基于正交偏最小二乘法判別分析寧夏和河北產區市售馬瑟蘭葡萄酒理化特征和抗氧化能力

李彩虹,王悅,呂毅,邱鑫宇,吳博略,馬婷婷,房玉林,孫翔宇*

1(寧夏農產品質量標準與檢測技術研究所,寧夏 銀川,750002)2(西北農林科技大學 葡萄酒學院,陜西 楊凌,712100)3(寧夏回族自治區食品檢測研究院(國家市場監管重點實驗室(枸杞及葡萄酒質量安全),寧夏 銀川,750002)4(西北農林科技大學 食品學科與工程學院,陜西 楊凌,712100)

馬瑟蘭(VitisviniferaL.cv.Marselan)是一種原產于法國的紅色釀酒葡萄品種,是法國國家農業研究院以赤霞珠和歌海娜為親本雜交育成的品種,具有優良的抗病蟲害特性[1-2]。馬瑟蘭葡萄酒具有豐富的酚類物質[3],且通常伴有果香、陳釀香等優雅的香氣[4]。自2001年引入河北省種植之后,馬瑟蘭便表現出了較好的適應性和釀造潛力。目前中國已是馬瑟蘭種植面積位列第二的國家[5],并且隨著對高品質葡萄酒需求的不斷提升,中國將有越來越多的地區開始種植馬瑟蘭。

地理位置在一定程度上決定了各種影響葡萄生長和葡萄酒發酵的生態因子和生物因素,進而極大地影響了葡萄和葡萄酒的品質[6]。大多數葡萄酒生產國依賴地理分級系統來對葡萄酒進行劃分[7]。已有研究證實,中國主要馬瑟蘭葡萄酒產區微生物群落之間具有顯著差異[8],而微生物群落是葡萄酒風土的重要影響因素[9]。因此,不同產區馬瑟蘭葡萄酒在質量風格等方面可能具有不同的特征和差異。同時,大量研究表明,市售葡萄酒普遍被用于比較產區之間質量風格,是能夠體現各產區風土特征、較好地排除不同釀酒師釀造工藝影響的有效工具[3,10-15]。得益于獨特的氣候和地理條件,以賀蘭山東麓而聞名的寧夏產區正逐漸成為世界葡萄酒產區的新星[16-17]。河北產區作為馬瑟蘭首次引入中國開始種植的地區,同樣是我國重要的葡萄酒產區[18]。此前有研究基于揮發性香氣化合物分析對中國部分產區的馬瑟蘭葡萄酒成功進行了地理區分[3]。然而,作為我國2個重要的馬瑟蘭葡萄酒產區,河北和寧夏產區馬瑟蘭葡萄酒理化特征的比較分析卻十分有限。

鑒于我國馬瑟蘭葡萄引種時間較短,目前對于中國馬瑟蘭葡萄酒的成分特征研究尚不充分,本研究選擇寧夏和河北地區共27款市售干紅葡萄酒作為代表進行研究,解析其理化性質、有機酸、花色苷和其他酚類物質特征及抗氧化能力,揭示馬瑟蘭在不同產區間的質量表現;同時,利用正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)進行關聯分析,嘗試建立2個產區馬瑟蘭干紅葡萄酒的地理判別方法,以期進一步促進馬瑟蘭葡萄酒在中國區域特色化品質發展。本研究通過系統研究馬瑟蘭在中國不同產區質量風格的具體表現,將為進一步揭示馬瑟蘭與不同產區風土條件之間的聯系提供理論依據,進而助力凝練中國馬瑟蘭質量風格。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

27款市售馬瑟蘭干紅葡萄酒樣品分別來自寧夏回族自治區和河北省,酒樣基本信息見表1。

表1 馬瑟蘭市售酒樣基本信息

甲醇、乙酸、乙腈、乙酸乙酯、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox),均為色譜級,德國Meker公司;有機酸標準品(草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸)、花色苷標準品(二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷)、31種單體酚標準品(兒茶酸等),美國Sigma-Aldrich公司;所有分析純化學品,成都西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設備

Enology Y15葡萄酒全自動分析儀,西班牙Biosystems公司;2699高效液相色譜儀,美國Waters公司;LC-20A液相色譜儀、LC-15C高效液相色譜儀,日本島津公司;UV-2800A紫外可見分光光度計,上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

葡萄酒樣品經0.45 μm濾器過濾,部分指標測定前進行適當稀釋。

1.3.2 基礎理化

基礎理化(包括還原糖、果糖、葡萄糖、總酸度、總硫、游硫、氨氮)以及總酚和總花色苷由Enology Y15葡萄酒全自動分析儀測定。葡萄酒樣品經0.45 μm濾器過濾后,按照儀器說明進行分析。

1.3.3 單體有機酸

參考高海燕等[19]的方法,使用Waters 2699高效液相色譜儀進行檢測,配備有C18色譜柱(4.6 mm×250 mm;5 μm,CAPCELL PAK C18;Shiseido, Japan)。流動相A:0.02 mol/L K2HPO4(pH=2.3);流動相B:甲醇。流動相A∶B=99∶1(體積比)的洗脫程序等梯度洗脫,流速0.5 mL/min。以保留時間確定各有機酸成分,采用外標法計算樣品中各有機酸的濃度。

1.3.4 單體花色苷

參照YANG等[20]的方法,樣品測定前經0.22 μm濾膜過濾,使用島津LC-20A液相色譜儀進行檢測,配備有Synergi Hydro-RPC18色譜柱(250 mm×4.6 mm,4 μm)。流動相A[V(甲酸)∶V(乙晴)∶V(水)=2.5∶10∶80],流動相B[V(甲酸)∶V(乙腈)∶V(水)=2.5∶50∶40]。梯度洗脫程序:0～45 min:0%～35% B;45～46 min:35%～100% B;46～50 min:100% B;50～51 min:100% B;51～55 min:0% B。流速1 mL/min;柱溫35 ℃;檢測波長520 nm。根據花色苷的保留時間、最大吸收波長和實驗花色苷質譜數據庫對花色苷進行定性分析;以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為標準品,采用外標法進行定量分析,所有花色苷濃度以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷當量表示?；ㄉ諛藴是€濃度范圍為0.27～400×10-3g/L。

1.3.5 單體酚

參照葛謙等[21]的方法,采用LC-15C高效液相色譜儀進行檢測,配備有Waters×Terra MS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)。樣品前處理:取30 mL葡萄酒樣液,加入60 mL乙酸乙酯,萃取3次后,35 ℃減壓旋蒸至干,甲醇定容至10 mL,0.45 μm微孔濾膜過濾,-20 ℃保存待測。流動相A:2%(體積分數)的乙酸水溶液;流動相B:含0.5%乙酸的乙腈-水溶液;V(流動相A)∶V(流動相B)=50∶50。梯度洗脫程序:0～50 min:10%～55%A;0～60 min:55%～100%A;60～65 min:100%～10%A;65～75 min:10%A。柱溫30 ℃;流速0.8 mL/min。檢測波長280 nm(黃烷-3-醇類以及二氫查耳酮類),320 nm(羥基肉桂酸類),360 nm(黃酮醇)。定性方法采用目標化合物與標準品保留時間比對的方法,定量方法為峰面積外標定量法。

1.3.6 抗氧化能力

DPPH自由基清除測定法和鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant capacity, FRAP)測定法參照MA等[22]。銅離子還原能力(cupric reducing antioxidant capacity, CUPRAC)方法參照CHENG等[23]。結果均以mmol Trolox 當量/L表示。

1.3.7 數據處理

使用SPSS 26.0進行獨立樣本t檢驗,統計評估顯著性水平為P=0.05。酒樣基礎理化指標箱線圖的繪制采用GraphPad Prism(Version 9.3.1)進行。OPLS-DA使用SIMCA 14.1版進行。在進行多變量統計分析之前,所有的化學變量都被歸一化。

2 結果與分析

2.1 基礎理化

葡萄酒的理化指標與諸多因素相關,土壤、氣候、栽培方式和釀造策略均會對其產生影響[24]。此外,有研究表明,存在同一地區的不同釀酒廠之間差異較大的情況[8]。因此,為了更好地研究產區特點,并盡可能忽略酒廠間的差異,地區內酒樣在指標檢測時進行了平均處理。寧夏和河北2個地區共27款市售馬瑟蘭干紅葡萄酒的基礎理化指標檢測結果如圖1所示。

圖1 兩地區酒樣基本理化指標

所檢測的基礎理化指標中,僅總酸在兩地區間無顯著差異(P>0.05)?？偹嵩谄咸丫频母泄俑惺苤衅鹬e足輕重的作用,并直接影響到葡萄酒的整體感官特征。通常來說,過高的酸度會帶來尖銳的感官,而酸度過低的葡萄酒會讓人感到松弛和平淡,呈現出寡淡的風味[25]。寧夏(2.06 g/L)與河北(2.04 g/L)市售酒樣總酸無顯著差異,這可能導致兩地區酒樣感官酒體結構難以區分。酒樣還原糖含量在很大程度上取決于釀酒策略[26]。寧夏地區酒樣總還原糖含量以及葡萄糖、果糖含量均顯著高于河北地區,寧夏酒樣還原糖含量為河北的2.20倍。寧夏地區馬瑟蘭葡萄可能由于其更為充足的光熱資源而具有較好的成熟度和較高糖度,導致該地區酒莊釀酒策略與河北地區不同,進而體現在兩地區葡萄酒樣品還原糖含量差異。河北地區酒樣中葡萄糖和果糖含量比例約為1∶1,寧夏地區約為0.7∶1。SO2是最常見的葡萄酒添加劑,常用于抑菌和抗氧化。葡萄酒中SO2的含量易隨著時間變化而改變?？偭蚝勘扔瘟蚋臃€定[26]。河北地區酒樣總硫(0.081 g/L)顯著高于寧夏(0.048 g/L),盡管其游硫含量顯著低于寧夏地區約24.27%(P<0.05)。

a-OPLS-DA得分圖;b-OPLS-DA載荷圖;c-VIP得分圖

2.2 有機酸

有機酸與葡萄酒的總酸度密切相關,并且不同的有機酸具有不同的感官特點[27-29]。除莽草酸和乳酸外,兩地區其他6種有機酸含量均存在顯著差異。寧夏地區酒樣草酸、奎寧酸、檸檬酸和琥珀酸含量均顯著高于河北地區,與之相對應的是河北地區的酒石酸和蘋果酸均顯著高于寧夏地區(P<0.05)。蘋果酸和酒石酸是天然葡萄或有機物產物,它們的含量可能會受到葡萄原料和釀酒過程的影響。河北地區隸屬華北大區,寧夏位處西北干旱半干旱地區,不同的氣候和風土特點可能對葡萄原料和葡萄酒發酵過程產生影響,進而導致各類有機酸的含量差異。河北地區檸檬酸含量比寧夏地區低0.31 g/L。蘋果酸-乳酸發酵是葡萄酒中乳酸含量增加的重要原因,這一過程中乳酸菌也會利用檸檬酸[30]。有研究發現,混菌發酵和酒泥陳釀也可提高葡萄酒中乳酸和酒石酸的含量[31]。因此釀酒工藝對于葡萄酒的理化特征具有重要影響。由樣品聚類熱圖可得(圖3-b),27款馬瑟蘭干紅葡萄酒之間莽草酸、酒石酸和奎寧酸3種單體有機酸含量差異較大。其中盡管來自寧夏的17號樣品在草酸、蘋果酸和奎寧酸含量為所有樣品中最低,但其莽草酸含量為地區最高。由圖3-b得出馬瑟蘭葡萄酒樣品按照地區聚類的趨勢較弱。由圖3-c可知,同一地區的樣品趨近于聚集,但寧夏地區樣品相對河北較為分散。兩地區在第一成分方向有按照地區區分的趨勢,河北地區樣品傾向于分布在第一成分的負方向而寧夏地區樣品則更傾向于分布在正向。檸檬酸、蘋果酸和草酸為貢獻較大的兩類物質(VIP值>1)?？偹崤c有機酸的關系密切[27-29],2.1節中分析得出的兩地區間總酸含量無顯著差異,但樣品有機酸含量組成上具有不同的特征。

a-兩地區單體有機酸柱圖;b-酒樣單體有機酸熱圖;c-OPLS-DA得分圖;d-OPLS-DA載荷圖;e-OPLS-DA VIP得分圖

2.3 花色苷

花色苷是葡萄酒中一類與酒的顏色、口感等特性相關的重要成分,尤其是對年輕葡萄酒而言更是影響其顏色的主要因素[32]。不同品種花色苷含量不同,也與所釀造的葡萄酒中花色苷的變化規律相關。對兩地區酒樣總花色苷含量檢測結果顯示,寧夏地區總花色苷含量顯著高于河北地區(圖4-a)。葡萄是酒中花色苷的唯一來源,諸如浸漬、陳釀時間和容器的選擇等釀酒學參數的不同也會影響葡萄酒中的花色苷含量[33-35]。因此,葡萄酒中花色苷的種類和含量與葡萄品種、氣候、農藝實踐和釀酒學處理密切相關[36-37]。研究發現氣候對葡萄成分的影響最大,其次是土壤和栽培品種[38]。位于西北干旱半干旱地區的寧夏產區具有充足的光熱資源,導致花色苷在葡萄中的大量積累,這可能是寧夏產區酒樣總花色苷含量顯著高于河北地區的原因。

a-兩地區總花色苷含量;b-OPLS-DA VIP得分圖;c-OPLS-DA載荷圖;d-OPLS-DA得分圖;e-兩地區單體花色苷含量;f-酒樣單體花色苷熱圖

2.4 單體酚

由圖5-a可得,河北地區酒樣總酚含量顯著高于寧夏地區。酚類物質在果實中的積累受氣候影響很大,并且葡萄樹的水分是決定酚類含量的決定性參數[38]。因此,位于西北干旱半干旱地區的寧夏均具有較高的總酚含量(2.0 g/L)。然而,位于中國華北的河北產區總酚含量(2.1 g/L)卻顯著高于寧夏。酒樣中的酚類物質含量雖然與葡萄果實的酚類物質積累極為相關(即與自然條件不可分割),但同時酒莊、年份和地區同樣不可忽視[7]。由表2可得,兩地

a-兩地區總酚含量;b-OPLS-DA VIP得分圖;c-OPLS-DA得分圖;d-OPLS-DA載荷圖;e-樣品單體酚含量熱圖

2.5 抗氧化功能及相關性分析

由圖6-a可知,河北和寧夏地區馬瑟蘭酒樣抗氧化能力上具有顯著差異,且河北地區顯著高于寧夏地區。經過相關性分析可得,這一結果可能由于河北地區樣品總酚含量顯著高于寧夏地區所致(圖6-b)。比較樣品之間的抗氧化能力可得,DPPH自由基清除能力和FRAP指標中河北地區的13號樣品最高,其次是1號樣品(圖6-c)。而CUPRAC結果顯示,河北地區12號樣品抗氧化能力最高,其次是1號樣品。河北地區的1號樣品在3種抗氧化指標評分均位列前茅?？傮w來看,樣品3種抗氧化指標趨勢基本一致,河北地區酒樣抗氧化能力較高。經過抗氧化能力與單體有機酸、單體花色苷及其他酚類物質相關性分析可得,具顯著性的相關性系數幾乎均為正值,即呈正相關關系。僅有對香豆酸與FRAP指標呈顯著負相關關系(圖6-b)。除此之外,3種指標評價下的抗氧化能力均與總酚、表兒茶素沒食子酸酯和龍膽酸含量呈顯著正相關。有2種抗氧化指標與表沒食子兒茶素沒食子酸酯、異槲皮苷、兒茶素、表兒茶素、蘆丁和反式-單阿魏酰酒石酸酯含量呈顯著正相關。所有顯著相關性的成分均為單體酚類,這一結果可能說明了酚類物質(包括單體酚類)對馬瑟蘭葡萄酒的抗氧化能力有重要貢獻。由相關性熱圖聚類結果可得,除二甲花翠素-3-O-(6-O-乙酰)葡萄糖苷外,單體花色苷聚為一大類。單體有機酸中,檸檬酸和琥珀酸聚為一大類,除此之外其他單體有機酸聚為一類。

3 結論

本研究基于河北和寧夏產區市售馬瑟蘭干紅葡萄酒樣品的基礎理化指標、有機酸、花色苷和單體酚含量分別建立了OPLS-DA模型,以期實現馬瑟蘭酒樣的地理區分。其中基于單體酚含量的OPLS-DA模型可以將兩地區清晰區分,有11種單體酚對該模型的建立起關鍵作用(VIP值>1)。這一結果與之前對馬瑟蘭酒樣基于酚類物質進行區分的結果有所差別[3],可能由于樣品數量有限及所研究的單體酚種類差異所致。盡管結果有所不同,本研究結果充分說明了基于單體酚含量模型有對馬瑟蘭酒樣進行地理位置區分的潛力。兩地區的總酸含量無顯著差別。除總酸外,其他6種基礎理化指標在兩地區間均顯示出了顯著差異。根據基礎指標可得寧夏地區樣品之間差異較大。兩地區間除莽草酸和乳酸含量無顯著差異外,其余單體有機酸均具有統計學差異。琥珀酸是兩地區含量差異最大的單體有機酸。兩地區之間比較可得,河北地區馬瑟蘭酒樣以較高的花青素3-O-葡萄糖苷(1.14 mg/L)為特點。寧夏地區二甲花翠素3-O葡萄糖苷則顯著高于河北地區。通常認為干旱半干旱地區葡萄中酚類物質的積累會更加顯著[38],但本研究結果顯示位于西北干旱半干旱地區的寧夏地區馬瑟蘭干紅葡萄酒總酚含量(2.0 g/L)顯著低于河北地區(2.1 g/L)。因此,本研究的結果證實了酒樣中的酚類物質含量盡管與果實酚類積累極為相關,但同時酒莊等其他非自然因素的影響也不可忽略[7]?？傮w而言,通過對來自河北和寧夏兩地區的27款馬瑟蘭干紅葡萄酒進行的理化分析,揭示了馬瑟蘭在不同產區間的不同質量表現特點。同時,結合OPLS-DA方法進行關聯分析,按照地區成功進行馬瑟蘭酒樣區分,表明了馬瑟蘭葡萄酒的地理溯源和區域特色化品質發展的可能性。鑒于馬瑟蘭在中國目前仍處于發展階段,受限于采集馬瑟蘭酒樣數目和檢測條件的有限,對于酒樣化學成分的規律發掘仍有待深入。本研究可為建立不同產區馬瑟蘭葡萄酒的地理溯源判別,促進馬瑟蘭葡萄酒在中國不同區域特色化品質發展提供數據支撐。