廣西酸筍特征風味化合物的研究

田玉峰,孫明浩,許家敏,黃月芳,麻志澤,馬玉春,陳燦堅,劉小玲,李樹波*

1(廣西安全工程職業技術學院 安全工程系,廣西 南寧,530100)2(廣西大學 輕工與食品工程學院,廣西 南寧,530004)

酸筍是以新鮮竹筍(大頭筍、麻竹筍等)為原料,浸泡于山泉水、清水或低濃度鹽水中,經自然發酵得到的一種傳統筍用竹食材[1]。由于其良好的貯藏特性、獨特的風味、較高的營養價值和藥用價值等[2],深受消費者的喜愛。同時,酸筍作為廣西眾多特色食品的主要食材與配料,其質量和風味將決定螺螄粉和老友粉等廣西特色食品的品質和特色,進而成為廣西特色民族食品健康及工業化發展的關鍵因素。然而,目前酸筍生產仍延續著小作坊式的傳統生產模式,發酵時間長,風味差異性較大,產品質量不穩定。此外,酸筍特征風味成分結構相關研究報道較少。鄭文迪等[3]基于GC-MS對廣西地區酸筍和酸菜風味差異的具體揮發性成分進行了檢測,在酸筍中共檢出86種揮發性成分,并通過相對含量確定了40種主要揮發性成分。郭榮燦等[4]對酸筍氣味物質提取方法進行了優化比較,發現頂空固相微萃取(headspace-solid phase micro extraction,HS-SPME)是萃取酸筍風味物質的最佳方法。但其酸筍中關鍵香氣成分尚未解析透徹。目前,風味活性值(odor activity value,OAV)已作為篩選食品中關鍵風味物質的常用方法。但不同風味物質之間的協同或掩蔽作用會導致OAV不能準確鑒定食品中關鍵風味[5]。為此,氣質聯用-嗅覺分析(gas chromatography-olfactometry-mass spectrometer,GC-O-MS)[6]結合了儀器分析與感官,與OAV聯用分析是較理想的風味分析方法。已成功用于酸魚[7]、泡菜[8]、醋[9]、白酒[10]等傳統發酵食品關鍵香氣成分的篩選。例如,ZANG等[11]通過GC-O-MS結合OAV的方法鑒定出酸魚的21種關鍵風味物質。LIU等[12]利用GC-O-MS結合OAV鑒定出北京烤鴨的18種關鍵揮發性風味物質,再根據風味重組和缺失實驗驗證了9種特征揮發性風味物質。針對廣西酸筍關鍵風味成分研究不足、工業化發展受限等問題,開展酸筍特征風味解析與提升等相關研究是廣西特色食品產業健康發展的共性需求及研究重點。

為此,本研究以柳州5個地區酸筍為研究對象,在比較分析不同地區樣品理化性質的基礎上,結合HS-SPME、OAV、感官定量描述和GC-O-MS等對酸筍的特征揮發性風味化合物進行解析,為推動酸筍發展提供理論依據和方法借鑒。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

用于酸筍理化和風味物質分析的5份樣品分別采集于廣西柳州市菜園農貿市場、菜園屯菜市場、石山腳公司、之味螺公司和柳城縣農戶,分別編號為LZ1～LZ5。正構烷烴混樣標準品(優級純,純度>99%),Sigma公司;2,4,6-三甲基吡啶、NaCl(色譜純,純度>98%),國藥化學試劑有限公司。

7890A-5975C氣相色譜-質譜聯用儀,美國Agilent公司;FJ300-SH數顯高速分散均質機,上海標準模型廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 揮發性成分的GC-MS分析

參考郭榮燦等[4]的方法,并在此基礎上進行優化。將酸筍與蒸餾水按1∶1(g∶mL)混合,利用均質機勻漿,準確稱取6 g勻漿液放入20 mL頂空瓶中,加入1.2 g NaCl,在50 ℃下密封攪拌30 min,插入老化后的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭。50 ℃水浴中吸附30 min后插入GC-MS進樣口,在250 ℃下解析3 min。分析色譜柱為Agilent 122-5532UIHP-INNOWAX(60 m×250 μm×0.25 μm)毛細管色譜柱。進樣口溫度250 ℃;載氣為高純氦氣;流速1 mL/min。升溫程序:初始柱溫40 ℃,保持4 min,然后以6 ℃/min 升至140 ℃,保持5 min, 3 ℃/min 升至150 ℃用于1 min,5 ℃/min到197 ℃用于2 min,然后1 ℃/min 到205 ℃用于0 min,再以7 ℃/min升至240 ℃,保持15 min。MS條件:電離方式EI,電子能量70 eV,燈絲發射電流0.25 mA,檢測器溫度230 ℃,離子源溫度230 ℃,四極桿溫度150 ℃,質量掃描范圍40～400 u,掃描方式:全掃描;調諧文件為標準調諧。

1.2.2 定性、定量分析及OAV的計算

利用MS和線性保留指數對香氣化合物進行定性,其中,NIST數據庫檢索過程中扣除譜圖背景后檢索選取匹配度大于80%的化合物。保留指數(retention index,RI)定性:在相同色譜條件下,以將正構烷烴為標準測定組分RI,與文獻報道的RI進行對比定性。RI計算如公式(1)所示:

(1)

式中:TR,保留時間;x,待測組分;n和n+1, 分別為待測組分出峰前后相鄰的2個正構烷烴的碳原子數。

采用內標法進行半定量,參考ZANG等[11]的方法,以2,4,6-三甲基吡啶(0.5 mL,100 mg/L)為內標物,通過比較每個化合物的峰面積與內標物的峰面積來計算樣品中揮發性化合物的濃度。

OAV為某化合物質量濃度與該物質嗅覺閾值的比值,按公式(2)計算:

(2)

式中:Ci,某個組分的質量濃度,μg/L;Ti,該組分的氣味閾值,μg/L。

1.2.3 GC-O-MS解析

參考ZHANG等[13]的方法,由6名食品專業相關人員記錄嗅聞口流出的香氣物質強度和時間,并準確對香氣屬性進行描述。其中香氣強度分為4個等級,0表示未聞到,1表示輕微,2表示中度,3表示強度。

1.2.4 感官評定

感官分析在感官分析室中進行,室溫為(25±1) ℃。挑選10位品評員(食品專業學生)進行6周共3輪的感官訓練。第1輪訓練中,品評員需要對風味標準品進行聞香并熟悉其香氣特征;第2輪訓練中,品評員以酸筍風味為基礎,對廣西酸筍樣品多次嗅聞并進行香氣描述詞的收集,最終經過討論結合相關文獻篩選出重要的香氣描述詞;第3輪訓練中,針對篩選出來的香氣描述詞配制不用的參比樣進行香氣強度訓練,對品評員的香氣強度打分進行矯正。評定方法為十點制感官評定法,采用以下標準:0～10表示香氣強度逐漸增強,0表示香氣未被察覺,10表示氣味最強。所有樣品均隨機擺放,每個樣品重復2次。

1.3 數據分析

采用Excel 2016制作風味輪廓差異圖;采用SPSS 26.0軟件對感官數據進行方差分析,P<0.05認為存在顯著性差異;采用SIMCA 14.1進行雙向正交偏最小二乘(two-way orthogronal partial least square,O2PLS)分析;采用R語言繪制酸筍感官屬性與關鍵香氣化合物相關性熱圖。

2 結果與分析

2.1 酸筍風味輪廓差異分析

為解析柳州地區酸筍在風味結構上的整體特征,根據感官評定數據構建酸筍感官風味輪廓圖。如圖1所示,從整體風味輪廓來看,酸筍酒味、霉味、腐臭味極其弱,發酵香味、刺激性氣味、酸味及酸臭味較強,共同形成柳州酸筍整體風味特征。其中,LZ2發酵香味、刺激性氣味及酸味較強,整體喜好度最好。因此,借助GC-O進一步對LZ2的關鍵風味成分進行解析。

圖1 柳州酸筍風味輪廓分析

2.2 酸筍中揮發性成分鑒定和定量

由表1可知,從酸筍中經SPME-GC-MS共定性定量檢測出66種主要的揮發性風味成分。揮發性化合物含量從高到低依次是酚類(6種),酸類(3種),醇類(19種),醛類(15種),脂類(6種),其他類化合物(13種),酮類(2種),萜烯類(2種)。揮發性成分總含量為(2 395.15±16.18)～(3 218.22±27.65) mg/kg。柳州不同地區酸筍中各類化合物相對含量統計結果如圖2所示, 酚類[(1 750.71±5.72)～(2 049.10±52.29) mg/kg)]占62.93%～73.09%、酸類[(240.49±12.46)～(535.67±6.29) mg/kg]占10.04%～19.54%、醇類[(225.00±5.93)～(518.93±19.97) mg/kg]占8.21%～ 17.36%、醛類(30.31～195.35 mg/kg)占1.01%～6.07%,這4類化合物在酸筍中含量較高且閾值較低,是酸筍中主要風味化合物。值得注意的是,5份酸筍樣品中,對甲苯酚含量最高[(1 597.56±6.27)～(1 866.97±30.01) mg/kg],可能是酸筍中最關鍵的風味成分。

表1 酸筍主要揮發性風味化合物的定性定量結果

圖3 酸筍感官屬性與關鍵香氣化合物相關性熱圖

2.3 酸筍中關鍵香氣化合物分析

GC-O是確定食品基質中香氣化合物的有效工具,LZ2樣品 GC-O分析檢出的風味化合物香氣強度值(aroma index, AI)如表3所示。但在GC-O分析中,化合物被分離和濃縮,并不能準確說明單個物質對整個香氣輪廓的貢獻度。而OAV是化合物濃度與其閾值的比值,表征了單一化合物對整體香氣的貢獻,其中OAV>10的香氣物質被認為對酸筍的香氣有重大貢獻,重要風味化合物計算出的OAV如表2所示。本研究對整體喜好度最高,風味最為濃郁的LZ2進行GC-O分析,同時結合OAV分析鑒定了酸筍中重要香氣化合物。

表2 重要風味化合物的 OAV

表3 LZ2樣品中檢測到不同風味化合物的香氣強度值

酚類化合物是酸筍中最重要的一類香氣活性化合物。GC-MS共檢出6種酚類物質,在酸筍中含量高達62.93%～73.09%。GC-O可檢測到的酚類共5種,這類物質AI為25.8%,是貢獻香氣最大的物質類群。其中對甲苯酚(103 721>OAV>88 753,AI=3)OAV和AI最高,是酸筍中最關鍵的香氣成分之一,這與FU等[14]在臺灣酸筍中的報道一致。對甲基愈創木酚(煙熏,8 583>OAV>2 931,AI=2)和4-乙基愈創木酚(煙熏,1 749>OAV>466,AI=1.8)AI值較大,且具有高OAV,對酸筍香氣貢獻較大。對甲基愈創木酚和對乙基愈創木酚多見于發酵豆制品,具有煙熏氣味,是郫縣豆瓣醬、傳統發酵醬油中特征風味物質[15-16]。4-乙基苯酚(酒,794>OAV>255,AI=0.8)OAV較高,僅感知到較低的AI值,苯酚(難聞,12>OAV>1,AI=1.8)雖具有較低OAV,但AI值較高。這可能由于閾值來自于文獻,與本實驗實際情況有差別所致。通過GC-O結合OAV可推斷4-乙基苯酚和苯酚對酸筍香氣也有一定貢獻。

酸類化合物主要由微生物利用淀粉、脂肪、蛋白質等有機物發生生化反應生成[5]。GC-O解析檢測到乙酸(酸,AI=3)香氣強度最大,對酸筍香氣有突出貢獻。乙酸、3-甲基丁酸和4-甲基戊酸可能以協同作用的方式形成郫縣豆瓣醬中典型酸味[15]。本研究發現丙酸和辛酸以較高含量存在于酸筍,雖不能被嗅聞到,也可能會同乙酸以協同作用的方式形成酸筍中典型酸味。

醇類化合物在發酵食品中主要通過酵母發酵代謝、蛋白質分解等生成。GC-MS可檢測到19種醇類物質,是酸筍中種類最多的物質。GC-O可檢測到的醇類有7種,其中1-辛烯-3-醇(蘑菇,AI=2)和1-壬醇(玫瑰,AI=1.2)是醇類化合物中OAV最大的2種化合物,所屬呈香屬性可增強酸筍發酵香味。據報道,這2種醇對柱候醬、黃酒等發酵食品香氣也有一定貢獻[17-18]。苯乙醇(脂香,18>OAV>5)OAV雖較低,但AI值高(1.6),也發揮重要助香作用。其次,3-辛醇(蘑菇,AI=1)、L-芳樟醇(鈴蘭,AI=1)和正辛醇(柑橘=1.2)可被嗅聞到較高AI,且OAV>10,對整體風味形成具有一定貢獻。乙醇具有較低的AI值(酒味,AI=0.2)和OAV,對整體風味貢獻性小。

醛類化合物大多由發酵過程中放熱引起不飽和脂肪酸的碳鏈氧化或者脫羧基而生成,容易被還原成醇類物質,雖在酸筍中含量不高,但此類物質閾值低[12]。GC-O-MS可檢測到的醛類有5種,其中AI值較大的有反-2-辛烯醛(腐敗,AI=2)、反-2-壬烯醛(腐敗,AI=1.8)和壬醛(烤香,AI=1.6),同時,反-2-辛烯醛(6 787>OAV>1 628)、反-2-壬烯醛(82 426>OAV>0)和壬醛(4 729>OAV>258)具有高OAV,對酸筍“臭味”的形成貢獻較大。這3種醛類物質也被鑒定為熱鴨蛋凝膠中關鍵香氣物質[19],反-2-辛烯醛、壬醛在肉制品及傳統發酵豆制品中也發揮關鍵香氣作用[12, 17]。正己醛(青草,AI=1.2)和庚醛(花,AI=1)能被嗅聞到,且OAV均大于10,對酸筍氣味的形成也具有一定貢獻。

酯類物質主要由微生物在發酵過程中經?；o酶A和醇乙酰轉移酶的共同作用下代謝而成,以及在脂肪酶催化作用下由酸與醇反應而生成[20]。GC-O解析檢測到2種酯類物質,乙酸乙酯(果香,AI=0.6)和水楊酸甲酯(冬青油香氣,AI=1.8),其OAV均大于10,是酸筍中主要呈香酯類化合物。乙酸乙酯是白酒中常見的主體香氣物質,如在蘭陵美酒,清香型白酒等均有報道[5, 21]。由圖2可知,酯類化合物在酸筍中占比較小,此類化合物主要呈酒香和果香。因此,酯類化合物在酸筍中主要是減少刺激氣味、助香及緩沖平衡的輔助作用,同時還具有提高健康成分含量的作用。

其他風味化合物主要包括甲苯、乙苯、萘、2-戊基呋喃及對羥基芐基乙基醚。GC-O解析僅檢測到萘(焦油,38>OAV>20,AI=1.5)具有較高AI值,對酸筍風味形成具有一定貢獻。酮類化合物是脂肪氧化和降解的產物之一,風味獨特,主要帶有水果香、花香及霉腐味[22]。酸筍中酮類物質相對較少,1-辛烯-3-酮(蘑菇,AI=2.6,9 817>OAV>1 398)AI值和OAV較高,是酸筍中重要的酮類香氣化合物。

綜上所述,GC-O-MS結合OAV法確定酸筍中重要揮發性成分有:1-辛烯-3-醇、乙酸、對甲苯酚、反-2-壬烯醛、壬醛、苯乙醇,這與GUO等[23]的研究基本一致。此外,本研究還發現乙酸乙酯、水楊酸甲酯、L-芳樟醇、正辛醇、1-壬醇、3-辛醇、4-乙基愈創木酚、對甲基愈創木酚、苯酚、反-2-辛烯醛、正己醛、庚醛、1-辛烯-3-酮、萘也是酸筍重要風味組成成分。根據AI>1.5及OAV>10可進一步確定酸筍中關鍵香氣成分為水楊酸甲酯、反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛、壬醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、乙酸、對甲苯酚、對甲基愈創木酚、對乙基愈創木酚和萘。FU等[14]經GC-O-MS對臺灣酸筍進行解析后,推測其特征風味是由對甲苯酚和乙酸協同產生。本研究發現對甲苯酚(AI=3)和乙酸(AI=3)含量及AI值均高于其他風味組分,因此,對甲苯酚和乙酸亦是廣西酸筍香氣貢獻最大的6個成分。

2.4 感官屬性和重要香氣化合物的相關性分析

為探究酸筍感官屬性與香氣化合物之間潛在關聯,建立O2PLS模型,分析過程中X代表重要風味化合物;Y代表感官屬性,其相關性系數矩陣由R進行可視化。通過分析酸筍香氣屬性與香氣化合物之間的關系,發現酸臭味主要與對甲苯酚(F4)、苯乙醇(C19)的濃度呈較好的相關性。刺激性氣味及酸味與對乙基愈創木酚(F3)、3-辛醇(C9)具有較好的相關性。酸味屬性與乙酸相關性未體現出來,可能是因為酸筍中乙酸主要形成酸筍主體風味,而對酸味差異性貢獻較小。發酵香味與3-辛醇(C9)、壬醛(Q4)、反-2-辛烯醛(Q5)、1-辛烯-3-醇(C10)、L-芳樟醇(C12)及苯酚(F2)呈正相關。因此,可進一步推斷醇和醛在酸筍中發揮著重要的助香作用。酒味與乙酸乙酯(Z1)、水楊酸甲酯(Z4)、萘(B10)表現出較好相關性。腐臭味與對甲基愈創木酚(F1)及萘(B10)有一定相關性。

3 結論

本論文以柳州5個地區酸筍為研究對象,基于感官定量描述對酸筍風味特征進行解析,發現酸筍主要風味屬性為發酵香味、刺激性氣味、酸味及酸臭味。此外,HS-SPME-GC-MS共定性定量檢測出66種主要的揮發性風味成分。醛類、酸類化合物及酚類化合物對酸筍特征風味的形成有重要作用。醇類、酯類及其他類化合物在酸筍中主要起到助香,增強酸筍風味多樣性的作用。GC-O-MS結合OAV篩選結果表明酸筍中重要揮發性成分為水楊酸甲酯、反-2-辛烯醛、反-2-壬烯醛、壬醛、1-辛烯-3-酮、1-辛烯-3-醇、苯乙醇、乙酸、對甲苯酚、對甲基愈創木酚、對乙基愈創木酚和萘。O2PLS模型進一步分析酸筍感官特性與GC-O檢出的香氣化合物之間的關系。結果表明,酸筍主要香氣屬性酸臭味主要與對甲苯酚、苯乙醇的濃度呈較好的相關性。酸味及刺激性氣味與對乙基愈創木酚、3-辛醇具有較好的相關性。而發酵香味與3-辛醇、壬醛、反-2-辛烯醛、1-辛烯-3醇、L-芳樟醇及苯酚相關性較好。本研究結果全面解析了酸筍中呈味氨基酸及關鍵香氣化合物,將為酸筍風味品質控制及提升奠定理論指導和參考價值。