庫的評估與表征

為評估人工RBS元件的穩定性,本研究根據熒光強度,從構建的人工RBS文庫中挑選了37個RBS元件進行放大驗證。所選37個RBS序列見表2。將選擇的含有不同RBS元件的菌株,接種于含有5 mLLBHIS培養基的試管中,30 ℃、200 r/min培養18 h。隨后采用多功能酶標儀測定培養細胞的熒光強度。結果如圖3-a所示,選擇的RBS元件在放大培養條件下,其熒光強度變化趨勢與96孔板的測定結果基本一致,說明構建的人工RBS元件文庫具有較高的穩定性。選擇的RBS元件調控范圍廣,最高熒光強度為105 508 a.u.,是對照的8.55倍,最低熒光強度為3 633 a.u.,是對照的0.29倍,調控幅度為29.04倍。根據熒光強度不同,將RBS文庫分為3類,高強度RBS(熒光強度>80 000),中強度RBS(熒光強度為80 000～40 000),低強度RBS(熒光強度<40 000)。

a-人工RBS文庫穩定性測試;b-α-淀粉酶表達系統的建立;c-利用α-淀粉酶表達系統評估人工RBS文庫的通用性

表2 37個RBS序列及相對強度

為進一步驗證人工RBS文庫的通用性,本研究利用α-淀粉酶表達系統對RBS元件文庫進行評估(圖3-b)。分別從3個不同強度的RBS文庫中各挑選2個序列,連接至α-淀粉酶上游,調控α-淀粉酶的表達。將上述構建的不同RBS序列和α-淀粉酶的質粒轉入谷氨酸棒桿菌中,于LBHIS培養基中,30 ℃、200 r/min振蕩培養24 h,測定α-淀粉酶的酶活性。結果如圖3-c所示,含有高強度RBS元件菌株表現出較高的α-淀粉酶活性,含有低強度RBS元件菌株表現出較低的α-淀粉酶活性,與GFP熒光強度具有較高的一致性。其中含有高強度RBS元件37-amyE菌株的α-淀粉酶活性為3.00 U/mg,是對照的4.43倍,含有低強度RBS元件4-amyE菌株的α-淀粉酶活性為0.70 U/mg,是對照的1.04倍。上述結果表明,本研究構建的人工RBS元件文庫具有較寬的調控范圍,較好的穩定性和通用性,為谷氨酸棒桿菌代謝改造和基因表達調控提供了多樣性的系列調控元件。

2.4 利用人工RBS文庫調控L-高絲氨酸的生物合成途徑

L-高絲氨酸是一種重要的非蛋白質氨基酸[17],在食品、飼料、化工和醫藥領域具有廣泛的應用。L-高絲氨酸是合成蘇氨酸等天冬氨酸家族氨基酸的重要前體物質,具有重要的生理功能,也是一種重要的化工原料,用于L-草銨膦[18]和γ-丁內酯[19]的生產。近年來,隨著L-高絲氨酸需求量的逐漸增大,利用環境友好的微生物發酵法生產L-高絲氨酸受到廣泛關注。在構建微生物細胞工廠的過程中,對代謝途徑通量的平衡調控是影響目標產物合成的關鍵因素。研究表明,天冬氨酸激酶(aspartate kinase, LysC)和高絲氨酸脫氫酶(homoserine dehydrogenase, Hom)是谷氨酸棒桿菌中L-高絲氨酸生物合成途徑的2個關鍵酶。因此,本研究利用人工RBS文庫精細調控L-高絲氨酸生物合成途徑中關鍵酶LysCr和Homr的表達,平衡代謝途徑通量,提高L-高絲氨酸合成能力。

本研究從構建的人工RBS元件文庫選擇了3個具有不同強度的RBS序列,即高強度RBS-37、中強度RBS-20、低強度RBS-4。將3個具有不同強度的RBS元件分別置于基因lysC和hom的上游,構建含有不同強度RBS的基因表達元件。將獲得的lysC和hom基因表達元件通過Golden Gate方法,連接至pEC-XK99E上。通過排列組合方法,構建了9個含有lysC和hom基因的表達質粒。將構建的表達質粒電轉化至谷氨酸棒桿菌CgH1菌株中,構建系列L-高絲氨酸合成菌株(圖4-b)。

a-L-高絲氨酸生物合成途徑;b-利用人工RBS文庫精細調控關鍵酶LysC和Hom表達示意圖

按照1.2.6節所述方法,以CgH1包含空質粒為對照,對構建的L-高絲氨酸合成菌株進行搖瓶發酵,測定LysCr和Homr組合表達對L-高絲氨酸產量的影響。如圖5所示,與對照菌株相比,1號菌株生長略低于對照菌株,而其他菌株生長與對照基本相當。相比之下,各菌株的L-高絲氨酸合成能力存在明顯差異,其中4號菌株表現出最高的L-高絲氨酸合成能力,L-高絲氨酸產量到達12.7 g/L,比野生型菌株高絲氨酸含量(3.5 g/L)提高了3.6倍。而低表達LysCr和Homr的菌株,其高絲氨酸含量最低,僅為5.7 g/L。結果表明,精細調控關鍵酶LysCr和Homr的表達,能有效平衡代謝途徑通量,提升L-高絲氨酸的合成能力。而本研究構建的人工RBS文庫為谷氨酸棒桿菌中基因的表達調控提供了有力工具。

a-L-高絲氨酸合成菌株的生長情況;b-L-高絲氨酸產量

3 結論

本研究基于谷氨酸棒桿菌RBS序列的基本特征,設計構建了一個隨機RBS文庫。以GFP為報告基因,偶聯FACS技術和96孔板篩選技術,對隨機RBS文庫進行高通量篩選,成功構建了調控范圍廣,覆蓋范圍均勻的人工RBS元件文庫,調控范圍達到29.04倍。通過α-淀粉酶活力測試和表征,驗證了人工RBS文庫具有較高的穩定性和通用性。隨后本研究將人工RBS文庫應用于L-高絲氨酸代謝途徑的調控優化。利用具有不同強度的RBS元件對L-高絲氨酸合成途徑關鍵酶LysCr和Homr進行精細表達調控,獲得了具有高效L-高絲氨酸合成能力的最佳組合,平衡了代謝途徑通量,提高了L-高絲氨酸產量。與之前的研究相比,本研究建立的RBS文庫調節寬度大,調控強度范圍廣,具有較好的普適性,能夠“即插即用”,可直接對代謝途徑中各個基因進行精細表達調控,為谷氨酸棒桿菌代謝改造和基因精細表達調控提供了有力工具。在下一步研究中,我們將利用不同強度的啟動子庫與RBS元件文庫進行組合,建立具有不同強度的精細調控工具,并應用于其他生物合成代謝途徑的精細調控研究。